Задержка интрамиокарда Доставка стволовых клеток после травмы ишемии реперфузии в модели Murine

Резюме

Стволовые клетки постоянно расследуются как потенциальные методы лечения для людей с повреждением миокарда, однако, их снижение жизнеспособности и удержания в травмированных тканях может повлиять на их долгосрочную эффективность. В этой рукописи мы описываем альтернативный метод доставки стволовых клеток в модели мурина травмы ишемии реперфузии.

Аннотация

Существует значительный интерес к использованию стволовых клеток (СС) для восстановления сердечной функции у лиц с травмами миокарда. Чаще всего, сердечной терапии стволовыми клетками изучается путем доставки SCs одновременно с индукцией травмы миокарда. Однако этот подход представляет собой два существенных ограничения: ранняя враждебная провоспалительные ишемические условия могут повлиять на выживание пересаженных ЦП, и он не представляет собой сценарий инфаркта подостра, при котором, скорее всего, будут использоваться ЦП. Здесь мы описываем две части серии хирургических процедур для индукции ишемии-реперфузии травмы и доставки мезенхимальных стволовых клеток (MSCs). Этот метод введения стволовых клеток может позволить для более длительной жизнеспособности и удержания вокруг поврежденных тканей, минуя первоначальный иммунный ответ. Модель травмы ишемии реперфузии была вызвана у мышей сопровождается доставкой мезенхимальных стволовых клеток (3,0 х^{10 5}), стабилически выражая репортер гена светлячок люцифераза под constitutively выраженный промоутер CMV, внутримойокардиально 7 дней спустя. Эти животные были изображены с помощью ультразвуковой и биолюминесцентной визуализации для подтверждения травмы и инъекции клеток, соответственно. Важно отметить, что при выполнении этого двух процедурного подхода к доставке SC не было дополнительной скорости осложнений. Этот метод введения стволовых клеток, коллективно с использованием самых известных генов репортера, может позволить in vivo исследование жизнеспособности и удержания пересаженных SCs в ситуации хронической ишемии обычно видели клинически, а также в обход первоначального провоспалительный ответ. Таким образом, мы установили протокол для задержки доставки стволовых клеток в миокард, который может быть использован в качестве потенциального нового подхода в содействии регенерации поврежденной ткани.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания остаются наиболее распространенной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Сердечные ишемические события, как было установлено, наносят ущерб общей функции миокарда и окружающих клеток¹. Только ̴0,45-1,0% кардиомиоцитов будет регенерировать каждый год после повреждения миокарда^{происходит 2}. Несмотря на растущий спрос и присущий акцент на разработке методов лечения, терапии помощи в регенерации поврежденных тканей было трудно установить и по-прежнему^{требуют дальнейшей оптимизации 3,4,5}. Терапия стволовыми клетками была введена в качестве альтернативного пути для омоложения поврежденных тканей после ишемического события; однако, выдвижение этих терапий было оспорено лимитированная выживаемость и хранение клеток к поврежденной зоне^6.

Микрооквидение сердца после ишемического события можно охарактеризовать как гипоксическое, прооксидантное и провоспалительные, представляя враждебные условия для терапевтических стволовых клеток, чтобы приспособиться к^{выживанию 7,8}. Как иммунный ответ срабатывает после травмы, наивные лимфоциты, макрофаги, нейтрофилов и тучных клеток пытаются восстановить повреждения путем удаления умирающих клеток и модуляции процесса^{для ткани ремоделирования 9,10,11}. В течение первых 3 дней после ишемии, воспаление находится на пике с выпуском провоспалительных цитокинов с большим количеством нейтрофилов и моноцитов^{в области 10,12}. После 7 дней, большая часть воспаления утихла, и переход к репаративным клеткам начинается, продолжая до тех пор, пока ремоделирование каскад завершен, примерно 14 дней у^{мышей 13}. Наш хирургический метод является потенциальным альтернативным подходом к внедрению биопрепаратов в миокард, чтобы обойти пик врожденного иммунного ответа после травмы ишемии реперфузии. В то же время, это позволит для изучения любых методов лечения в состоянии подострый / хронической ишемии, где могут быть различные переменные для рассмотрения по сравнению с острым инфарктом миокарда.

протокол

Эксперименты проводились на самок мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель и 20-25 г массы тела. Все процедуры животных соответствовали стандартам, заявленным в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных ресурсов животных, Национальная академия наук, Bethesda, MD, США) и были одобрены Клиникой Майо Медицинского колледжа институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Подготовка и инкубация

1. Автоклав всех хирургических инструментов перед операцией. Если несколько операций должны быть выполнены в один сеанс, очистить инструменты после каждого животного и повторно стерилизовать с помощью горячего стерилизатора бисера.
2. Анестезировать мышей с 3,5-4% изофлюран на 1 л / мин O₂ в индукционной камере.
3. Администрирование бупренорфина SR 1 мг/кг (обезболивающее) подкожно, взвешивать животное, и ввести вес в вентилятор.
4. Бритье левой стороны грудной клетки от грудины до уровня плеча и нанесите крем для удаления лишнего меха.
5. При процедуре ишемии реперфузии сохраняем положительное давление конца срока действия (PEEP) на аппарате искусственной вентиляции легких при 2 смH₂O. Для задержки инъекции клеток процедура изменения PEEP до 3 смH_{2 O, чтобы}предотвратить коллапс легких.
6. Обижайте животное с помощью эндотрахеальной трубки 20 G, перенесите на контролируемую грелку для поддержания температуры тела 35-37 градусов по Цельсию.
7. Поместите мышь на аппарат искусственной вентиляции легких в боковой лежачих местах с черепным концом слева и хвостовой конец справа.
8. Поддерживайте анестезию на уровне 2-2,5% изофлюрана при 1 л/мин O₂ на оставшуюся часть процедуры.
9. Скраб хирургической области чередующихся между povidone йода и алкоголя тампоны три раза и применять офтальмологические мази для обоих глаз.

2. Ишемия травмы реперфузии

1. Используя #10 скальпель лезвия сделать вертикальный разрез 2,5 мм справа от левого соска в поле зрения.
2. С помощью ножниц прорезать поверхностные слои мышц до межреберных мышц и ребер видны.
3. При подъеме ребер и окружающих тканей, прорезать межреберного пространства между 4-м и 5-м ребра, а затем вставить вярегатор век в открытое пространство.
4. Убирайте перикард с помощью изогнутых типсов, перемещая легкие вверх и вне поле зрения.
5. Визуализуйте артерию LAD и, используя 9-0 нейлоновый шов, пройдите через миокард под артерией 2,5 мм дистал к левой орке и завяжут свободный квадратный узел.
6. Вырезать 1 см полиэтиленовых труб и поместить его в свободный узел.
7. Закрепче шв вокруг трубки, подтвердите ишемию, затем отпустите через 35 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите ишемию бледной и желудочковой аритмией.
8. После выпуска перевязки и удаления труб, ждать 5 минут, чтобы подтвердить reperfusion миокарда.
9. Поместите 24 Г. И.В. катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия.
10. Закройте межреберный разрез с 6-0 абсорбируемым швом в простом прерванной картине.
11. Закройте мышечный слой 6-0 абсорбируемым швом в непрерывном узоре шва.
12. После закрытия поверхностного мышечного слоя, удалить грудную трубку при снятии воздуха из грудной полости с помощью 1 мл трубчатого шприца.
13. Закройте разрез кожи 6-0 абсорбируемым швом в непрерывном горизонтальном рисунке матраса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейлоновые швы и прерывистый узор шва также могут быть использованы для слоя кожи.
14. Администрирование 1,5 мл теплого солевого подкожно и применять тройной антибиотик мази к месту разреза для предотвращения инфекции.
15. Выключите изофлюран и дайте животному дышать через аппарат искусственной вентиляции легких на 100% O_2, пока он не сможет дышать непрерывно без посторонней помощи.
16. Перенесите мышь в клетку без постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями (бумажное полотенце или драпировка) на теплую площадку с температурой 35-37 градусов по Цельсию до полного выздоровления.

3. Мышь мезенхимальной доставки стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм мышей, используемых для процедуры инбредной линии и считаются генетически идентичными. Мезенхимальные стволовые клетки были получены от животных того же штамма и, по протоколу дизайн, иммуносупрессия не была индуцирована¹.

1. Завершите подготовительные и итубационые шаги, как это было сделано ранее для первой процедуры.
2. Снимите шов с слоя кожи с помощью ножниц и хлипок.
3. С помощью #10 скальпеля сделайте разрез в том же месте, что и предыдущая операция.
4. Продолжайте использовать скальпель, чтобы прорезать рубцовую ткань до тех пор, пока мышечный слой шва не будет виден
5. С помощью ножниц и хлипок снимите шов и разрежьте мышечный слой открытым.
6. Визуализу и удалить швы, держа ребра вместе и продолжать резки через межреберной мышцы от предыдущего разреза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие, возможно, прилипли к грудной стенке, если это произойдет, использовать тупые или изогнутые типсы, чтобы тщательно отделить и освободить их.
7. Поместите втягиватель век в межреберное пространство и найдите область предыдущей перевязки.
8. Загрузите мезенхимальные стволовые клетки (3,0 х^{10 5),}подвешенные в 20 МКЛ PBS, в шприц инсулина 30 Г, согните иглу немного по мере необходимости для правильного угла для инъекций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мезенхимальные стволовые клетки (MSCs) были выделены из жировой ткани 4-6-недельных мышей C56BL/6. Ранние клетки прохода (p3) были трансдуцированы с вектором, выражаю выражал ген светлячка люциферазы под протором CMV, чтобы позволить мониторинг жизнеспособности клеток in vivo. Adipose полученных мыши MSC характеризовались цитометрии потока и клетки были положительными для CD44, CD29, CD90 и CD105, но отрицательный для гематопоэтического маркера CD45¹⁴. До инъекции, MSCs были культурны, по крайней мере один проход, чтобы избежать потери клеток от процесса оттаивания.
9. Двигаясь в направлении от вершины к основанию сердца вставьте шприц в пери-инфарктной области до открытия иглы полностью внутри миокарда.
10. Оказавшись внутри медленно вводить клетки в миокард, подождите 3 с, а затем удалить иглу.
11. Внимательно наблюдайте за сердцем в течение 3 минут, чтобы убедиться в том, что нет аномальных реакций на клетки, такие как фибрилляция желудочков.
12. Поместите 24 G IV катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия.
13. Закройте межреберные, мышечные и кожные слои и удалите грудную трубку тем же методом, что и первая процедура.
14. Администрирование 1,5 мл теплого солевого подкожно и применять тройной антибиотик мази к месту разреза для предотвращения инфекции.
15. Выключите изофлюран и дайте животному дышать через вентилятор на 100% O_2, пока он не сможет дышать непрерывно без посторонней помощи.
16. Перенесите мышь в клетку без постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями (бумажное полотенце или драпировка) на теплую площадку с температурой 35-37 градусов по Цельсию до полного выздоровления.

4. Послеоперационный уход после обеих процедур

1. Наблюдайте за животным непрерывно до тех пор, пока не будет установлено спонтанное дыхание, sternal recumbency и нормальное движение.
2. Продолжайте наблюдение каждые 15-30 минут, по крайней мере 3 ч в день операции.
3. Проверьте мышей на рану dehiscence или ненормальные боли один раз в день в течение 5 дней, а затем 2-3 раза в неделю.
4. Если животное проявляет признаки боли (т.е. арочные назад, минимальное движение, гримасничая, или грязный мех) после 72 ч послеоперационного, обеспечить дополнительную дозу бупренорфина SR анальгетики.

Результаты

Ишемия реперфузия травмы была вызвана у мышей на 0 день, а затем послеоперационной эхокардиограммы и электрокардиограммы в день, предшествующий имплантации стволовых клеток. Ультразвуковой и электрокардиограммный анализ подтвердили инфаркт и снижение желудочковой контрактильной фу...

Обсуждение

Более 85 миллионов человек во всем мире страдают от сердечно-сосудистых^{заболеваний 3}. Высокая распространенность этих ишемических явлений требует дальнейшего развития и расширения альтернативных методов лечения для содействия регенерации поврежденных тканей. Традицион?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific