Трансплантация внутримякардных инъекций MSC-Loading инъекционных гидрогелей после инфаркта миокарда в модели Murine

Резюме

Терапия на основе стволовых клеток стала эффективной стратегией восстановления поврежденных сердечных тканей после инфаркта миокарда. Мы обеспечиваем оптимальное применение in vivo для трансплантации стволовых клеток с использованием желатиновых гидрогелей, которые могут быть энзиматично взаимосвязаны.

Аннотация

Одной из основных проблем, стоящих перед текущей сердечной терапии стволовыми клетками для предотвращения постинфарктной сердечной недостаточности является низкая задержка и выживаемость пересаженных клеток в рамках травмированного миокарда, ограничивая их терапевтическую эффективность. В последнее время использование строительных биоматериалов привлекло внимание к улучшению и максимизации терапии стволовыми клетками. Цель этого протокола заключается в внедрении простого и простого метода трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (MSCs) с использованием инъекционных гидроксифенилпионовой кислоты (GH) гидрогелов; гидрогели являются благоприятными в качестве платформы доставки клеток для сердечной ткани инженерных приложений из-за их способности быть взаимосвязаны на месте и высокой биосовместимости. Мы представляем простой метод для изготовления MSC-загрузки гидрогели GH (MSC/гидрогели) и оценки их выживания и распространения в трехмерной (3D) культуре in vitro. Кроме того, мы демонстрируем методику внутримиокардной трансплантации MSC/гидрогели у мышей, описывающую хирургическую процедуру для индуцирования инфаркта миокарда (МИ) через перевязку коронарной артерии левой передней части (LAD) и последующую трансплантацию MSC/hydrogels.

Введение

Терапия стволовыми клетками сердца стала потенциальным подходом к ремонту и регенерации миокарда^1,2. Несмотря на недавние положительные результаты в животных моделях и клинических испытаниях, применение терапии на основе стволовых клеток для восстановления миокарда ограничено из-за низкого удержания и плохого выживания инъекционных клеток в инфарктных тканях^{сердца 3,4}. В результате, использование клеточной инженерии тканей, в том числе инъекционных^{биоматериалов 5},^{сердечные пятна 6}, и^{клеточные листы 7}, был интенсивно изучен для улучшения удержания клеток и интеграции в принимающей миокарда.

Среди различных потенциальных подходов к биоинженерной сердечной ткани ремонт, инъекционные гидрогели в сочетании с соответствующими типами клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), эмбриональных стволовых клеток (ESCs), и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), являются привлекательным вариантом для эффективной доставки клеток в миокарда^{регионах 8,9}. Gelatin, известный натуральный полимер, может быть использован в качестве инъекционной матрицы из-за его большой биосовместимости, значительной биоразлагаемости и снижения иммуногенности по сравнению с широким спектром биоматериалов, используемых в биомедицинских приложениях. Хотя инъекционные платформы на основе желатина имеют большой потенциал, их применимость in vivo остается ограниченной в зависимости от их низкой механической жесткости и легкой деградируемости в физиологической среде.

Для преодоления этих ограничений для применения in vivo была предложена новая и простая конструкция гидрогеля на основе желатина, состоящего из гидроксифенил-пропионовой кислоты. Конъюгирует желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) может быть взаимосвязана на месте в присутствии фермента, пероксидазы хрена (HRP), а затем инкапсулировать различные препараты, биомолекулы, или клетки в гидрогеле, предлагая большой потенциал в^{области тканевой инженерии приложений 10,11,12,13,14}. Кроме того, мы недавно исследовали терапевтические эффекты гидрогели GH, содержащие инкапсулированные MSCs и продемонстрировали их использование в успешном ремонте сердца и регенерации после MI в модели^{murine 15}. В этом протоколе мы описываем простой метод инкапсуляции и трехмерного (3D) распространения ПМС в гидрогелях GH. Мы также вводим хирургическую процедуру, предназначенную для генерации модели murine MI с помощью перевязки коронарных артерий и внутримиокардной трансплантации гидрогеля MSC-загрузки GH в инфарктное сердце.

протокол

Все процедуры исследования животных были предоставлены в соответствии с Законом о защите лабораторных животных, Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и Руководящими принципами и политикой экспериментов на грызунах, предоставленными Комитетом по институциональному уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Католического университета Кореи.

1. Подготовка MSCs и инъекционных гидрогелей желатина

1. Культура MSCs в 100 мм культуры блюдо при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂. Когда рост MSCs достигает 80% слияния, мыть блюдо дважды с DPBS и добавить 1 мл трипсина-заменителя при 37 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MSCs были изолированы от мурин костного^{мозга после обычных процедур 16}, культурных в Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM), содержащий 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика антимикотического раствора, и используется между проходом 7'u20129 для этого исследования.
2. Добавьте 9 мл среды культуры и центрифугу при 500 x g в течение 3 мин. Затем отбросьте полученный супернатант, повторно помеская клетки в 1 мл PBS, и поддерживайте подвеску клетки на льду.
3. Разбавить 10 МКЛ клеточной подвески с 10 МКЛ трипан синий и получить концентрацию клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
4. Повторное приостановление и передача MSCs в 1 мл трубки при плотности 1 х 10⁷ клеток / мл.
5. Подготовьте 6,25 wt% GH конъюгированных растворов в PBS и разделите на 2 флакона. Далее смешайте решения GH либо с 6 мкг/мл HRP (GH-решение A), либо с 0,07 вт% H₂O₂ (GH-решение B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) конъюгации в соответствии^{с опубликованными протоколами 12,15}.
   1. Держите 9:1 объемное соотношение GH конъюгированных решение HRP (GH решение A) и GH конъюгации решение H₂O₂ (GH решение B), соответственно.
6. Перед смешиванием MSCs с раствором GH A, кратко центрифуга клеточной подвески на 1000 х г и тщательно аспирировать в результате supernatant. Впоследствии смешайте гранулы, содержащие MSCs, с решением A.

2. На месте MSC-загрузка и трехмерная культура in vitro

1. Загрузите GH-решение A (содержащее MSC) и GH-решение B в обе стороны двойного шприца. Плита 300 МКЛ комбинированных решений GH с MSCs при конечной плотности 5 х 10⁶ ячеек/мл на восьми-хорошо камерный слайд.
2. После формирования гидрогеля на месте и последующей инкапсуляции MSC с помощью энзиматических перекрестных ссылок добавьте 700 МЛ DMEM, содержащий 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотический раствор.
3. Инкубировать слайд при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂ и заменить культуру среды каждые 2'u20123 дней.

3. Подтверждение пролиферации in vitro и выживания MSCs в гидрогелях GH

1. Чтобы определить жизнеспособность 3D культурных MSCs в гидрогели GH, используйте живой / мертвой клетки окрашивания анализ после предопределенного времени инкубации.
2. После инкубации инкапсулированных MSCs в гидрогелях GH в течение 3, 5, 7 или 14 дней, аспирировать средний и мыть хорошо дважды с PBS.
3. Подготовь окрашивающий раствор, содержащий 5 МКЛ кальцеина AM и 20 МКЛ этидийного гомодимера-1 (EthD-1) в 10 мл DPBS.
4. Добавьте 200 МКЛ раствора окрашивания в колодец и инкубировать в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.
5. Аспирировать окрашивание раствор и мыть хорошо дважды с PBS.
6. Аккуратно отделяйте камеру от горки и поместите полную крышку над гидрогелями GH. Используйте конфокаленную микроскопию для визуализации степени пролиферации и морфологических изменений инкапсулированных MSC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные изображения были приобретены под 200x увеличение и изображены на возбуждение / выброс длин волн 470/540 нм для кальцина и 516/607 нм для EthD-1.

4. Индукция инфаркта миокарда у мышей

1. Обезболить 7-недельного самца C57BL/6 мышей (20-201222 г) с внутриперитонеальной инъекцией смеси золетил (30 мг/кг) и Ромпуна (10 мг/кг) в солевом растворе.
2. Перед операцией, depilate груди мыши с помощью крема для удаления волос и стерилизовать кожу с йодом.
3. Поместите мышь на операционный стол и используйте, вставив катетер в трахею, чтобы обеспечить дополнительный кислород через механическую вентиляцию.
4. Аккуратно прорезать кожу хирургическими ножницами, а затем проникнуть в межреберные мышцы микро ножницами. Отделяйте 2-е и 3-е левые ребра, используя 5-0 шелковый шов для поддержания открытой грудной полости.
5. Тщательно ligate левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии с помощью держателя иглы с 8-0 полипропиленовый шов и вырезать шов с помощью электрокаутерии.
6. Наблюдайте немедленное изменение цвета в передней левой желудочковой стенке.

5. Интрамиокарда трансплантации MSC-загрузки GH гидрогели

1. После индуцирования инфаркта миокарда по перевязки LAD, ввимите 10 МКЛ растворов MSC-загрузки GH в две разные точки в зоне пересечения границы (всего: 2 x 10⁵ MSCs/20 L) с помощью двойного шприца, оснащенного иглой 26G.
   1. Следуя той же процедуре, описанной в шаге 1, подготовьте и перенесите решения MSC-loading GH в двойной шприц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки engraftment MSC-загрузки ГХ гидрогели в пределах infarcted области, MSCs и GH конъюгации были предварительно помечены PHK26 и фторсейна изотиоцианат (FITC), соответственно.
2. Восстановить открытую полость грудной клетки и закрыть мышцы и кожу с помощью 5-0 швов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед закрытием грудной клетки удалите воздух с помощью катетерного шприца.
3. Удалите трахею трубки и поместите мышь в клетку под инфракрасной лампой во время восстановления.
4. При послеоперационной анальгезии вводят подкожные инъекции кетопрофена (5 мг/кг в день) не менее 72 ч. Все мыши должны быть тщательно проверены в течение соответствующего времени, чтобы обеспечить надлежащее восстановление после хирургических процедур, а также адекватное лечение боли.

6. Эхокардиография

1. Через четыре недели после трансплантации, первоначально анестезировать мышь с 5% изофлюран, а затем настроить концентрацию изофлюрана до 1%.
2. Депилировать грудь с помощью крема для удаления волос и поместить мышь на грелку. Нанесите ультразвуковой трансдуцерный гель на грудную клетку.
3. Приобретайте двухмерные парастеральные короткие виды оси и записыв трассировки M-режима на уровне папиллярной мышцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите линейный предуцер массива (7'u201215 МГц) в левой парастральной линии и просмотрите анатомические структуры.
4. Измерьте соответствующие линии для LVAW, LVID и LVPW, чтобы получить толщину сердечной стенки, размер камеры и дробное сокращение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните сердечную функцию, включая фракцию выброса (EF), дробное сокращение (FS) и энд-систолический объем (ESV) на уровне папиллярной мышцы, чтобы обеспечить надлежащую оценку в том же анатомичном месте.

7. Гистологическая оценка

1. В заранее определенное время после трансплантации MSC-загрузки ГХ гидрогели в infarcted сердце, усытворить мышь в камере CO₂ и собрать сердце для гистологического анализа¹⁵.
2. Для окрашивания гематоксилина и эозин (Н И Е) и трихрома Массона (МТ) зафиксировать расчлененные ткани сердца в 4% параформальдегиде (PFA) и встроить в парафин. Далее, вырезать парафин встроенных блоков сердца на 4 мкм серийных разделов с помощью микротомы и пятно разделов с пятном МТ в соответствии со стандартными^{протоколами 17}.
3. Приобретайте изображения на сканере слайдов при 20-м увеличении и вычисляйте размер инфаркта групп лечения.
   Размер инфаркта (%) - общая окружность инфаркта / общая окружность LV x 100
4. Рассчитайте оба окружности путем измерения средней линии длины. Для LV средней окружности, измерить центральную длину между эндокарда и эпикардиальных поверхностей. Для средней линии инфаркта, измерить длину инфаркта, включая более 50% от всей толщины миокарда¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все анализы изображений были проведены с использованием программного обеспечения ImageJ.
5. Измерьте толщину стенки шрама на уровнях сосоляных мышц.
6. Рассчитайте фракцию коллагеновой области.
   Область коллагена (%) - общая площадь интерстициального фиброза/миоцитов x 100

Результаты

Для эффективной доставки MSC к инфаркту миокарда в этом протоколе использовались кросс-связуемые гидрогели MSC-загрузки на месте. До трансплантации in vivo, распространение и выживание MSCs в гидрогелях GH были подтверждены 3D in vitro живой /мертвой клетки окрашивания анализа (живо...

Обсуждение

Инъекционные гидрогели GH имеют большой потенциал для in vivo приложений из-за их способности однородно включать различные терапевтические агенты на месте. Кроме того, их физическими и биохимическими свойствами можно легко манипулировать на основе потребностей, зависящих от болезней. В э...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430