ГМ-не-ГМ генерация нейрональных клеток, полученных из крови

Резюме

Представлен генетически модифицированный (gm-free) метод получения клеток с нейрональным фенотипом из перепрограммированных клеток периферической крови. Активация сигнального пути, связанного с новым человеческим GPI-связанным белком, показывает эффективный безГМ-метод получения плюрипотентных стволовых клеток человека.

Аннотация

Многие неврологические расстройства человека вызваны дегенерацией нейронов и глиальных клеток в головном мозге. Из-за ограничений в фармакологических и других терапевтических стратегиях в настоящее время нет доступного лечения для поврежденного или больного мозга. Замена клеток является многообещающей терапевтической стратегией для нейродегенеративных состояний. По сей день нервные стволовые клетки (НСК) успешно генерируются из тканей плода, эмбриональных клеток человека (ЭС) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Процесс дедифференциации был инициирован активацией нового человеческого GPI-связанного гликопротеина, который приводит к генерации плюрипотентных стволовых клеток. Эти полученные из крови плюрипотентные стволовые клетки (BD-PSC) дифференцируются in vitro в клетки с нейронным фенотипом, как показано в яркой и иммунофлуоресцентной микроскопии. Ультраструктурный анализ этих клеток с помощью электронной микроскопии подтверждает их примитивную структуру, а также нейроновидную морфологию и субклеточные характеристики.

Введение

Разработка основных и доклинических методов исследования стволовых клеток способствует клиническому применению терапии на основе стволовых клеток для неврологических заболеваний. Такая потенциальная терапия критически зависит от метода генерации нервных клеток человека, приводящего к функциональному^{восстановлению1.}

Нервные стволовые клетки (НСК) самообновляются и дифференцируются в новые нейроны на протяжении всей жизни в процессе, называемом взрослым нейрогенезом. Только очень ограниченные области мозга содержат НСК, компетентные генерировать новорожденные нейроны во взрослом возрасте. Такие НСК могут давать начало зрелым нейронам, которые участвуют в обучении и памяти, заменяя таким образом потерянные или поврежденные нейроны. К сожалению, эти НСК присутствуют в ограниченных количествах, и этот ограниченный нейрогенез быстро уменьшается во время развития ювенильной^{особи 2.} Поэтому другие источники нервных клеток должны учитываться в цели клеточной терапии.

Дегенеративные неврологические заболевания трудно вылечить с помощью стандартных фармакологических подходов. Новые терапевтические стратегии для охвата многих немедикабельных неврологических расстройств основаны на клеточной заместительной терапии больных и поврежденных тканей. Трансплантация NSC может заменить поврежденные клетки и обеспечить полезные эффекты. Другие источники замещения нервных клеток включают эмбриональные стволовые клетки человека (ESC), которые получены из внутренней клеточной массы бластоцист млекопитающих^3,а также iPSCs^4,которые обладают обширной способностью к самообновлению, как ЭСК, и способны дифференцироваться в различные клеточные линии. НСК также могут генерироваться путем прямого перепрограммирования из фибробластов человека, избегая плюрипотентного состояния^5.

Клеточная заместительная терапия по-прежнему является сложной проблемой. Хотя ESC, fetal или iPS могут быть источником генерации нейрональных клеток для лечения многих неизлечимых неврологических заболеваний, аутологичная замена клеток SCs у взрослых поврежденных тканей является лучшей альтернативой, которая обходит иммунологические, этические проблемы и проблемы безопасности.

Активация человеческого GPI-связанного белка путем сшивания антител путем фосфорилирования PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN инициирует дедифференцировку клеток-прогениторов крови и генерацию плюрипотентных стволовых клеток крови (BD-PSC)^6. Эти клетки дифференцируются in vitro к нейрональным клеткам, что подтверждается с помощью анализа Brightfield, иммунофлуоресценции и просвечивательной электронной микроскопии (TEM).

В этой работе мы описываем ГМ-свободную генерацию BD-PSC и их успешную редифференцировку в клетки с нейрональным фенотипом.

протокол

Этические одобрения были получены при проведении экспериментов.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (ПБМНК)

1. Обеспечить, чтобы все доноры подписали информированное согласие до изъятия крови в соответствии с институциональными руководящими принципами.
2. Возьмите 30 мл крови у здоровых доноров обученным медицинским персоналом по стандартному протоколу.
3. Изолируйте PBMMC по среде градиента плотности. Используют 10 мл среды с 25 мл крови 1:1, разбавленной фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS), и центрифугу в 300 х г в течение 30 мин.
4. Изолируют межфазный слой между плазмой и средой градиента плотности путем пипетирования. Промыть изолированные клетки 5 мл стерильного PBS и центрифугой при 300 х г в течение 10 мин. Повторить дважды.
5. Подсчитывайте количество ячеек стандартными методами с помощью счетной камеры.

2. Активация гликопротеина человека, закрепленного GPI, путем сшивания антител на поверхности PBMNCs

1. Поместите 6 x 10⁶ мононуклеарных клеток (MНК) в пробирки по 15 мл и выполните сшивание антител путем инкубации клеток с человеческим GPI-связанным мембранным белково-специфическим антителом (30 мкг/мл) в течение 30 мин в PBS с 1% бычонного сывороточного альбумина (BSA) при 37 °C.
2. Замените инкубационную среду модифицированной средой Dulbecco от Iscove, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS).
3. Вырастите клетки в 15 мл полистирольных трубок, поместите трубки в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ на 8-10 дней (без встряхивания). На D5 добавьте дополнительно 1-2 мл среды Iscove, дополненной 10% FBS, к каждой трубке 15 мл.

3. Сортировка вновь генерируемых дедифференцированных клеток

1. Подсчитывайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек (18 мкл клеточной суспензии + 2 мкл флуоресцентного красителя) или в счетной камере.
2. Центрифугу культивируют клеточной суспензией (5-7^{х 10 6)}при 300 х г в течение 10 мин и аспирируют полученный супернатант стерильной пипеткой Пастера.
3. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 90 мкл предварительно охлажденного PBS pH 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
4. Добавьте CD45 положительные наноразмерные магнитные шарики (80 мкл) в клеточную суспензию и инкубируют на льду в течение 15 минут.
5. Промыть ячейки, добавив 2 мл буфера PBS и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин.
6. Повторно приостановить клетки в 500 мкл буфера PBS.
7. Промыте колонну 500 мкл предварительно охлажденного буфера PBS и поместите его в магнитное поле.
8. Поместите клеточную суспензию на колонку и промыть ее 500 мкл буфера PBS (два раза) и потоком центрифуги, содержащим CD45 отрицательные ячейки. Соберите их в среде Iscove, дополненной 1% BSA.
9. Подсчитайте ячейки в счетной камере.

4. Приготовление блюд для клеточной культуры для нейронной дифференцировки вновь генерируемых стволовых клеток

1. Покрывают сосуды культуры поли-L-орнитином и ламинином для выращивания нейрональных клеток.
2. Поместите стеклянные крышки в 4-луночные пластины и положите их разбавленным поли-L-орнитином (0,1 мг/мл в ddH₂O) в ddH₂O. Поместите крышки в инкубатор при 37 °C в течение 1 ч. Затем промыть ddH₂O.
3. Медленно разморозить ламинин (0,5-2,0 мг/мл) и добавить в верхнюю часть обшивки. Инкубировать при 37 °C в течение 2 ч.
4. Получают нейронную индукционную среду N2, состоящую из 49 мл D-MEM/F12, 500 мкл добавки N2, 400 мкл незаменимых аминокислот (NEAA), основного раствора FGF при конечной концентрации 20 нг/мл (приготовленного из 100 мкг/мл раствора) и гепарина при конечной концентрации 2 нг/мл.
5. Удалите избыток ламинина путем пипетирования и добавьте нейронную среду N2 в культуральную посуду.

5. Культивирование нейрональных дедифференцированных клеток крови

1. Культивировать CD45-отрицательные клетки, полученные из BD, на стеклянные покровы с покрытием ламинин/орнитин в течение 2 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в среде N2, чтобы инициировать нейронную дифференцировку новых BD-генерируемых клеток.
2. Культивировать клетки далее в нейрональной дифференцировальной среде, состоящей из 48 мл нейробазальной среды, 500 мкл L-глутамина, 1 мл добавки B27, 500 мкл NEAA, 50 мкл рекомбинантного человеческого глиального нейротрофического фактора (GDNF) при 5 мкг/250 мкл в PBS/0,1% BSA и 50 мкл рекомбинантного нейротрофического фактора человеческого мозга (BDNF) при 5 мкг/200 мкл в PBS/0,1% BSA и 50 мкл раствора аскорбиновой кислоты 2,9 г/50 мл в PBS. Поместите пластины в инкубатор при 37 °C и 5% CO_2.

6. Иммунофлуоресцентный микроскопический анализ нервных клеток крови

1. Культивируйте клетки, как описано выше, в течение 16 дней и удалите меа.
   1. Инкубировать предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 75 мл стерильной воды, 4 г параформальдегида. При необходимости добавьте 10 Н NaOH и перемешивайте до тех пор, пока раствор не очистится. Затем добавляют 10 мл 10x PBS, 0,5 мл MgCl_2, 2 мл 0,5 M EGTA и 4 г сахарозы. Титруют до рН 7,4 с 6 N HCl и доводят до 100 мл стерильной воды в течение 15 мин, согласно Marchenko et al.^7.
   2. Откажитесь от фиксатора и мойте клетки 3 раза по 5 мин каждый раз. Сразу же добавляют свежеприготовленный 0,3% раствор Тритона Х и проницают клетки в течение 5 мин. Промыть 3 раза PBS и добавить блокирующий раствор, изготовленный PBS и 5% BSA.
   3. Блокируйте ячейки при комнатной температуре на пластине коромысла на 1 час.
   4. Готовят соответствующее разведение антител в 1% BSA/PBS и инкубируют клетки с разведением антител на пластине коромысла в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Промыть клетки 3 раза PBS в течение 5 мин каждая, инкубировать клетки с ПОМОЩЬЮ DAPI и смонтировать крышки с монтажными носителями для визуализации на микроскопе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно меченые антитела, используемые в этом эксперименте, перечислены в Таблице материалов.

7. Анализ просвечивающих электронных микроскопий вновь генерируемых клеток

1. Засеять ячейки для ТЭМ в 8-скважинных камерных слайдах.
2. Зафиксируют клетки в 3,5% глутаровом альдегиде в течение 1 ч при 37 °C, постфиксируют в 2% OsO₄ в течение дополнительного часа при комнатной температуре и окрашивают в 2% уранилацетат в темноте при 4 °C в течение 2 ч 30 мин.
3. Наконец, промыть клетки в дистиллированной воде, обезвоживать ее в этаноле и встраивать в эпоксидную смолу на ночь. На следующий день переложите образцы в печь с 70 °C в течение 72 ч для затвердевания смолой.
4. Отсоедить внедренные клеточные культуры от камерного слайда и клея до аральдитовых блоков.
5. Вырежьте последовательные полутонкие срезы (1,5 мкм) с помощью машины, установите на стекло-слайды и слегка окрашивайте 1% толуидиновым синим.
6. Приклеиваем выбранные полутонкие срезы к аральдитовым блокам и отделяем их от стеклополки путем многократного замораживания (в жидком азоте) и оттаивания.
7. Готовят ультратонкие срезы (0,06-0,08 мкм) с помощью машины и дополнительно контрастируют с цитратом свинца.
8. Получение микроснимков с помощью электронного сканирующего микроскопа с цифровой камерой.

Результаты

Результаты свидетельствуют о том, что этот новый метод без ГМО способен возвращать клетки-прародителя крови в их самое примитивное состояние без непосредственного действия на геном человека.

Ранее мы показали, что GPI-связанное белковое специфическое сшивание антител ин...

Обсуждение

Не-ГМ-метод перепрограммирования клеток человека, описанный в этой работе, основан на активации мембраны в ядро сигнального механизма (механизмов) за гликопротеином человеческой мембраны, связанным с GPI, который инициирует процесс дедифференцировки, приводящий к генерации ex vivo и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400