Визуализация субклеточных структур в живых клетках сверхвысокого разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол для визуализации живых клеток сверхвысокого разрешения в интактной ткани. Мы стандартизировали условия для визуализации высокочувствительной популяции взрослых стволовых клеток в ее родной тканевой среде. Этот метод включает в себя балансировку временного и пространственного разрешения, чтобы обеспечить непосредственное наблюдение за биологическими явлениями в живой ткани.

Аннотация

Уже давно существует важный компромисс между пространственным и временным разрешением в изображениях. Визуализация за пределами дифракционного предела света традиционно ограничивалась использованием только на фиксированных образцах или живых клетках вне ткани, помеченной сильным флуоресцентным сигналом. Современные методы визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением требуют использования специальных флуоресцентных зондов, высокой освещенности, многократного получения изображений с обработкой после получения или часто комбинации этих процессов. Эти предпосылки значительно ограничивают биологические образцы и контексты, к которым может быть применен этот метод.

Здесь мы описываем метод выполнения флуоресцентной визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением (~ 140 нм XY) in situ. Этот метод также совместим с низкой интенсивностью флуоресцентной связи, например, EGFP или mCherry эндогенно помечены в низко экспрессированных генах. В качестве доказательства принципа мы использовали этот метод для визуализации нескольких субклеточных структур в яичках Drosophila. Во время подготовки ткани в рассеченном яичках сохраняется как клеточная структура, так и морфология ткани. Здесь мы используем этот метод для изображения динамики микротрубочек, взаимодействий между микротрубочками и ядерной мембраной, а также прикрепления микротрубочек к центромерам.

Этот метод требует специальных процедур по подготовке образцов, монтажу образцов и иммобилизации образцов. Кроме того, образцы должны поддерживаться в течение нескольких часов после рассечения без ущерба для клеточной функции и активности. Хотя мы оптимизировали условия для визуализации живого сверхвысокого разрешения, особенно в стволовых клетках зародышевой линии (GSC) и половых клетках-прародителях в рассеченной ткани яичка, этот метод широко применим к различным типам клеток. Способность наблюдать за клетками в их физиологических условиях без ущерба для пространственного или временного разрешения будет служить бесценным инструментом для исследователей, стремящихся решить важнейшие вопросы клеточной биологии.

Введение

Визуализация субклеточных структур и динамики белка в живых клетках с разрешением, выходящим за предел дифракционного предела света, обычно очень сложна^1-3. В то время как были разработаны многочисленные методы сверхвысокого разрешения, такие как стохастическая-оптическая-реконструкционная-микроскопия (STORM), фотоактивированная локализация-микроскопия (PALM) и стимуляция-эмиссия-истощение (STED)^4,5,6, осложнения в подготовке образцов, а также необходимость поддержания жизнеспособности и активности ex vivo ограничивают использование обычной микроскопии сверхвысокого разрешения для визуализации живых образцов. Обычная конфокальная микроскопия не может достичь пространственного разрешения выше ~ 230 нм XY-разрешения и часто недостаточна для наблюдения сложных клеточных подструктур^5,6. Однако недавняя разработка в конфокальной микроскопии, Airyscan super-resolution imaging, способна достигать примерно 140 нм (XY-разрешение)^7,8 и имеет относительно простую пробоподготовку, совместимую с живой визуализацией. Поскольку эта система обнаружения изображений требует длительного времени сбора, ее высокое пространственное разрешение происходит за счет временного разрешения^9. Поэтому необходим метод, гарантируя, что визуализация живых клеток расширена с высоким пространственным разрешением.

Здесь мы разработали метод наблюдения живых клеток в интактной ткани с оптимальным разрешением для расшифровки субклеточных структур с подробной пространственной информацией. Этот метод разработан таким образом, что образцы могут быть установлены стабильно в течение длительного периода времени (~ 10 ч) без перемещения или вырождения. Живые клеточные среды, используемые в этой технике, могут поддерживать клеточную функцию и избегать фотоотбеливания в течение 10 часов под микроскопом сверхвысокого разрешения. Наконец, этот протокол минимизирует большинство стрессов, вызванных постоянным освещением лазеров в течение длительных периодов времени, таких как гипоксия, изменения влажности и температуры, а также истощение питательных веществ.

Используя этот протокол для изображения стволовых клеток зародышевой линии (GSC) дрозофилы, мы смогли наблюдать, как асимметричная активность микротрубочек позволяет предпочтительно взаимодействовать с эпигенетически отличными сестринскими хроматидами^10,11,12,13. Эти типы клеточных событий очень динамичны и их очень трудно визуализировать в живых клетках с использованием других методов визуализации со сверхвысоким разрешением, таких как STORM, PALM или STED. Мы ожидаем, что этот метод станет очень полезным для клеточных биологов, поскольку они стремятся понять динамические субклеточные структуры живых клеток, проживающих в тканях. Существует множество областей, в которых этот метод может быть применен, например, изучение динамики белков; понимание движения клеток; и процессы отслеживания родословной и клеточной дифференцировки, среди других возможных применений.

протокол

1. Приготовление коктейля для визуализации живых клеток (живые клеточные среды)

1. Дополните среду Drosophila Schneider 15% фетальной бычим сывороткой (FBS) и 0,6x пенициллином / стрептомицином. Отрегулируйте pH примерно до 7,0.
2. Непосредственно перед использованием среды добавьте инсулин до конечной концентрации 200 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда имеет решающее значение для поддержания нормального деления клеток и развития яичка Drosophila во время покадровой визуализации^10,14.

2. Приготовление стеклянной чашки для культуры клеток

1. Используйте поли L-лизиновое покрытие стеклянной чашки для культуры клеток диаметром 35 мм для яичка Drosophila. Внутренний колодец блюда имеет стеклянное дно диаметром 23 мм и сторону с возвышением 1 мм(рисунок 1А-а).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите тарелку со стеклянным дном, которая обеспечивает более короткое рабочее расстояние, большую числовую диафрагму и более высокий объектив увеличения; эти функции имеют решающее значение для получения изображения со сверхвысоким разрешением.
2. Используйте диализную мембрану (MWCO: 12–14kD), которая обеспечивает газообмен. Разрежьте мембрану на мелкие кусочки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки мембраны должны быть меньше, чем площадь стекла тарелки, но достаточно большими, чтобы покрыть образец.
3. Замочите мембрану со 100 мкл живой клеточной среды в течение ~5 мин. Не используйте сухую мембрану на образце, так как это может повредить его. Мембрана помогает предотвратить гипоксический стресс.
4. Подготовьте 2-3 легких стеклянных или пластиковых кусочка для накладываем на мембрану, чтобы ткань не плавала. Для этого сначала берут наружное кольцо трубки центрифуги 50 мл и разрезают его на мелкие кусочки. Затем стерилизуйте кусочки 70% этанолом перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что образец остается на поверхности во время визуализации и не плавает, что имеет решающее значение для получения оптимальных результатов.
5. Приготовьте кольцо диаметром ~25 мм и поместите его на приподнятую сторону блюда. Положите на него крышку, чтобы создать две камеры. Нижняя камера будет содержать образец, в то время как верхняя камера будет служить камерой влажности, чтобы предотвратить высыхание образца.
   1. Чтобы сделать это кольцо, отрежьте наружное кольцо от 50 мл центрифужной трубки, что позволит ему надежно поместиться на приподнятой стороне 35-миллиметровой тарелки. Подобное кольцо может быть изготовлено другими способами, например, с помощью резиновой ленты или пластиковой закручивающейся стяжки, чтобы поместиться на приподнятой стороне тарелки, чтобы правильно удерживать крышку, не мешая образцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, особенно для образцов, чувствительных к стрессам, таким как гипоксические условия и изменения температуры и влажности.

3. Рассечение яичек от самцов мух и крепление

1. Возьмите ~ 10 молодых самцов мух (2-3 дня) и рассекните яички в среде живых клеток, чтобы получить ~ 10 пар взрослых яичек Drosophila.
   1. Рассекте мух под рассеченным микроскопом в диссекционной чашке с помощью тонких щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Drosophila melanogaster (плодовая муха) несет трансген UAS-α-Tubulin-GFP, приводимый в действие ранним драйвером зародышевых клеток nanos-Gal4.
   2. Генерируйте следующие штаммы Drosophila melanogaster с использованием технологии CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (метка C-терминала) и CENP-A-Dendra2-CENP-A [метка на внутреннем участке (между 118-м и 119-м кодоном)].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя для каждого эксперимента требуется только одно яиче отличного качества, установка достаточного количества тканей (15-20) или клеток гарантирует, что будет по крайней мере один здоровый образец с отличными флуоресцентными сигналами для покадровой визуализации.
2. Дважды вымойте яички в живых клеточных средах в тарелке для рассечения.
   1. Используйте пипетку для добавления носителя с последующим удалением носителя живых клеток в качестве шага промывки.
   2. Удалите лишнюю ткань с помощью щипцов. Любая дополнительная ткань будет мешать визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) для промывки, так как это может повлиять на динамику некоторых клеточных компонентов.
3. Добавьте в блюдо 100–150 мкл живой клеточной среды (приготовленной на этапе 2.1) и налейте ее на стеклянную поверхность с помощью наконечника пипетки. Распространение среды на поверхность позволит ткани правильно прилипнуть к блюду.
4. Переложите яички на блюдо с помощью мелких щипцов и поднесите их к центру блюда(рисунок 1А-б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переноса мусора, потому что это будет мешать визуализации и может снизить качество изображения.
5. Удалите излишки живых клеток (оставьте примерно 10 мкл среды), чтобы ткань сплющились и прилипли должным образом к блюду. Выполните этот шаг быстро, чтобы избежать высыхания образца.
6. Поместите предварительно влажную мембрану (подготовленную на этапах 2.2 и 2.3) поверх яичек(рис. 1А-с).
7. Поместите 2–3 небольших пластиковых веса (подготовленных на этапе 2.4) на мембрану так, чтобы образец не плавал, и быстро добавьте 100–150 мкл среды живых клеток(рисунок 1A-d).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрое и мягкое добавление среды гарантирует, что образец не высохнет и не будет смещен.
8. Поместите пластиковое кольцо (подготовленное на этапе 2.5) на приподнятую сторону блюда(рис. 1В-а).
9. Поместите крышку 22 мм x 22 мм поверх кольца(рисунок 1B-b). Это создает две камеры.
10. Возьмите кусок папиросной бумаги, смочите его водой, затем закрутите его и положите на крышку, чтобы создать влажную камеру(рисунок 1B-c). Закройте крышку чашки(рисунок 1B-d)и начните визуализацию живых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец светочувствительный, выполните раздел 3 в темноте.

4. Визуализация живых клеток стволовых клеток зародышевой линии (GSC) in situ

1. Поместите блюдо под микроскоп сверхвысокого разрешения и закрепите его сценическими зажимами.
   1. Откройте программное обеспечение для визуализации, включите проходящий свет и используйте объектив 63x, чтобы сфокусироваться на ткани яичка с помощью ручки фокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть трудности с поиском образца с объективом 63x, то сначала используйте объектив 40x или 20x, прежде чем переключаться на 63x.
   2. Включите лазеры, нажмите Liveи найдите GSC с оптимальным положением и состоянием. Избегайте яичек, которые имеют низкий флуоресцентный сигнал или имеют концентратор (нишу) вдали от поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В яичках дрозофилы ГСК прикреплены к концентратору.
2. Отрегулируйте фокусировку для GSC и определите правильные настройки для образца, включая мощность лазера, коэффициент усиления электрон-умножения (EM), усреднение и масштабирование для режима Airyscan. Используйте следующие настройки в качестве примера для яичек дрозофилы, экспрессирующих EGFP с тегами α-тубулин в половых клетках на ранней стадии.
   1. Установите размер кадра между 512 x 512 пикселями и 1024 x 1024 пикселями, щелкнув Frame Size (Размер кадра).
   2. Установите среднее значение кадра в 1 или 2, щелкнув Усреднение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение размера кадра (>1024 x 1024 пикселей) и выполнение большего усреднения (т. Е. Более 2) может привести к фотоотбеливанию или фототоксичности.
   3. Установите мощность лазера на 1%–2%, щелкнув Лазеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение мощности лазера может также привести к фотоотбеливанию или фототоксичности.
   4. Установите коэффициент усиления EM ниже рекомендуемого уровня (< 800), щелкнув Master Gain.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий коэффициент усиления ЭМ может генерировать артефакты.
   5. Увеличьте масштаб до интересующей области или ячейки, чтобы сократить время получения изображения и уменьшить фотоотбеливание. Это также позволяет образцу выживать в течение более длительного времени.
3. Запустите покадровый захват изображения в режиме Airyscan, щелкнув Начать эксперимент.
   1. Прежде чем щелкнуть Начать эксперимент,убедитесь, что получение настроено оптимально.
   2. Если отображается предупреждение с уведомлением «Сбор Данных Airyscan настроен не оптимально», нажмите «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» и нажмите «Оптимальный для области сканирования» (для изображения со сверхвысоким разрешением требуется не менее 1,3 масштаба).
4. Оптимизируйте временной интервал, количество z-срезов и продолжительность покадровой визуализации в соответствии с экспериментальной конструкцией и типом образца, чтобы качество изображения не было скомпрометировано и клетки не были остановлены на определенных этапах клеточного цикла.
   1. В качестве примера, параметры для покадровой визуализации яичек Drosophila, экспрессирующих EGFP-помеченный α-тубулин в ранней зародышевой линии, показаны на следующих шагах.
   2. Для получения покадровой съемки более 5 часов изображение с интервалом 10 минут с мощностью лазера 1% и получение до 30 z-срезов в каждой точке времени.
   3. Для высокодинамических клеточных процессов, таких как динамика микротрубочек, установите 2-минутный интервал между временными точками, выполните покадровую визуализацию 1-2 ч при мощности лазера 1% и возьмите до 30 z-срезов в каждый момент времени.
   4. Для редких клеточных событий, таких как анафаза к ранней телофазной динамике хроматина (2-3 мин события), установите визуализацию живых клеток с интервалом 1 мин между временными точками, выполните 30-минутную покадровую визуализацию при мощности лазера 1% и возьмите до 30 z-срезов в каждой точке времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут варьироваться для разных образцов, поэтому для оптимального использования конкретного образца потребуется изменение.
5. Выполняйте либо покадровую съемку, либо визуализацию в реальном времени, в зависимости от чувствительности образца и экспериментального проекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Короткометражный фильм длится 15–30 минут, а длинный фильм — более 5 ч.
6. Если образец очень чувствителен и не может быть изучен с помощью покадровой визуализации с помощью микроскопа со сверхвысоким разрешением, как это часто бывает с дрозофилами мужского ГСК, выполните снимок образца с супер-разрешением (SRLS) на разных стадиях клеточного цикла (как показано на рисунке 2, рисунок 3, рисунок 4).
   1. Если улавливается редкое клеточное биологическое событие или интересуящный белок имеет низкий уровень экспрессии, то выполните СРЯЛ.
   2. Для SRLS найдите клетку на определенной стадии клеточного цикла, которая вас интересует. Например, если сосредоточиться на связывании микротрубочек с кинетохорами, то используют клетку при прометафазе или метафазе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это поможет гарантировать, что вы получите высококачественное изображение интересующей клетки в нужное время, не рискуя фототоксичностью к образцу или отбеливанием флуорофоров, которое может произойти во время более длительного фильма.
   3. При использовании SRLS изобразите различные этапы клеточного цикла, представляющие интерес, в нескольких ячейках и расположите эти изображения в хронологическом порядке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть использовано для построения временного порядка событий при максимизации сигнала и здоровья тканей, чтобы получить отличное временное разрешение события для особо чувствительных образцов или образцов с низким сигналом.

5. Обработка изображений живых клеток Airyscan

1. После получения изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений выберите Обработка,щелкните Пакетная обработка,а затем выберите Обработка Airyscan.
   1. Выберите изображения для обработки и нажмите кнопку Выполнить/Обработать, чтобы получить изображения со сверхвысоким разрешением.
   2. Выполните обработку с использованием параметра по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка Airyscan будет работать только в том случае, если настройки изображения правильно установлены для визуализации Airyscan.

Результаты

Визуализация живых клеток за пределами дифракционного предела в ткани дрозофилы, особенно для ГСК, дает возможность исследовать динамику субклеточных событий в контексте прогрессирования клеточного цикла. Недавно исследование, использующее этот протокол, показало, что активнос...

Обсуждение

Методы микроскопии со сверхвысоким разрешением обеспечивают пространственное разрешение до 10 нанометров^4,5,6. Методы микроскопии STORM и PALM позволяют разрешать до 20-50 нм (XY-разрешение), в то время как STED-микроскопия предлагает разрешение о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A