JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем документе приводится подробное описание того, как построить животное модель анхепатической фазы (ишемия печени) у крыс, чтобы облегчить фундаментальные исследования ишемии-реперфузии травмы после трансплантации печени.

Аннотация

Ортопедическая трансплантация печени (OLT) у крыс является проверенной и проверенной моделью животных, используемой для предоперационных, интраоперационных и послеоперационных исследований, включая ишемию-реперфузию (ИРИ) внегепатических органов. Эта модель требует многочисленных экспериментов и устройств. Продолжительность анхепатической фазы тесно связана со временем развития ИРИ после трансплантации. В этом эксперименте мы использовали гемодинамические изменения, чтобы вызвать экстрагепатические повреждения органов у крыс и определили максимальное время толерантности. Время до самой тяжелой травмы органа варьировалось для различных органов. Этот метод можно легко воспроизвести, а также может быть использован для изучения ИРИ внегепатических органов после трансплантации печени.

Введение

Ишемия-реперфузия травмы (ИРИ) является распространенным осложнением после трансплантации печени. Печеночная ИРИ является патологическим процессом, включающим ишемию опосредованное повреждение клеток и ненормальное ухудшение реперфузии печени. Печеночная ИРИ и местный врожденный иммунный ответ можно разделить на горячие и холодные ИРИ, в соответствии с различиями в клиническойсреде 1. Горячая ИРИ вызвана травмой стволовых клеток, как правило, в результате трансплантации печени, шока и травмы2. Холодный ИРИ является осложнением трансплантации печени, вызванной эндотелиальных клеток и периферической циркуляции3. Клинические отчеты показали, что печеночная ИРИ связана с 10% ранних отказов органов и может увеличить заболеваемость острым и хроническимотторжением 4,5. Кроме того, печеночная ИРИ может также вызвать синдромы множественной дисфункции органов или синдром системной воспалительной реакции, с высокойсмертностью 6. Пациенты с экстрагепатической участия органа, как правило, остаются дольше в больнице, тратить больше денег, и хуже прогноз7. Развитие осложнений тесно связано с продолжительностью анхепатической фазы трансплантации печени8.

Ортотопическая трансплантация печени (OLT) у крыс была впервые зарегистрирована американским профессором Ли в 1973 году. Экспериментальная операция смоделировала этапы клинической трансплантации печени и анатомоза кровеносных сосудов и общего желчного протока (КБР) с использованием шовного метода. Процедура трудна и занимает много времени с низким уровнем успеха9. В 1979 году Kamada и др. сделал значительное улучшение OLT у крыс, творчески используя "двух-манжеты метод" для анатомоза портала вены для управления анхепатической фазы в течение 26 минут10. В том же году Циммерманн предложил «метод единого желчного стента». На основе работы Ли Циммерманн использовал полиэтиленовые трубки для непосредственной анатомозы КБР донора и реципиента, упростил реконструкцию КБР и сохранил функцию сфинктера, и этот метод стал стандартом для желчной реконструкцииOLT-моделей 11. В 1980 году Miyata et al. предложили «метод с тремя манжетами», в котором порталная вена (PV), супрагепатическая кава вены (SVC) и внутрицепатическая кава вены (IVC) были анастомозированы методом манжеты. Тем не менее, существует риск искажения канюлы с помощью этого метода, который может привести к обструкции нижней вены кавы рефлюкс12. В 1983 году «метод двух наручников» был предложен с использованием метода манжеты для анатомоза фотоэлектрических и IVC, но принятие метода шва для SVC13. Этот метод был принят учеными во всем мире для создания OLT-моделей. С тех пор, манжеты анатомоз шаги были улучшены, чтобы сократить анхепатической фазы и улучшить выживаемость крыс14. Аналогичным образом, улучшенные методы используются в клинической практике, чтобы сократить анхепатическойфазы 15. Однако фундаментальные исследования ИРИ после трансплантации печени показали, что выживаемость обратно связана со степенью повреждения внегепатических органов. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, и для имитации ИРИ после трансплантации печени необходима простая и воспроизводимая модель животных.

Основываясь на определении анхепатической фазы, мы смоделировали гемодинамические изменения в трансплантации печени, в результате чего ИРИ экстрагепатических органов у крыс. В этом случае мы предоставляем подробное описание того, как построить животное модель анхепатической фазы (ишемия печени) у крыс, чтобы облегчить фундаментальные исследования иРИ после трансплантации печени.

протокол

Комитет по этике животных одобрил эксперимент Гуанси-Медицинского университета (No20190920). Все животные были поставлены Центром экспериментов на животных Гуанси медицинского университета. Мы использовали SPF мужчин Sprague Доули крыс (200-250 г, 10-12 недель), хранится под комнатной температурой 25 ± 2 градусов по Цельсию и влажность 50 ± 10%. Кормление было прекращено за 24 часа до операции; однако вода была обеспечена.

ПРИМЕЧАНИЕ: Один оператор может выполнять все операции без микрохирургии или хирургического микроскопа.

1. Операция

  1. После взвешивания, анестезировать крыс с изофлюран (5%) с помощью аппарата анестезии животных.
  2. Через 1-2 минуты аккуратно зажимите пинцетом цыоцы крысы. Если крыса не реагирует после щипать, она вступила в состояние анестезии. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость. Используйте лампы для обогрева животных, чтобы поддерживать температуру тела крыс на уровне 37-38 градусов по Цельсию.
  3. После дезинфекции брюшной полости (раствор йода пувидона) закрепните крысу на столе для вскрытия животных. Сделайте средний разрез на 3 см ниже процесса xiphoid с помощью типсов и ножниц.
  4. Откройте брюшную полость, разоблачите печень с помощью ретрактора и мобилизуйте гепатогастрическую связку. Используйте ватные тампоны, чтобы аккуратно перевернуть среднюю долей печени и повернуть ее вверх, чтобы разоблачить порта hepatis. Определите КБР,. и HA.
  5. Нажмите тонкой кишки к левой нижней брюшной полости с помощью ватных тампонов, покрыть его влажной марлей, и переместить внутрицепочечных кавы вену правой почечной вены.
  6. Изолировать портальной вены, печеночной артерии, и нижней ены кавы выше правой почечной вены с внутриглазной линзы и миппы отмечены 3-0 шелковой нитью, каждый со скольжением узла.
  7. Разрежьте кожу левой и правой нижних конечностей и выставить бедренную вену с помощью офтальмологических типсов. Медленно введать низкий молекулярный вес гепарина 625 МЕ/кг через бедренную вену, чтобы гепаринизировать все тело.
  8. Ligate вены портала, печеночным артерии, и нижней вены кавы выше правой почечной вены с No 3-0 швов, продолжительностью 45 минут(рисунок 1). Замените тонкий кишечник в брюшной полости и накройте его марлей. Уменьшить ингаляционную анестезию в эти периоды.
  9. Через 45 минут отпустите порталную вену, печеночную артерию и нижняя вена кавы выше правой почечной вены.
  10. Шов мышцы и кожи, слой за слоем, и прекратить ингаляционную анестезию. Обеспечить послеоперационную анальгезию с использованием подкожного морфина 5 мг/кг каждые 4 часа.
  11. Наблюдайте за крысой до тех пор, пока она не проснется и не покормите ее при температуре 25 ± 2 градуса по Цельсию и влажности 50 ± 10%. Необходимы лампы для обогрева животных.

Результаты

Толерантность крыс к ишемии печени
В этой модели животных, сайты, на которых кровеносные сосуды были лигатированы во время работы показаны на рисунке 1. Крысы были случайным образом разделены на 5 групп для ишемии в течение 15 минут (I15 группы), 30 минут (I30 группы), ...

Обсуждение

OLT у крыс является идеальной моделью для изучения сохранения органов в области трансплантации печени, ИРИ, отторжения трансплантата, иммунной толерантности, патологии трансплантации и фармакологии, гомотрансплантации и ксенотрансплантации. В настоящее время он широко используется в ...

Раскрытие информации

Авторы этой рукописи не имеют конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы отметить полезные предложения д-ра Вэнь-тао Ли и д-ра Цзи-хуа Ву из Второй аффилированной больницы Гуанси-Медицинского университета. Авторы хотели бы поблагодарить наших товарищей по команде за полезные комментарии и дискуссии. Авторы также хотели бы поблагодарить анонимных рецензентов и редакторов JoVE за их комментарии. Особая благодарность должна идти к родителям доктора Yuan для их непрерывной поддержки и ободрения. Работа была поддержана Фондом естественных наук Нинбо (2014A610248).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde solutionShanghai Macklin Biochemical Co.,LtdP804536
air drying ovenShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanine aminotransferase (ALT)KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K235-S
ammoniaSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10002118
amylase KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K005-M
anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd100092183
Animal anesthesia machineShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
aspartate aminotransferase (AST)kitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
automatic biochemical analyzer.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (when nessary)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
CentrifugeBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
cover glassJiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd10212432C
creatinine KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
dewatering machineHungary 3DHISTECH Co.,LtdDonatello Series 2
embedding machineHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
frozen machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
hematoxylin-eosin dye solutionWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
high-efficiency paraffin waxShanghai huayong paraffin wax co., LtdQ/YSQN40-91
hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
intraocular lens (IOL)forcepsGuangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd—
micro Scissors(when nessary)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
needle holdersShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
neutral gumShanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.—
normal optical microscopeNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJ3CO30straight
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJD1060bending
ophthalmic ScissorsShanghai Surgical Instrument FactoryJ1E0
pathological slicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
pipettesDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.7010101008
retractorsBeijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.JNT-KXQ
scannerHungary 3DHISTECH Co.,LtdPannoramic 250
slideWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
xyleneSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7

Ссылки

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены