JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Флуоресцентная микроскопия на основе легкого листа является наиболее ценным инструментом в биологии развития. Одной из основных проблем в сравнительных исследованиях является разница в окружающей среде. Наш протокол описывает экспериментальную основу для одновременного живого изображения нескольких образцов и, следовательно, решает этот вопрос про-активно.

Аннотация

Флуоресцентная микроскопия на основе светового листа предлагает эффективные решения для изучения сложных процессов в нескольких биологически релевантных масштабах. Образцы камерных установок, которые специально разработаны для сохранения трехмерной целостности образца и обычно имеют вращение образца, являются лучшим выбором в биологии развития. Например, они были использованы для документирования всего эмбрионального морфогенеза плодовой мухи Drosophila melanogaster и красной муки жука Tribolium castaneum. Тем не менее, многие доступные протоколы живой визуализации обеспечивают только экспериментальные рамки для отдельных эмбрионов. Специально для сравнительных исследований такие подходы неудобны, так как последовательно изображенные образцы страдают от дисперсии окружающей среды. Кроме того, это ограничивает количество образцов, которые могут быть просасылись в течение данного времени. Мы предоставляем экспериментальную основу для одновременного живого изображения, что увеличивает пропускную способность в образца камеры на основе установок и, таким образом, обеспечивает аналогичные условия окружающей среды для всех образцов. Во-первых, мы предоставляем рекомендации по калибровке световых листов флуоресцентных микроскопов. Во-вторых, мы предлагаем монтажный метод для нескольких эмбрионов, который совместим с вращением образца. В-третьих, мы предоставляем образцовые трехмерные наборы данных живой визуализации Drosophila, для которых мы сопоставляем три трансгенные линии с флуоресцентно помеченными ядрами, а также Tribolium, для которых мы сравниваем производительность трех трансгенных подлин, которые несут тот же трансген, но в разных геномных местах. Наш протокол специально разработан для сравнительных исследований, так как он активно устраняет дисперсию окружающей среды, которая всегда присутствует в последовательной живой визуализации. Это особенно важно для количественного анализа и характеристики аберрологических фенотипов, которые являются результатом, например, нокаут-экспериментов. Кроме того, это увеличивает общую пропускную способность, что очень удобно, когда доступ к световым микроскопам флуоресценции листа ограничен. Наконец, предлагаемый метод монтажа может быть адаптирован для других видов насекомых и дальнейшей модели организмов, например, зебры, практически без оптимизации усилий.

Введение

Флуоресценция микроскопии является одним из наиболее важных методов визуализации в науке о жизни, особенно в клеточной и биологии развития. В конфокальных флуоресценциимикроскопов 1, которые являются самыми художественными для трехмерной флуоресценции изображения с середины 1990-х годов, тот же объектив используется для флюорофора возбуждения и обнаружения излучения света. Лазерный луч освещения возбуждает все фторфоры вдоль оси освещения/обнаружения, и соответствующий внефокусный сигнал подвергается дискриминации до обнаружения пинхолом. Следовательно, для каждого двумерного изображения весь образец освещается. Следовательно, для каждого трехмерного изображения, т.е. стопки пространственно последовательных двумерных изображений, весь образец освещается от нескольких десятковдо нескольких сотен раз 2, что способствует фотоотчету и фототоксичности3.

Почти двадцать лет назад технология на основе световоголиста 4 стала перспективной альтернативой трехмерной флуоресцентной визуализации и, таким образом, стала ценным инструментом вбиологии развития 5. При этом подходе освещение и обнаружение разъединяются. Объектив освещения используется для создания светового листа с глубиной всего в несколько микрометров в фокусной плоскости перпендикулярно устроенной линзы обнаружения. Таким образом, для каждого двумерного изображения освещается только тонкий планарный объем вокруг фокусной плоскости. Следовательно, для каждого трехмерного изображения, весь образец освещается только один раз, что сильно уменьшает фотоотчет и фототоксичность6. По этой причине флуоресцентные микроскопы светового листа (LSFMs) предлагают эффективные решения для изучения сложных процессов в нескольких биологически релевантных масштабах и, следовательно, имеют особую ценность в биологии развития, где образцы шириной до нескольких миллиметров должны быть проанализированы на субклеточном уровне.

Исторически сложилось так, LSFMs были образца камерыоснове 7,8. В этих установках, освещение (x) и обнаружение (z) осей, как правило, расположены перпендикулярно оси тяжести (y). Образцы камер предлагают широкие экспериментальные свободы. Во-первых, они обеспечивают большие буферные возможности изображения, что, в свою очередь, облегчает использование перфузионной системы для контроля окружающей среды, например,для поддержания определенной температуры 9 или применения биохимических стрессоров. Кроме того, они поддерживают индивидуальныеметоды монтажа 10, которые адаптированы к соответствующим экспериментальным потребностям, сохраняя при этом трехмерную, внекоторых случаях динамическую 11,целостность образца. Кроме того, установки на основе выборочных камер обычно оснащены функцией вращения, которая используется для вращения образцов вокруг оси y и, таким образом, изображения их по двум, четырем или даже более направлениям. Поскольку эмбрионы широко используемых модельных организмов в контексте микроскопии являются относительно большими, последовательными изображениями вдоль брюшной спинной, боковой и/или передней-задней оси тела обеспечивает более полное представление. Это позволяет, например, долгосрочное отслеживание ячеек, которые движутся по сложным трехмерным путяммиграции 12,13.

Свет лист на основе флуоресценции микроскопии была широко применена для изучения эмбрионального морфогенеза Drosophila меланогастер,как систематически 14,15, а также с конкретным акцентом на биофизические аспекты развития. Например, он был использован для сбора морфогенетических данных высокого разрешения для того, чтобы обнаружить биомеханическую связь между эндодермом инагинацией и расширением оси во времяудлинением зародышевой полосы 16 и далее, чтобы связать сложный клеточный поток с шаблонами генерации силы во время гастрипуляции17. Он также был объединен с другими самыми новыми методами, например, оптогенетика для исследования регулирования сигнализации Wnt во время переднего заднего узора в эпидермис18.

Однако изучение только одного вида не дает понимания эволюции развития. Для понимания эмбриогенеза в филогенетического контекста были проведены интенсивные исследования с альтернативными организмами моделей насекомых. Одним из наиболее всесторонне исследованных видов является красная мука жука Tribolium castaneum, экономически значимых хранитсявредитель зерна 19, чей эмбриональный морфогенез также уже систематически изображены с LSFM20. Эмбриональный морфогенез этих двух видов заметно отличается в нескольких аспектах, например,режимом сегментации 21,а также образованием и деградацией внемуникальных мембран22. Последний аспект уже был тщательно проанализирован с использованием LSFMs. Например, было показано, что сероза, экстра-эмбриональной ткани, которая окутывает и защищает эмбрион Tribolium от различных опасностей для большей части его эмбриогенез23,24, также выступает в качестве морфогенетической "драйвер" для своего собственного процесса вывода во времяспинного закрытия 25. Кроме того, было продемонстрировано, что во время гастрипуляции, определенная область бластодерма остается на якоре к вителлиновой мембране для того, чтобысоздать асимметричные движения тканей 26 и, после этого наблюдения, что регионализованная жидкость тканей позволяет клеткам последовательно покинуть серозу края во время закрытиясероза окна 27.

Во всех Дрозофила- и Tribolium -ассоциированныхисследований, упомянутых выше, образец камеры основе LSFMs были использованы. В большинстве случаев эмбрионы были записаны по нескольким направлениям с использованием функции вращения образца. Хотя это и не указано прямо, можно предположить, что они были записаны индивидуально и, таким образом, независимо друг от друга в последовательных живых анализов изображений, похожие на нашу предыдущую работу на Tribolium20,28. В некоторых сценариях такой подход является приемлемым, но особенно в количественных сравнительных подходах, эмбиентная дисперсия может исказить результаты. Например, уже давно известно, что скорость развития насекомых зависитот температуры 29, но более поздние исследования далее предполагает, что в Drosophila, температура может также повлиять на концентрациюморфогенов 30. Следовательно, если определенные характеристики эмбриогенеза, например, динамические пропорции, скорость деления и скорость миграции клеток, должны быть точно количественно, достаточно повторений без эмбиентной дисперсии не требуется. Это сводит к минимуму стандартные отклонения и стандартные ошибки, что, в свою очередь, облегчает сопоставление с другими, даже незначительно расходящимися экспериментальными условиями.

Тем не менее, выборка камерных LSFMs в первую очередь предназначены для высокого содержания, а не высокой пропускной способности анализов. В отличие от конфокальных микроскопов, которые обычно оснащены стандартизированными механизмами зажима для микроскопии слайдов, чашек Петри и хорошо пластин, почти все образцы камеры на основе LSFMs использовать цилиндр основе зажима механизмов. Эти механизмы предназначены для заказных держателей образцов, которые совместимы с вращением, а такженеинвазивные 10,но обычно не предназначены дляболее чем одного образца 20,31,32. Рамки для одновременной живой визуализации двух или более эмбрионов, в которых преимущества установки на основе выборочных камер не скомпрометированы, решает проблему дисперсии окружающей среды, тем самым повышая ценность LSFMs для сравнительных исследований.

В нашем протоколе мы представляем экспериментальную основу для сравнительной живой визуализации в образец камеры на основе LSFMs(рисунок 1A), в котором у оси используется в качестве опции для "стек" эмбрионов. Во-первых, мы предоставляем флуоресцентные микросферные калибровочные рекомендации для образцовых камерных LSFMs, что особенно важно для приборов, не имеют ассистента калибровки. Во-вторых, мы описываем метод монтажа для нескольких эмбрионов наоснове держателя паутины 28 (рисунок 1B), который совместим с вращением образца и, таким образом, позволяет одновременное изображение нескольких образцов по нескольким направлениям(рисунок 1C). Несколько эмбрионов выровнены поверх тонкой агарозной пленки и, после вставки в образец камеры, переехал последовательно через световой лист, чтобы приобрести трехмерные изображения. В-третьих, мы предоставляем три образцовых живых наборов данных изображений для Drosophila, а также для Tribolium. Для первых мы сопоставляем трансгенные линии с флуоресцентно помеченными ядрами. Для последних мы сравниваем производительность трансгенных подлин, которые имеют один и тот же трансген, но в разных геномных местах. Наконец, мы обсуждаем важность параллелизации в отношении сравнительной живой визуализациии дисперсии окружающей среды 33, обсуждаем предел пропускной способности наших экспериментальных рамок и оцениваем адаптацию нашего подхода к другим моделью организмов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовительная работа

  1. Выберите объектив освещения / обнаружение объектива / камеры сочетание для LSFM, который подходит научный вопрос и настроить микроскоп. Размер поля зрения является фактором размера чипа камеры и увеличения объектива обнаружения. Объектив освещения должен быть выбран таким образом, чтобы все поле зрения было покрыто примерно планарной световой пленкой34. Три рекомендуемые комбинации перечислены в таблице 1.
  2. Для приготовления агарозных алицитов и поиска блюд добавьте 2 г низкорастучая агарозы в 200 мл автоматической водопроводной воды и нагрейте смесь в микроволновой печи при температуре 600-800 Вт до тех пор, пока все частицы агарозы не растворятся. Приготовьте несколько 1 мл агарозных алицитов в 1,5 мл или 2 мл реакционной трубки, затем заполните несколько 90-мм чашек Петри высотой 3-5 мм агарозой. Храните затверденные алициты и блюда при 4 градусах Цельсия.
  3. Для Drosophila: Для приготовления свежих флаконов выращивания, варить достаточное количество заказных или коммерчески доступных Drosophila среды, передачи 5-15 мл в широкие флаконы и хранить их при 4 градусов по Цельсию. Для приготовления яйцекладки блюда, добавить 1 г низкорастукой агарозы до 50 мл автоматической водопроводной воды и тепла смеси в микроволновой печи при 600-800 Вт, пока все частицы агарозы растворяются. Дайте смеси остыть до 45 градусов по Цельсию, затем добавьте фруктовый сок 50 мл (желательно яблочный или красный виноград) и тщательно перемешайте. Налейте смесь в 35 мм и Петри блюда и хранить затверденные яйцекладки блюда при 4 градусов по Цельсию.
  4. Для Tribolium: Для подготовки среды роста, пройти цельнозерновой муки, а также неактивные сухие дрожжи через сито размером 710 мкм сетки, а затем дополнить просеянную муку с 5% (w/w) просеянные дрожжи. Для приготовления яйцекладки среды, пройти тонкой пшеничной муки, а также неактивные сухие дрожжи через сито размером 250 мкм, а затем дополнить просеянную муку с 5% (w/w) просеянные дрожжи.

2. Калибровка ЛФМ на основе выборочной камеры с использованием флуоресцентных микросфер

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель калибровки заключается в выравнивание координационных центров освещения и обнаружения линз(рисунок 2A), так как это является предпосылкой для четких изображений. LSFMs должны быть откалиброваны регулярно, по крайней мере один раз в 3-4 недели.

  1. Повторное сжижение агарозы aliquot в сухой блок нагреватель / смеситель при 80 градусов по Цельсию, а затем позволить агарозы aliquot остыть до 35 градусов по Цельсию.
  2. Перенесите 50 МКЛ агарозы в реакционной трубке 1,5 мл и добавьте 0,5 МКЛ флуоресцентного раствора микросферы. Смешайте при 1400 об/мин в течение 1 мин.
  3. Заполните прорези отверстие держателя паутины с 10 йл агарозы / флуоресцентной смеси раствора микросферы, а затем аспирировать столько агарозы, как это возможно, пока только тонкая пленка агарозы остается. Подождите 30-60 с для затвердевания.
  4. Заполните образец камеры с автоклавом водопроводной воды. Вставьте держатель паутины медленно в камеру образца и переместите прорези отверстие с этапами микропереведения перед объективом обнаружения.
  5. Поверните держатель паутины со стадией вращения до положения 45 градусов по отношению к осветительному (x) и обнаружению (z) осей. Держатель паутины не должен быть виден в световом канале передачи.
  6. Переключитесь на соответствующий канал флуоресценции и отрегулируйте мощность лазера, а также время экспозиции таким образом, чтобы флуоресцентные микросферы обеспечивают надлежащий сигнал.
  7. Укажите объем представления, который охватывает теперь поперечно ориентированных агароза фильм полностью. Определите интервал z, вычислив максимально возможное топоричное разрешение для соответствующей комбинации объектива освещения/объектива обнаружения34. Кроме того, в 4 раза боковое разрешение может быть использовано в качестве грубого приближения.
  8. Завехайте трехмерный тест z стек флуоресцентных микросфер и сравните максимальные проекции x, y и z с калибровочной диаграммой(рисунок 2). Если микросферы кажутся размытыми, нечеткими и/или искаженными(рисунок 2B,C),отрегулируйте положение освещения и/или объектива обнаружения.

3. Коллекция эмбрионов дрозофилы

  1. Передача 100-200 взрослых линии Drosophila выбора на свежий флакон выращивания 2-3 дней до анализа изображений, чтобы установить культуру сбора яиц. Если еще не существует, рассмотреть вопрос об использовании старого воспитания флакон, чтобы начать потомство культуры. Для того, чтобы взрослым не было более двух недель, со временем замените культуру сбора эмбрионов культурой потомства.
  2. Разогрейте блюдо для яйцекладки до комнатной температуры и добавьте каплю дрожжевой пасты поверх агара.
  3. Перенесите взрослых из культуры сбора яиц в пустой узкий флакон и поместите его поверх яйцекладки блюдо. Инкубировать установку сбора яиц при комнатной температуре в течение 15 минут. Избегайте анестезии (холодный, CO2) во время этого шага, если это возможно.
  4. Верните взрослых к воспитанию флакона. Инкубировать яйцекладка блюдо при удобной температуре / время комбинации, а затем передать 10-20 эмбрионов с небольшой кистью из яйцекладки блюдо 100 мкм сетки размером ситечко клетки. Откажитесь от яйцекладки блюдо.
  5. Повторите шаги от 3,1 до 3,4 для каждой линии Drosophila.

4. Коллекция эмбрионов триболия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства предусмотрена схема процедуры сбора яиц Tribolium (рисунок 3A),на которую также ссылаются цифры в скобках на этом этапе.

  1. Передача 200-300 взрослых (около 400-700 мг) линии Tribolium выбора в пустую стеклянную бутылку 1 л за 2-10 дней до анализа изображений, чтобы создать культуру сбора яиц(рисунок 3A_01). Заполните бутылку 50-100 г свежей среды роста. Если еще не существует, рассмотреть вопрос о запуске культуры потомства с использованием доступных личинок и куколок. Для того, чтобы взрослым не было более 3 месяцев, со временем замените культуру сбора яйцеклеток культурой потомства.
  2. Перейдите культуру сбора яиц через сито размером сетки 800 мкм(рисунок 3A_02). Верните среду роста, которая содержит неуступные эмбрионы, в начальнуюбутылку (рисунок 3A_03)и перенесите взрослых в пустую стекляннуюбутылку 1л(рисунок3 A_04). Добавьте 10 г яйцекладки среды(рисунок 3A_05) и инкубировать установку сбора яиц при комнатной температуре в 1 ч (рисунок3A_06,07).
  3. Перейдите установку сбора яиц через сито размером сетки 800 мкм(рисунок 3A_08). Верните взрослых в свою начальнуюбутылку (рисунок 3A_09). В зависимости от процесса развития, который должен быть изображен, инкубировать яйцекладки среды, которая в настоящее время содержит около 30-100 эмбрионов, при удобной температуре / время комбинации(рисунок 3A_10).
  4. Перейдите яйцекладка среды через сито размером 300 мкм сетки(рисунок 3A_11) и передать эмбрионы(рисунок3A_12 ) на 100 мкм сетки размером сеятель клеток. Отбросьте просеяные яйцекладки средствмассовой информации (рисунок 3A_13).
  5. Повторите шаги от 4,1 до 4,4 для каждой линии Tribolium.

5. Дехорионация на основе гипохлорита натрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба drosophila и Tribolium эмбрионы покрыты хорион, защитные и сильно светоотбрасывания белковый слой, который не является необходимым для надлежащего развития до тех пор, как эмбрионы хранятся влажными после удаления. Протокол дехорионизации эмбрионов обоих видов идентичен.

  1. Подготовьте 6-хорошо пластины, заполнив A1, A2, A3 и B3 скважины с 8 мл автоматической водопроводной воды и B1 и B2 скважин с 7 мл автоматической водопроводной воды и 1 мл гипохлорита натрия (NaOCl) решение(рисунок 3B). Наблюдайте процесс декорионации под стерео микроскопом, в идеале при передаче света.
    ВНИМАНИЕ: Гипохлорит натрия коррозионный.
  2. Вставьте эмбрионсодержащую клетку ситечко (Шаг 3.4 и/или 4.4) в колодец А1 и вымойте эмбрионы около 30-60 с под нежным возбуждением.
  3. Переместите клеточный ситечко на B1 хорошо и встряхните пластины энергично в течение 30 с, затем передать его в A2 хорошо и мыть эмбрионы в течение 1 мин под нежным волнением.
  4. Переместите клеточный ситечко на B2 хорошо и встряхните пластину энергично, пока большинство эмбрионов полностью dechorionated(рисунок 3C), а затем передать его В3 хорошо и мыть эмбрионы в течение 1 мин под нежным волнением.
  5. Храните ситечко клетки в B3 задолго до начала монтажной процедуры.
  6. Повторите шаги от 5,1 до 5,5 для каждой строки.

6. Монтаж нескольких эмбрионов с использованием держателя паутины

  1. Повторное сжижение агарозы aliquot в сухой блок нагреватель / смеситель при 80 градусов по Цельсию, а затем позволить агарозы aliquot остыть до 35 градусов по Цельсию.
  2. Пипет 10 йл агарозы на верхней части прорези отверстие держателя паутины. С кончиком пипетки, распространение агарозы над прорези отверстие, а затем аспирировать столько агарозы, как это возможно, пока только тонкая пленка агарозы остается. Подождите 30-60 с для затвердевания.
  3. Для каждой линии тщательно подберите один или несколько эмбрионов с небольшой кистью и поместите их на агарозную пленку.
  4. Упорядочить эмбрионы вдоль длинной оси прорези отверстие, а затем также выровнять их передней задней оси с длинной оси прорези отверстие (Рисунок 3D).
  5. Тщательно стабилизуйте эмбрионы, засовав 1-2 МКЛ агарозы в зазор между эмбрионами и агарозной пленкой. Подождите 30-60 с для затвердевания.
  6. Вставьте держатель паутины с установленными эмбрионами медленно в камеру образца, заполненную буфером изображения.

7. Сравнительная живая визуализация в образцах камерных LSFMs

  1. Перемести один из эмбрионов с этапами микроперевода перед объективом обнаружения. Убедитесь, что держатель паутины находится в положении 45 "по отношению к освещению (x) и обнаружения (z) осей (ср. Рисунок 1C).
  2. В передаче светового канала, переместить эмбрион в центр поля зрения. Держатель паутины не должен быть виден.
  3. Перемещение эмбриона с этапами микроперевода в z до середины самолета эмбриона перекрывается с фокусной плоскости, т.е. до тех пор, пока контур не появится резким. Не переключаясь на канал флуоресценции, укажите объем зрения, перемещаясь на 250 мкм от среднего самолета в обоих направлениях.
  4. По желанию, если требуется изображение по нескольким направлениям, поверните эмбрион соответствующим образом и повторите шаги 7.2 и 7.3. Держатель паутины поддерживает до четырех ориентаций в шагах 90 градусов.
  5. Повторите шаги от 7,1 до 7,3 (или 7,4) для всех остальных эмбрионов, установленных на держателе паутины(рисунок 3E). Убедитесь, что верхний эмбрион не покидает буфер изображения, когда самый нижний эмбрион находится перед объективом обнаружения.
  6. Определите параметры флуоресценции (лазерная мощность, время экспозиции, фильтр обнаружения) и параметры промежуток времени (интервал, общая продолжительность) и начните процесс визуализации. Для индикативных значений обратитесь к таблице метаданных примеров наборов данных(Дополнительная таблица 1). Для анализов, которые длятся несколько дней, рассмотреть вопрос о покрытии открытия выборочных камер по крайней мере частично, чтобы уменьшить испарение.

8. Извлечение и дальнейшее культивирование изображенных эмбрионов

  1. Когда анализ изображений закончился, осторожно удалите держатель паутины из камеры образца.
  2. Отсоедините эмбрионы от агарозной пленки небольшой кистью и перенесите их на соответствующую микроскопную горку. Поместите слайд в блюдо для поиска и инкубировать в соответствии с соответствующими стандартными условиями воспитания.
  3. Что касается экспериментальных методов, оцените, когда эмбриогенез будет завершен. По мере приближения точки времени вылупления часто проверяйте извлеченные блюда и перенесите вылупившихся личинок дрозофилы на отдельные овсяные флаконы и личинки триболия в отдельные скважины 24-колодцевой пластины. Заполните скважины до половины со средним ростом. Инкубация в соответствии с соответствующими стандартными условиями воспитания.
  4. После того, как наблюдаемые лица являются взрослыми, предоставить им подходящий партнер спаривания и проверить потомство через несколько дней.

9. Обработка данных изображений и документация по метаданным

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки данных изображений рекомендуется (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI не требует установки и 32- а также 64-битные версии доступны. Одним из наиболее часто используемых форматов данных LSFM является формат помеченных файлов изображений (TIFF), который позволяет хранить стеки изображений в виде контейнера TIFF.

  1. Рассчитайте максимальные проекции z для всех стеков z(изображение | Стеки | Проект ,выберите Макс Интенсивность). Максимальные прогнозы – это подходы к упрощению данных, которые уменьшают количество пространственных измерений с трех до двух. Предоставляется скрипт FIJI для обработки партий(дополнительный файл 1).
  2. Сокатинировать соответствующие z максимальные проекции для создания стеков времени (t стеки). Сохраните их в одном контейнере TIFF. Сделайте это для всех зарегистрированных эмбрионов, а также соответствующих направлений и каналов флуоресценции, если это применимо.
  3. Поверните z и t стек вокруг оси z для выравнивания передней-задней оси эмбрионов с оси изображения x или y(изображение | Преобразование | Повернуть). Обрезать z стеки вдоль всех трех осей изображения и т стек в х и у изображения осей так, что только минимальное пространство буфера (20-40 пикселей вдоль х и у осей, 5-10 изображений вдоль оси z) вокруг эмбриона остается(изображение | Отрегулируйте | Размер холста для топоров x и y, Image | Стеки | Инструменты | Нарежьте Keeper для оси z).
    1. Сделайте это индивидуально для всех зарегистрированных эмбрионов, а также соответствующих направлений, если это применимо. Флуоресценции каналы, если это применимо, должны быть обработаны с идентичными параметрами вращения и обрезки.
  4. Документировать метаданные как можно более подробно. В качестве ориентира можно использовать таблицу метаданных примерных наборов данных, которые представлены в разделе Результаты представителя(Дополнительная таблица 1).

10. Визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Это руководство визуализации данных фокусируется в первую очередь на создании z максимальных матриц проекционного изображения, которые показывают несколько записанных эмбрионов по нескольким направлениям и/или с течением времени. Следующие шаги описывают процедуру визуализации данных, которая была применена к примерам наборов данных для создания показанных цифр и видеоматериалов, связанных в разделе Результаты представителя.

  1. Комбинат t стеки нескольких направлений (Изображение | Стеки | Инструменты | Комбинат)и/или слияние нескольких флуоресцентных каналов(image | Цвет | Слияние каналов), чтобы визуализировать биологическую структуру и/или процесс, представляющий интерес.
  2. Отрегулируйте интенсивность стеков t(изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность)по мере необходимости с помощьюфункции «Сет». Минимальное отображаемое значение должно быть установлено немного выше фонового сигнала, максимальное отображаемое значение должно привести к удобному контрасту. Документировать оба значения, так как они могут быть использованы для последовательной корректировки соответствующих стеков z. Корректировки отпечатков с использованиемфункции«Применить». В зависимости от экспериментальных условий, рассмотрим обработку всех зарегистрированных эмбрионов с одинаковыми значениями.
  3. Сохранить интенсивность скорректированных t стеки в качестве отдельных файлов, не переопределить не отрегулированных t стеки. Составляйте подходящие подтухи из скорректированных стеков t с выделенными функциями выбора изображений (например, | Стеки | Инструменты | Slice Keeper) и использовать инструмент монтажа (Изображение | Стеки | Сделать Montage) для создания изображений сетки, которые могут быть использованы для фигурного дизайна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Наш протокол описывает экспериментальную основу для сравнительной флуоресценции живой визуализации в образец камеры на основе LSFMs. Например, эта структура может быть использована для сопоставления (i) эмбрионов двух или более видов, ii) эмбрионов линий, в которых один или несколько гено?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одной из областей исключительного применения LSFMs является биология развития. В этой дисциплине важно смотреть на живые образцы, иначе морфогенетические процессы не могут быть описаны динамически. Экспериментальная основа для одновременного живого изображения в образцах камерных LSFMs,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Эрнста Х. К. Стельцера за возможность использовать его ресурсы, а также его ценные комментарии относительно рукописи, Аниту Андерл за поддержку с живой визуализацией Tribolium, Свена Плата для технической поддержки, а также Илана Дэвиса, Николь Гридер и Герольда Шубигера для обмена их трансгенными линиями Drosophila через Bloomington Stock Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well plateOrange Scientific4430500 
24-well plateOrange Scientific4430300Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dishFisher Scientific153066Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dishFisher ScientificL9004575
100 µm mesh size cell strainerBD Biosciences352360
250 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-038Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-040Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-050Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-051Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flourDemeter e.V.SP061006Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila mediumGenesee Scientific66-115Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm ØThermo Fisher ScientificT7282
inactive dry yeastGenesee Scientific62-108
low-melt agaroseCarl Roth6351.2
narrow vialsGenesee Scientific32-109Only for live imaging involving Drosophila
small paint brushVWR International149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active ClCarl Roth9062.3Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flourDemeter e.V.SP061036Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vialsGenesee Scientific32-110Only for live imaging involving Drosophila

Ссылки

  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003(2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292(2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454(2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636(2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082(2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111(2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834(2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193(2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629(2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677(2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240(2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065(2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555(2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616(2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

163LSFMDrosophila melanogasterTribolium castaneum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены