Транссекция зрительного нерва с сохранением оболочки у крыс для оценки регенерации аксонов и вмешательства, нацеленные на аксон ганглиозных клеток сетчатки

Резюме

Этот протокол описывает транссекцию зрительного нерва, которая сохраняет оболочку зрительного нерва у крыс. Гидростатическое давление от микроинъекций в зрительный нерв приводит к полному рассечению, что позволяет бесшовно переложить перерезанные окончания зрительного нерва и напрямую нацелиться на аксональный компартмент в модели пересечения.

Аннотация

Аксоны ганглиозных клеток сетчатки (РГК) сходятся в головке зрительного нерва для передачи визуальной информации от сетчатки к мозгу. Такие патологии, как глаукома, травма и ишемическая невропатии зрительного нерва, повреждают аксоны RGC, нарушают передачу визуальных стимулов и вызывают потерю зрения. Животные модели, имитирующие повреждение аксонов РГК, включают парадигмы сдавливания зрительного нерва и пересечения. Каждой из этих моделей присущи преимущества и недостатки. Размножение зрительного нерва, как правило, менее серьезное, чем пересечение, и может быть использовано для анализа регенерации аксонов в месте поражения. Тем не менее, различия в силе и продолжительности раздавливания могут влиять на реакцию тканей, что приводит к переменной воспроизводимости и полноте поражения. При пересечении зрительного нерва происходит тяжелая и воспроизводимая травма, которая полностью повреждает все аксоны. Тем не менее, пересечение зрительного нерва резко изменяет гематоэнцефалический барьер, нарушая оболочку зрительного нерва, подвергая зрительный нерв воздействию периферической среды. Кроме того, регенерация за пределами места пересечения не может быть оценена без повторного прикрепления перерезанных нервных окончаний. Кроме того, различные дегенеративные изменения и клеточные пути активируются либо при раздавливании, либо при травме от пересечения.

Описанный здесь метод сочетает в себе преимущества моделей как раздавливания зрительного нерва, так и модели пересечения, смягчая при этом недостатки. Гидростатическое давление, доставляемое в зрительный нерв с помощью микроинъекции, полностью пересекает зрительный нерв с сохранением целостности оболочки зрительного нерва. Пересеченные концы зрительного нерва повторно помещаются для проведения анализов регенерации аксонов. Потенциальным ограничением этого метода является невозможность визуализировать полное разрез, что является потенциальным источником вариабельности. Тем не менее, визуальное подтверждение того, что видимая часть зрительного нерва была пересечена, указывает на полную транссекцию зрительного нерва с успехом в 90-95%. Этот метод может быть применен для оценки стратегий стимулирования регенерации аксонов в модели пересечения или исследования вмешательств, нацеленных на аксональные компартменты.

Введение

Повреждение аксонов и дегенерация происходят в ганглиозных клетках сетчатки (РГК) после травмы или при нейродегенеративных заболеваниях, таких как глаукома ^1,2. Потеря РГК и нарушение проекций ретинофугального излучения приводят к необратимой потере зрения³. Чтобы понять молекулярные пути, ответственные за дегенеративные процессы, и разработать стратегии смягчения потери аксонов и РГК или регенерации аксонов РГК, были использованы экспериментальные модели животных для моделирования повреждения зрительного нерва, включая модели раздавливания зрительного нерва и пересечения зрительного нерва. При выборе экспериментальной модели необходимо учитывать преимущества и недостатки каждого подхода, а также молекулярные пути, активируемые травмой^.

Обоснование для разработки описанного здесь метода заключается в том, чтобы использовать преимущества моделей crush⁵ и transection⁶ зрительного нерва при одновременном устранении недостатков. Цели этого метода заключались в том, чтобы создать воспроизводимое повреждение зрительного нерва, при котором все аксоны бесспорно и полностью пересекаются, воздействие на периферическую иммунную систему сводится к минимуму, а перерезанные концы зрительного нерва легко возвращаются обратно, что позволяет оценить регенерацию РГК. Кроме того, метод был разработан для обеспечения компартментализованного доступа к аксональной части поврежденных РГК и доставки специфических для аксонов вмешательств (например, нейротрофических факторов, клеточных трансплантатов) локально в ретроорбитальный зрительный нерв.

Существует множество преимуществ этого метода перед альтернативными методами. По сравнению с раздавливанием зрительного нерва, этот метод полностью и надежно пересекает зрительный нерв; Это решает потенциальную проблему нежелательного сохранения аксонов⁷. Кроме того, описанный метод вызывает тяжелую аксональную травму, которая не зависит от величины и продолжительности усилия, приложенного оператором, как при травме от раздавливания, тем самым уменьшая вариабельность⁸. В отличие от установленных методов пересечения зрительного нерва, подход, подробно описанный в этом протоколе, сохраняет целостность оболочки зрительного нерва. Преимущество сохранения оболочки зрительного нерва заключается в том, что она предотвращает воздействие на зрительный нерв периферической иммунной системы. Кроме того, механические силы, действующие оболочкой зрительного нерва на пересеченный зрительный нерв, возвращают перерезанные нервные окончания без необходимости проведения сложных микрохирургических манипуляций ^9,10,11. Наконец, при неповрежденной оболочке зрительного нерва метод создает физическое пространство между культями зрительного нерва, в которое стволовые клетки, нейротрофические факторы или полимеры могут быть введены непосредственно в поврежденные аксоны RGC.

Сдавливание зрительного нерва является золотой стандартной моделью, в которой оцениваются стратегии регенерации зрительного нерва для определения эффективности лечения. Размер зрительного нерва грызуна ограничивает возможные манипуляции, особенно пересечение и реадаптацию нерва. Тем не менее, в области травмы и регенерации спинного мозга существует консенсус в отношении того, что полная транссекция является идеальной моделью для отличия регенерации аксонов от сохраненного аксона¹². Описанный здесь метод устраняет технические барьеры для оценки регенеративных стратегий в модели пересечения зрительного нерва. Таким образом, эта модель может быть использована для проверки перспективных стратегий, выявленных в парадигмах сдавливания зрительного нерва с помощью пересечения зрительного нерва. Кроме того, поскольку эта модель непосредственно нацелена на аксональный компартмент, она позволяет изучать вмешательства на поврежденных аксонах RGC взрослых и механизмы, ответственные за аксональные дегенеративные и регенеративные процессы.

Описанная в данном исследовании модель пересечения зрительного нерва полностью пересекает зрительный нерв с сохранением оболочки зрительного нерва. Этот новый подход подходит для экспериментов, направленных на оценку регенерации аксонов в модели пересечения без необходимости технически сложного процесса повторного подключения концов зрительного нерва. Аспекты техники аналогичны выполнению раздавливания зрительного нерва; Поэтому подход могут выполнять операторы, имеющие опыт работы с размозжением зрительного нерва. Хирургический подход не требует специально разработанных инструментов и может быть дополнен легкодоступными хирургическими инструментами и системой микроинъекций, что делает его доступным и экономичным.

протокол

Процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) системы здравоохранения Сан-Диего по делам ветеранов. Хирургические инструменты и растворы были стерилизованы перед операцией, чтобы ограничить послеоперационные инфекции и осложнения.

1. Хирургическая техника

1. Проводите эксперименты с использованием асептических методов и в соответствии с протоколами использования животных в конкретных учреждениях.
2. Стерилизуйте инструменты и материалы, контактирующие с живыми тканями, чтобы предотвратить инфекции, избежать негативного воздействия на благополучие животных и свести к минимуму потенциальное негативное влияние на исследование. Тщательно очистите хирургические инструменты водой с моющим средством или ферментными продуктами, чтобы удалить инородные материалы и стерилизовать паром или мгновенной стерилизацией.
3. Аликвотные жидкости разливаются в стерильные контейнеры в вытяжке для культуры тканей. Простерилизуйте микролитровый шприц, промыв его 70% этанолом и промыв стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).

2. Анестезия

1. Обезболите крыс с помощью системы исполевителя изофлурана. Испарить изофлуран в концентрации 4,5% с использованием медицинского кислорода со скоростью 1 л/мин в прикрепленный бокс для анестезии. Поместите животное в бокс для анестезии до тех пор, пока дыхание не замедлится и животное не будет усыплено.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот начальный шаг с использованием анестезии газовым анестетиком не является необходимым, если оператор чувствует себя комфортно и знаком с введением инъекционных анестетиков животным без седативных препаратов.
2. Наберите достаточное количество обезболивающего коктейля, состоящего из кетамина (50 мг/кг), ксилазина (2,6 мг/кг) и ацепромазина (0,5 мг/кг) в туберкулиновый шприц массой 30 г. Извлеките животное под действием седативных препаратов из анестезиологического бокса. Вводите инъекцию анестезии внутрибрюшинно, чтобы достичь постоянной глубины седации на протяжении всей процедуры и вернуть животное в клетку.
3. Начинайте процедуру, когда ущипывание пальца ноги не вызывает ответной реакции. Оцените животное на глубину и частоту дыхания и с помощью щипки пальцев ног каждые 5 минут на протяжении всей процедуры, чтобы убедиться в отсутствии боли.
4. По завершении операции извлеките животное из стереотаксической рамы. Введите подкожное введение физиологического раствора (3 мл), ампициллина (0,15–0,2 мг/кг) и банамина (2,5–5 мг/кг) для обеспечения обезболивания и поддержки инфузионной водой. Переведите животное в отапливаемый инкубатор для поддержания температуры тела.

3. Хирургический подход

1. Поместите крысу (в возрасте 7–8 недель, штамм Фишера 344) в стереотаксическую рамку для головы и положите ее на подогреваемую подушку. Расположите стереотаксическую рамку так, чтобы голова крысы была обращена влево к хирургу, и центрируйте левую орбиту в операционном поле зрения.
2. На левый глаз нанесите каплю пропаракаина и очистите глаз, нанеся на веко и глаз 5% повидон-йод. Нанесите офтальмологическую мазь на роговицу обоих глаз для поддержания влажности роговицы и предотвращения образования катаракты.
3. Проведите полиглактиновый шов 4–0 через эпидермис верхнего века к центральному аспекту края века, используя этот шов для временной тарсоррафии на более поздних этапах. С помощью шва отведите веко и обнажите верхний свод.
4. Прикрепите полиглактиновый шов к стереотаксической раме, чтобы обеспечить постоянное вытяжение и воздействие. Избегайте чрезмерного вытяжения, так как это может ограничить воздействие ретроорбитального содержимого.
5. С помощью щипцов Colibri поднимите верхнюю конъюнктиву и надрежьте конъюнктиву вдоль лимба ножницами Vannas. Сделайте 4-часовую перитомию вдоль верхнего лимба.
6. Приложите небольшое нижнее вытяжение к глазному яблоку, наложив петлевый полипропиленовый шов вдоль верхнего лимба со свободными концами ниже глазного яблока. Остаточная ткань вдоль верхнего лимба после перитомии достаточна для обеспечения тракции на шовной петле без необходимости пропускания шва через склеру или лимб.
   1. Закрепите концы петли бульдожьим зажимом и позвольте зажиму свободно болтаться в воздухе. Вес зажима будет оказывать меньшее сцепление на глобус и обнажать большую часть ретроорбитального пространства.
7. Тупым рассечением ножницами Ванна вдоль склеры по задней поверхности глазного яблока и под верхней прямой мышцей. Отделите верхние прямые мышцы от глазного яблока, разрезав мышечное сухожилие ножницами Ваннаса, чтобы получить доступ к ретроорбитальному пространству.

4. Доступ к зрительному нерву

1. Тупое рассечение щипцами Dumont #5/45 вдоль височной стороны заднего глазного яблока и определение верхней боковой вихревой вены. Далее тупым образом рассеките носовую до верхней боковой вихревой вены, чтобы обнажить конус орбитальной мышцы вокруг зрительного нерва и избежать преждевременного повреждения зрительного нерва. Избегайте травмирования вихревой вены, так как это может вызвать значительное кровотечение. При возникновении кровотечения можно применять аппликатор с ватным наконечником до тех пор, пока кровотечение не остановится.
2. С помощью щипцов Dumont #5/45 осторожно введите наконечник в височную часть конуса орбитальной мышцы и раскройте щипцы параллельно ходу мышечных волокон, чтобы открыть зрительный нерв. С помощью щипцов сместите в сторону мышечные волокна, расположенные над зрительным нервом, и полностью обнажите нерв. Убедитесь, что зрительный нерв покрывает только оболочка зрительного нерва, так как остаточные мышечные волокна предотвратят легкое проникновение стеклянной капиллярной пипетки в зрительный нерв.
3. Поддерживайте обнажение нерва, разместив два щипца Dumont #5/45 вдоль обеих боковых сторон нерва и открыв щипцы. Объем обнажения должен позволять раздавливать зрительный нерв на 1,5–2,0 мм позади глазного яблока и вводить в зрительный нерв с дорсальной стороны стеклянную капиллярную пипетку.

5. Пересечение зрительного нерва внутри зрительной оболочки

1. С помощью щипцов Dumont #5/45 расположите кончики по обе стороны от зрительного нерва на расстоянии не менее 1,5–2,0 мм позади глазного яблока. Убедитесь, что кончики щипцов охватывают диаметр нерва. Полностью закройте щипцы на 5 с, чтобы раздавить зрительный нерв и запишите положение места раздавливания.
2. С помощью микролитрового шприца наполните стеклянную капиллярную пипетку 1–2 μл PBS и прикрепите пипетку к держателю для пипетки. Установите держатель пипетки на микроманипулятор и прикрепите микроманипулятор к стереотаксической раме.
3. Отрегулируйте систему микровпрыска для подачи одного импульса длительностью 4 мс при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм при каждом нажатии кнопки. Поместите пипетку в операционное поле.
4. Под хирургическим скопом используйте пару щипцов #55, чтобы сломать и скосить кончик пипетки до размера (~20–30 мкм в диаметре), способного обеспечить небольшой объем, но достаточно большой, чтобы обеспечить достаточную жесткость для проникновения в оболочку зрительного нерва. Подтвердите проходимость наконечника пипетки, подав один импульс и наблюдая за жидкостью на наконечнике пипетки.
5. Уточните положение наконечника пипетки до места раздавливания зрительного нерва в центре зрительного нерва и в контакте с оболочкой зрительного нерва. Обратите внимание на вертикальное положение пипетки на микроманипуляторе для последующего определения глубины 200 мкм.
6. Опускайте пипетку, наблюдая за наконечником под операционным эндоскопом, пока пипетка не войдет в зрительный нерв. Если наконечник пипетки изгибается и ему не хватает жесткости для проникновения в оболочку зрительного нерва, втяните пипетку и используйте пару щипцов #55, чтобы уменьшить длину и увеличить диаметр наконечника пипетки. После регулировки наконечника пипетки повторите попытку проникнуть пипеткой в оболочку зрительного нерва.
7. При входе в зрительный нерв с помощью наконечника пипетки при необходимости втяните пипетку. Положение наконечника пипетки, указанное стереотаксическим микроманипулятором, должно находиться на 200 мкм ниже поверхности зрительного нерва от исходного положения, указанного в шаге 5.5.
8. Наблюдая за зрительным нервом под операционным скопом, подайте импульсы гидростатического давления с помощью системы микроинъекций. При подаче импульсов следует отметить линейное разделение между дистальным и проксимальным концами зрительного нерва, чтобы убедиться в рассечении зрительного нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции 250–500 нл, как правило, достаточен для обеспечения силы, необходимой для разреза зрительного нерва. Инъекции, требующие более 1 μл, могут указывать на необходимость изменения положения места инъекции. Большие объемы, введенные в интактную паренхиму, могут не вызвать дополнительного повреждения РГК, учитывая, что метод полностью пересекает зрительный нерв, но с большей вероятностью будет отслеживаться вдоль пучков зрительного нерва. Отсутствие наблюдения за линейной транссекцией зрительного нерва, несмотря на инъекцию достаточного объема жидкости, вероятно, указывает на неправильное положение пипетки в месте раздавливания и необходимость изменения положения. Также может потребоваться увеличение давления впрыска на 50%.

6. Закрытие и восстановление

1. Втяните пипетку и снимите втягивающие щипцы Dumont #5/45. Верните глаз в нейтральное положение, сняв бульдожий зажим и петлевый полипропиленовый шов с глазного яблока.
2. Переместите конъюнктиву в лимб роговицы, обеспечив высвобождение любой инвертированной конъюнктивы, чтобы обеспечить правильное расположение ткани и заживление. Нанесите на глаз офтальмологическую мазь с антибиотиком местного действия.
3. Снимите пластырь с века 4–0 полиглактинового шва и сохраните шов на месте для использования для временной тарсоррафии. Проведите шов через край века нижнего века, через подкожную область снизу, и выходя через эпидермис. Завяжите шов с достаточным давлением, чтобы закрыть глаз.
4. Вводите послеоперационные анальгетики в соответствии с протоколами учреждения и рекомендациями Управления по уходу за животными. Разместите животное самостоятельно в отапливаемой клетке для восстановления после операции. Не кладите подстилку в клетку для восстановления, чтобы предотвратить случайную аспирацию.

Результаты

Пересечение зрительного нерва обычно приводит к апоптотической потере 80–90% поврежденных РГК в течение 14 дней после травмы. Описанная методика позволяет пересечь зрительный нерв с сохранением целостности оболочки зрительного нерва (рис. 1). Степень потери РГК сопоставима с традиционными моделями пересечения зрительного нерва и раздавливания зрительного нерва с тем преимуществом, что перерезанные нервные концы легко прикрепляются после пересечения описанным здесь методом (Рисунок 2). Повторное соединение перерезанных концов зрительного нерва таким образом позволяет оценить регенерацию аксонов RGC в модели пересечения, обеспечивая субстрат, на котором аксоны могут расти, и без необходимости микрохирургических манипуляций для повторного соединения перерезанных нервных концов (Рисунок 3). Антероградное отслеживание аксонов RGC с субъединицей B (CTB) холерного токсина показывает, что положительные аксоны CTB полностью пересекаются после транссекции зрительного нерва, сохраняющей оболочку (рис. 4). Сохранение оболочки зрительного нерва при пересечении зрительного нерва также создает замкнутое пространство, в которое исследуемые материалы, такие как нейротрофические факторы или клетки, могут доставляться к поврежденным аксонам РГК и поддерживаться в нужном положении (рис. 5). На начальных этапах обучения ожидается 60-70% успеха полного пересечения. С опытом успешность тотального пересечения составляет примерно 90-95%.

Рисунок 1: Пересечение зрительного нерва с сохранением оболочки зрительного нерва. (А) Изображение операционного поля, демонстрирующее обнажение интактного зрительного нерва до пересечения. (B) Изображение зрительного нерва после пересечения. Тонкая стеклянная пипетка прокалывала оболочку зрительного нерва в месте пересечения и доставляла клеточную суспензию (мутный раствор) в пространство между концами зрительного нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Потеря ганглиозных клеток сетчатки после пересечения зрительного нерва с сохранением оболочки зрительного нерва. Репрезентативные плоские участки цельной сетчатки из глаз с (А) интактным зрительным нервом, (В) оболочкой зрительного нерва, сохраняющей пересечение зрительного нерва, (В) традиционной транссекцией зрительного нерва или (D) размранением зрительного нерва за 14 дней до этого были иммуномечены на гамма-синуклеин (SNCG). Изображения были получены с флуоресцентного микроскопа с использованием 10-кратного объектива, скорректированы на затенение и сшиты для получения одного изображения. Потеря тел ганглиозных клеток сетчатки (РГК) по всей сетчатке была очевидна в поврежденных глазах. Вставки показывают изображения сетчатки с более высоким увеличением и демонстрируют значительную потерю РГК после повреждения зрительного нерва. (E) Количественная оценка выживаемости РГК демонстрирует значительную потерю РГК после повреждения зрительного нерва по сравнению с контрольными интактными зрительными нервами. *p< 0,05 по сравнению с интактными; односторонний ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. n = 3 животных в группе; полосы погрешностей представляют собой SD. SP-ONT, транссекцию зрительного нерва с сохранением оболочки; ONT, пересечение зрительного нерва; ONC, раздавливание зрительного нерва. Масштабные линейки = 1 000 μм. Масштабные линейки на врезках = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Участки зрительных нервов после повреждения зрительного нерва. Репрезентативные изображения продольного разреза через зрительные нервы через 14 дней после (A-C) пересечения оболочки зрительного нерва с сохранением оболочки, (D-F) традиционной транссекции зрительного нерва или (G-I) раздавливания зрительного нерва. (А,Г,Г) Иммуномаркировка глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) определяет степень поражения, в то время как маркировка ДНК (B,E,H) 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) демонстрирует непрерывную клеточность по всей длине зрительного нерва и в пределах места поражения. (К,Ж,И) Объединенные изображения, демонстрирующие локализацию GFAP-положительной нервной ткани и клеточности в месте поражения. Масштабные линейки = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Разрез зрительного нерва, следующий за оболочкой зрительного нерва, сохраняющий пересечение зрительного нерва. Репрезентативные изображения продольного среза через зрительный нерв через 14 дней после пересечения оболочки зрительного нерва с сохранением пересечения с антероградной трассировкой аксонов с интравитреальной инъекцией субъединицы B (СТБ) холерного токсина. (А) Может наблюдаться полное поражение меченых СТБ аксонов РГК, идущих от глазного яблока (слева) к мозгу (справа). (B) Иммуномечение глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) очерчивает обширное поражение, которое охватывает весь диаметр зрительного нерва. (C) Мечение ДНК 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) демонстрирует клеточность в месте поражения. (D) Объединенное изображение, демонстрирующее локализацию меченных CTB аксонов, GFAP-положительной нервной ткани и клеточности в месте поражения. Масштабные линейки = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Продольный срез пересеченного зрительного нерва, в который был введен клеточный трансплантат. Репрезентативные изображения продольного среза через зрительный нерв через 14 дней после пересадки оболочки зрительного нерва с сохранением пересечения и трансплантации нейральных стволовых клеток (НСК), экспрессирующих флуоресцентный белок tdTomato. (А) Иммуномечение глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) продемонстрировало полное разделение пересеченных концов зрительного нерва. (B) НСК, экспрессирующие tdTomato, содержались в пространстве, созданном описанной техникой, и продолжали выживать после трансплантации. (В) Трансплантированные НСК были непосредственно прикреплены к обоим разрезам концам пересеченного зрительного нерва. Масштабные линейки, 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Хирургические процедуры, описывающие модель пересечения зрительного нерва, были опубликованы ранее⁶. Тем не менее, методы, описанные в этих протоколах, включают в себя разрезание менингеальной оболочки для пересечения зрительного нерва. Кроме того, для оценки регенерации аксонов РГК в предыдущих моделях пересечения требовались сложные микрохирургические манипуляции, направленные либо на прикрепление перерезанных концов зрительного нерва, либо трансплантата периферического нерва к культе проксимального отдела зрительного нерва^10,13. Описанный здесь протокол минимально нарушает оболочку зрительного нерва при пересечении зрительного нерва и позволяет оценить регенерацию аксонов RGC в модели транссекции без необходимости технически сложных микрохирургических манипуляций.

В этом протоколе критически важно выполнить несколько шагов. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить глазную артерию и сосудистую сеть, снабжающую диск зрительного нерва. Поэтому шаг 5.1 должен быть выполнен не менее чем на 1,5-2,0 мм позади глазного яблока. Если происходит повреждение глазной артерии и нарушается кровоснабжение сетчатки, глаз следует исключить из дальнейших экспериментов, так как за этим может последовать фтизиазия. Во время выполнения шагов 5.4-5.6 важно сохранить целостность оболочки зрительного нерва и свести к минимуму размер отверстия, через которое стеклянная пипетка входит в зрительный нерв. При этом вокруг наконечника пипетки образуется плотное уплотнение, уменьшающее рефлюкс жидкости и обеспечивающее создание достаточного гидростатического давления для пересечения зрительного нерва. Скос кончика стеклянной пипетки улучшит легкость, с которой пипетка проникает в зрительный нерв, не вызывая сопутствующего ущерба.

Существуют потенциальные изменения, которые операторы могут внести для улучшения доступности этого метода. Описанные процедуры предполагают минимальное рассечение и удаление орбитальной ткани с сохранением лицевого и тройничного нерва. В то время как это снижает заболеваемость и риск кровотечения, такие ткани, как орбитальный жир и слезная железа, могут ограничивать визуализацию критически важных структур. Осторожное удаление ткани, препятствующей операционному полю, может потребоваться для улучшения визуализации, особенно у пожилых животных. Латеральный подход также может быть использован для улучшения доступа к зрительному нерву. Тем не менее, латеральная диссекция может привести к повреждению дополнительных структур, включая тройничный нерв, является более сложной и может создавать собственные проблемы для направления инструментов для инъекций.

Возможным ограничением данного метода является невозможность непосредственно манипулировать зрительным нервом и полностью визуализировать весь перерез. Поэтому существует вероятность неполного рассечения. Тем не менее, мы заметили, что визуальное подтверждение отделения нервных окончаний на этапе 5.8 является надежным индикатором успешной и полной транссекции. Если нервные окончания не отделяются, изменение положения инъекционной пипетки или увеличение давления инъекции на 50% должно обеспечить достаточную силу для полного пересечения нерва.

По отношению к существующим методам такой подход позволяет сохранить целостность оболочки зрительного нерва. Сохраняя целостность оболочки зрительного нерва, концы пересеченного зрительного нерва не подвергаются воздействию орбитальной среды и периферической иммунной системы, тем самым ограничивая воздействие иммунных факторов, которые потенциально могут влиять на реакции РГК. Кроме того, сохранение целостности оболочки зрительного нерва при пересечении зрительного нерва создает замкнутое физическое пространство, ограниченное концами зрительного нерва и оболочкой зрительного нерва. Локализованная доставка нейротрофических факторов, клеток или полимеров в аксональный компартмент поврежденных РГК может быть достигнута путем инъекции во вновь образованное пространство. ¹⁴ В качестве альтернативы, регенерация аксонов RGC может быть оценена в модели пересечения путем анастомизации пересеченных концов зрительного нерва без необходимости применения сложных микрохирургических методов.

Применение этого метода включает оценку поврежденного аксонального компартмента RGC с помощью специфических для аксонов вмешательств для выявления путей, ответственных за дегенерацию аксонов, и предотвращения потери аксонов после травмы при пересечении. Кроме того, этот метод делает исследования регенерации аксонов RGC в модели пересечения доступными для более широкого исследовательского сообщества, устраняя необходимость в технически сложных процедурах анастомозов зрительного нерва. Вмешательства, направленные на стимуляцию регенерации аксонов РГК, могут быть оценены с помощью этой модели тяжелой травмы и обеспечить стабильные и воспроизводимые результаты, не беспокоясь о сохраненных аксонах.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL