JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе был описан метод добычи генов и анализа последовательностей пуриновой нуклеозидазы (PN, EC:3.2.2.1) на основе RNA-Seq. Анализ «ПротПром» был применен для выявления уникальных вторичных и третичных структур ПН. Кроме того, ген PN был клонирован из транскриптома для проверки надежности результатов RNA-Seq.

Аннотация

Грибок гусеницы (Ophiocordyceps sinensis) является одним из самых ценных грибов традиционной китайской медицины (ТКМ) и содержит множество активных ингредиентов, таких как аденозин. Аденозин считается биологически эффективным ингредиентом, обладающим разнообразной противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью. С целью дальнейшего выяснения механизма пуриновой нуклеозидазы (ПН) в биосинтезе аденозина был успешно добыт и дополнительно проанализирован ген, кодирующий ПН, на основе базы данных RNA-Seq гусеничного гриба. Полноразмерная кДНК PN составляла 855.н., которая кодировала 284 аминокислоты. Анализ BLAST показал наибольшую гомологию 85,06% с нуклеозидгидролазой в NCBI. Анализ «ПротПрома» показал, что относительная молекулярная масса составляет 30,69 кДа, а изоэлектрическая точка — 11,55. Вторичная структура PN была предсказана с помощью Predict Protein; Результаты показали, что на долю структуры альфа-спирали приходится 28,17%, на структуру цепи — 11,97%, а на петлевую структуру — 59,86%. Кроме того, ген PN был далее клонирован из транскриптома и обнаружен с помощью электрофореза в агарозном геле для верификации. Данное исследование дает более достаточную научную основу и новые идеи для генетической регуляции биосинтеза аденозина в грибковой ТКМП.

Введение

Грибы Традиционная китайская медицина (ТКМ) обладает богатыми ресурсами видов 1,2. Гусеничный гриб (Ophiocordyceps sinensis) является известным грибом ТКМ и рассматривается как источник инновационных препаратов 3,4. Гусеничный гриб представляет собой комбинированную смесь червей и грибов, которая встречается на Тибетском плато на юго-западе Китая, где Hirsutella sinensis паразитирует на теле гусеницы5. В настоящее время H. sinensis считается единственным анаморфом гусеничного гриба в соответствии с молекулярными и морфологическими биологическими данными 6,7, и он имеет меньшую ассоциированную токсичность и аналогичную клиническую эффективность по сравнению с диким гусеничным грибом8. Было выявлено, что H. sinensis обладает различными биологически эффективными ингредиентами, такими как нуклеозиды, полисахариды и эргостеролы, с обширными фармакологическими эффектами, такими как восстановление повреждения печени 9,10,11. Аденозин является типичным действующим веществом, выделенным из гусениц, и представляет собой разновидность пуринового алкалоида12. Аденозин обладает разнообразной биологической активностью: противоопухолевой, антибактериальной и иммуномодулирующей активностями13,14. К сожалению, механизм биосинтеза аденозина, а также ключевые гены, участвующие в нем, до сих пор неясны15,16.

Аденозин проявляет противоопухолевое действие в основном за счет иммуносупрессивного действия в микроокружении опухоли17. Сообщалось, что аденозин проявляет иммуносупрессивные функции, что имеет решающее значение для инициирования восстановления тканей после травмы и защиты тканей от чрезмерного воспаления18,19. Кроме того, было продемонстрировано, что аденозин-опосредованное подавление иммунитета может серьезно ухудшить иммунонадзор за раком, а такжеспособствовать росту опухоли. Таким образом, актуальным является изучение механизма биосинтеза аденозина для его широкого применения в противоопухолевых препаратах.

Сообщалось, что полное представление об экспрессируемых генах и уровнях их экспрессии может быть систематически получено с помощью секвенирования транскриптома21 следующего поколения. Кроме того, секвенирование и анализ транскриптома были применены для прогнозирования генов, участвующих в биосинтетическом пути активных ингредиентов, и дальнейшего исследования взаимодействия различных биосинтетических путей22. Пуриновая нуклеозидаза (PN, EC 3.2.2.1) — класс нуклеозидаз с субстратной специфичностью для пуриновых нуклеозидов, которые могут гидролизовать гликозидные связи пуриновых нуклеозидов в сахара и основания23. Обычно он играет важную роль в биосинтезе аденозина. Сообщалось, что был предсказан путь биосинтеза аденозина в грибковой ТКМП; Количественная ПЦР и экспрессия генов показали, что повышенное накопление аденозина является результатом подавления гена PN, что указывает на то, что ген PN может играть важную роль в биосинтезе аденозина15. Поэтому механизм ПН в биосинтезе аденозина необходимо срочно выяснить. Тем не менее, информация о последовательностях и белковая структура PN, а также других ключевых генов, участвующих в биосинтезе аденозина грибковой ТКМП, не были дополнительно изучены.

В этом исследовании новая последовательность гена PN была получена из данных RNA-Seq гусеницы гриба и проверена с помощью клонирования генов. Кроме того, были всесторонне проанализированы молекулярные характеристики и белковая структура ПН, что может дать новые направления и идеи для генной регуляции биосинтеза аденозина.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм анаморфы гусеничного гриба (H. sinensis) был депонирован в нашей лаборатории. Кишечная палочка DH5 были сохранены в больнице Шэньчжэня Пекинского университета китайской медицины.

1. Подготовка к секвенированию РНК

  1. Заготовка мицелия
    1. Приготовьте среду для брожения H. sinensis: порошкообразную кукурузную муку (1%), куколок тутового шелкопряда (1,5%), экстракт дрожжей (0,5%), триптон (1%), глюкозу (1,5%), отруби (1,5%), декстрин (0,5%), KH2PO4 (0,02%) и MgSO4 (0,01%).
    2. Приготовьте посев 10% средой для брожения для масштабирования культуры (добавьте 10 мл среды на 100 мл). Проводите ферментацию под водой при температуре 16 °C на роторном вибростенде при 150 об/мин в течение 10 дней.
    3. Бесполым путем размножают и заготавливают мицелий анаморфы гусеницы гриба в течение 10 дней. Перебродившую среду центрифугируют и после центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Приостановите мицелий, добавив 100 мл ультрачистой воды в течение 3 раз, и удалите надосадочную жидкость центрифугированием. Очищенный мицелий измельчить в порошок с помощью жидкого азота.
  2. РНК-секвенирование
    1. Извлечь общую РНК анаморфы гусеничного гриба в соответствии с протоколами производителя (Таблица материалов) и далее обработать образец РНКазной ДНКазой I (Таблица материалов).
    2. Выделите мРНК из систем выделения мРНК PolyATtract и изолируйте поли(А)мРНК с помощью гранул с олиго(dT) в соответствии с протоколами производителя (Таблица материалов).
    3. Возьмем короткие фрагменты в качестве шаблонов для синтеза кДНК первой цепи случайными гексамерами-праймерами в соответствии с протоколами производителя (Таблица материалов). Проводят синтез кДНК второй цепи в соответствии с протоколами производителя.
    4. Затем сгенерируйте библиотеки секвенирования с помощью набора Ultra RNA Library Prep Kit в соответствии с протоколами производителя (Table of Materials).
    5. Очистите короткие фрагменты с помощью набора для экстракции ПЦР в соответствии с протоколами производителя (Таблица материалов) и разрешите их с помощью буфера EB соответственно.
    6. Соедините короткие фрагменты (порог 300.о.) с помощью адаптеров секвенирования в соответствии с результатом электрофореза в агарозном геле.
    7. Впоследствии проводят амплификацию с помощью ПЦР с помощью шаблонов, выбранных из подходящих фрагментов.
    8. Секвенирование библиотеки с помощью Illumina HiSeq 4000 с парным секвенированием в соответствии с протоколами производителя. Фильтруйте «грязные» необработанные чтения из необработанных данных последовательности для получения чистых данных. Примите сборку denovo , чтобы получить Unigenes с наименьшим количеством N, которое не может быть расширено ни на одном из концов.
    9. Выравнивание последовательностей Unigene с помощью blastx с базами данных белков, такими как nr, Swiss-Prot, KEGG и COG (e-value < 0,00001). Извлекать белки с наибольшим сходством последовательностей с данными Unigenes вместе с их белковыми функциональными аннотациями. Подведите итоги RNA-Seq (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На вышеуказанных этапах использовались коммерческие наборы, и все операции выполнялись в соответствии с протоколом производителя.

2. Добыча генов пуриновых нуклеозидаз

  1. Загрузите файлы результатов RNA-Seq на компьютер. Найдите файлы результатов аннотаций собранных Unigenes из результатов RNA-Seq.
    Примечание: Считывание с парными концами снова использовалось для заполнения разрывов скаффолдов с целью получения последовательностей с наименьшим Ns, которые не могут быть продлены ни на одном из концов. Такие последовательности были определены как унигены. Аннотация Unigene предоставляет информацию о экспрессии и функциональной аннотации Unigene.
  2. Откройте путь к файлам аннотаций и введите карту 00230 в строке поиска; затем выполните поиск метаболизма пуринов (map00230) в классификации файлов аннотаций KEGG.
  3. Отметьте EC:3.2.2.1 (PN) красным цветом на аннотированной карте 00230 и укажите, что были собраны Unigenes, которые были аннотированы в PN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три Unigene (Unigene10777, Unigene14697 и Unigene17827) были аннотированы в PN после нажатия на номер EC 3.2.2.1 и показаны на аннотированной карте 00230.
  4. Нажмите на номер EC 3.2.2.1 и отобразите аннотированную информацию Unigenes.
  5. Откройте программу LTFViewer и импортируйте файл Unigene.fa с помощью сочетания клавиш Ctrl-O и отобразите информацию о последовательности собранных Unigene.
  6. Найдите информацию о последовательностях Unigene10777, Unigene14697 и Unigene17827 с помощью сочетания клавиш Ctrl-F .
  7. Загрузите информацию о последовательностях Unigene10777, Unigene14697 и Unigene17827 с помощью сочетаний клавиш Ctrl-C и Ctrl-V.
  8. Исключите Unigene10777 и Unigene17827 с помощью чрезмерно коротких последовательностей открытой рамки считывания (ORF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основная информация о последовательности отображалась в программном обеспечении LTFViewer.
  9. Выберите Unigene14697 (размер 1,705.о., разрыв 0 0%) с подходящей длиной ОРФ для дальнейшего изучения.

3. Биоинформатический анализ

  1. Анализ ORF гена PN с помощью ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Вставьте последовательность в коробку. Выберите следующие параметры, минимальная длина ORF (nt): 75, генетический код: 1. стандартный, стартовый кодон ORF для использования: только ATG. Нажмите кнопку «Отправить », чтобы получить информацию ORF.
  2. Используйте инструмент ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) для вычисления теоретической молекулярной массы и изоэлектрической точки.
    1. Вставьте последовательность аминокислот (в виде однобуквенного кода) в поле и нажмите кнопку «Вычислить параметры », чтобы получить результаты.
  3. Используйте SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) для прогнозирования сигнальных пептидов.
    1. Введите последовательности белков в формате FASTA. Выберите следующие параметры: группа организмов: Eukarya, формат вывода: Long output. Нажмите на кнопку «Отправить », чтобы получить результаты.
  4. Используйте BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) для анализа гомологии белковых последовательностей.
    1. Нажмите на кнопку Protein Blast и введите последовательность в поле. Выберите следующие параметры, база данных: Non-redundant protein sequences (nr), алгоритм: blastp (protein-protein BLAST). Нажмите на кнопку Blast для получения результатов.
  5. Примените программу Clustal X (http://www.clustal.org/) для выравнивания кислотных последовательностей PN из разных грибов.
    1. Загрузите файл или вставьте последовательности в коробку. Установите параметры следующим образом, формат вывода: ClustalW с количеством символов. Нажмите на кнопку «Отправить », чтобы получить результаты. Clustal X может распознавать файлы только в формате FASTA, а путь к файлам может включать только английские имена.
  6. Используйте MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) для построения филогенетического дерева.
    1. Откройте программу и нажмите кнопку «Файл », чтобы загрузить последовательности. Выберите тип данных «Последовательности белков», нажмите кнопку «ОК », чтобы перейти к следующему шагу. Затем нажмите на кнопку «Филогенез» и выберите «Начальная тестовая филогения», а затем нажмите на «Дерево соседского соединения». Выберите параметры по умолчанию и нажмите кнопку «Вычислить », чтобы получить результаты.
  7. Примените InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) для определения каталитического домена PN.
    1. Введите последовательность в поле. Выберите параметры по умолчанию и нажмите кнопку «Поиск », чтобы получить результаты.
  8. Примените Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) онлайн, чтобы предсказать вторичную структуру белка.
    1. Введите аминокислотную последовательность (код из одной буквы) в поле, а затем нажмите на кнопку predictProtein для получения результатов.
  9. Примените онлайн-инструменты SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) для оценки трехмерной структуры PN24.
    1. Нажмите кнопку « Начать моделирование » и вставьте целевую последовательность в поле. Заполните название проекта и информацию об электронной почте и нажмите кнопку «Поиск шаблонов », чтобы получить результаты.

4. Клонирование генов и конструирование рекомбинантной плазмиды

  1. Проектные грунтовки, обратная грунтовка которых содержала сайт NotI, а прямая грунтовка имела сайт EcoRI.
  2. Покажите передний капсюль как: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), а обратный капсюль как: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') от Primer Express.
  3. Подготовьте праймеры, а также кДНК гусеничного гриба для клонирования гена PN . Проводят ПЦР следующим образом: предварительную денатурацию при 95 °C в течение 5 минут, денатурацию при 94 °C в течение 45 секунд, ренатурацию при 55 °C в течение 60 секунд, наращивание при 72 °C в течение 90 секунд, повторение в течение 35 циклов и наращивание при 72 °C в течение 10 минут.
  4. Получить фрагменты ПЦР и обнаружить их с помощью электрофореза в агарозном геле для верификации. Лигируйте фрагменты ПЦР с помощью pMD18-T. Проводите систему лигирования PMD18-T следующим образом: 1 мкл PMD18-T, 4 мкл раствора1 и 5 мкл гена мишени. Установите следующие условия: поддержание при 16 °C в течение 16 часов, инактивация при 65 °C в течение 15 минут.
  5. Перенесите рекомбинантные плазмиды в компетентные клетки E. coli JM109 в соответствии с руководством по эксплуатации25.
  6. Расщеплять рекомбинантные плазмиды pMD18-T/PN и вектор ppic9K с помощью EcoRI и NotI. Лигировать фрагменты после расщепления с помощью T4 DNA лигазы.
  7. Сконструируйте рекомбинантную плазмиду ppic9K/PN для дальнейшей гетерологичной экспрессии.

Результаты

Последовательность ORF гена PN имела длину 855.н., которая кодировала 284 аминокислоты с расчетной молекулярной массой 30,69 кДа и предсказанной изоэлектрической точкой 11,55, что указывает на то, что PN является щелочным белком. Применение SignalP4.0 Server было проведено для иден?...

Обсуждение

Здоровье человека сталкивается с рядом серьезных медицинских проблем, таких как опухолевые, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания26,27. ТКМ считается источником исследований и разработок в области инновационной медицин...

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (31871244, 81973733, 81803652), Фондом естественных наук провинции Гуандун (2019A1515011555, 2018A0303100007), Шэньчжэньским фондом здравоохранения и комиссией по планированию семьи (SZBC2018016), Специальным фондом экономического и технологического развития района Лунган города Шэньчжэнь (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Ссылки

  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806 (2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806 (2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168 (2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156 (2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106 (2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566 (2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2 (2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116 (2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99 (2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Ophiocordyceps sinensisCDNABLASTProtProm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены