JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из образцов крови и биопсии кишечника, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для секвенирования следующего поколения, производительность запуска NGS и анализ основных данных.

Аннотация

Иммунологическая память, отличительная черта адаптивного иммунитета, управляется Т- и В-лимфоцитами. В кровообращении и различных органах существуют миллиарды уникальных клонов Т- и В-клеток, и каждый из них может связывать определенный антиген, что приводит к пролиферации, дифференцировке и / или секреции цитокинов. Огромная гетерогенность т- и в-в-клеток порождается случайной рекомбинацией различных генетических сегментов. Технологии секвенирования следующего поколения (NGS), разработанные в последнее десятилетие, позволяют беспрецедентно глубоко взглянуть на иммунный репертуар рецепторов Т- и В-клеток. Исследования различных воспалительных состояний, иммунодефициентов, инфекций и злокачественных новообразований продемонстрировали заметные изменения в клональности, использовании генов и биофизических свойствах иммунного репертуара, предоставляя важную информацию о роли адаптивных иммунных реакций при различных расстройствах.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для NGS иммунного репертуара Т- и В-клеток из крови и тканей. Мы представляем конвейер, начиная от выделения ДНК через подготовку библиотеки, секвенирование на секвенсоре NGS и заканчивая базовыми анализами. Этот метод позволяет исследовать специфические Т- и В-клетки на нуклеотидном или аминокислотном уровне и, таким образом, может идентифицировать динамические изменения в популяциях лимфоцитов и параметры разнообразия при различных заболеваниях. Этот метод медленно входит в клиническую практику и имеет потенциал для идентификации новых биомаркеров, стратификации риска и точной медицины.

Введение

Адаптивная иммунная система, состоящая из Т- и В-лимфоцитов, использует иммунологическую память для распознавания ранее встречавщегося антигена и инициирования быстрого ответа. Лимфоциты генерируются в костном мозге и созревают в тимусе (Т-клетки) или костном мозге (В-клетки). Как рецептор Т-клеток (TCR), так и рецептор B-клеток (BCR) демонстрируют уникальные конфигурации, которые позволяют распознать специфические антигены. В гомеостазе Т- и В-клетки постоянно циркулируют и исследуют триллионы различных пептидов, представленных на антигенпрезентирующих клетках. TCR или BCR лигирование специфического антигена с высоким сродством вместе с соответствующей костимуляцией приводит к активации клеток, что приводит к секреции цитокинов, клональной экспансии и генерации антител, в случае В-клеток.

Огромный массив различных Т- или В-клеток в совокупности называется иммунным репертуаром, что позволяет распознавать бесчисленное множество различных эпитопов. Для того, чтобы сформировать такой обширный репертуар, происходит сложный процесс случайной сборки различных сегментов генов, создавая почти бесконечные комбинации рецепторов, которые могут связывать уникальные антигены1. Этот процесс, называемый рекомбинацией V(D)J, включает в себя перегруппировки различных переменных (V), разнообразия (D) и соединения (J) генов, сопровождающиеся случайными делециями и вставками нуклеотидов в соединения2.

Архитектура адаптивной иммунной системы интересует ученых в разных областях на протяжении многих десятилетий. В прошлом секвенирование Сэнгера, комплементарное определение области 3 (CDR3) спектротипирование и проточная цитометрия использовались для характеристики иммунного репертуара, но обеспечивали низкое разрешение. В последнее десятилетие достижения в методах секвенирования следующего поколения (NGS) позволили глубоко понять характеристики и состав репертуаров TCR и BCR человека3,4. Эти высокопроизводительные системы (HTS) последовательно и обрабатывают миллионы перестроенные продукты TCR или BCR одновременно и позволяют проводить анализ с высоким разрешением конкретных Т- и В-клеток на уровне нуклеотидов или аминокислот. NGS предоставляет новую стратегию для изучения иммунного репертуара как в здоровье, так и в болезни. Исследования с использованием HTS продемонстрировали измененные репертуары TCR и BCR при аутоиммунных заболеваниях5,первичных иммунодефициозах6,7и злокачественных новообразованиях, таких как острый миелоидный лейкоз8. Используя NGS, мы и другие показали олигоклональное расширение специфических Т- и В-клеточных клонов у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), включая язвенный колит и болезнь Крона9,10,11,12,13,14. В целом, исследования из разных областей показывают, что изменения в репертуаре играют решающую роль в патогенезе иммуноопосредованных расстройств.

Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из биопсии кишечника и крови, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для NGS и выполнение секвенирования. Мы также предоставляем основные этапы анализа данных иммунного репертуара. Этот протокол также может применяться для генерации библиотек TCRα, TCRγ и IGL. Метод также совместим с другими органами (например, лимфатическими узлами, опухолями, синовиальной жидкостью, жировой тканью и т. д.), если используются тканеспецифические протоколы пищеварения.

протокол

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом в Медицинском центре Шиба, и было получено информированное письменное согласие от всех участвующих субъектов.

1. Выделение и количественная оценка ДНК

  1. Пищеварение и лизис клеток биопсии кишечника
    1. Извлеките биопсии кишечника, либо свежевыбранные, либо хранящиеся при -20 °C или -80 °C. Если используют замороженные биопсии, оттаивайте на льду.
    2. Добавьте 600 мкл раствора лизиса ядер в стерильную микроцентрифужную трубку 1,7 мл, охлажденный на льду.
    3. Поместите биопсию в микроцентрифужную трубку с раствором лизиса и инкубируют при 65 °C в течение 15-30 мин.
    4. Добавьте 17,5 мкл 20 мг/мл протеиназы К и инкубируют в течение ночи при 55 °C, с легким встряхиванием.
    5. Дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение 5 мин, прежде чем перейти к шагу 1.3.
  2. Лизис клеток цельной крови
    1. Получить 3 мл цельной крови в ЭДТА-, гепарин- или цитратсодержащей пробирке.
    2. Осторожно раскачивают трубку до тщательного перемешивания и переложат кровь в стерильную центрифужную трубку 15 мл, содержащую 9 мл раствора лизиса клеток. Инвертировать несколько раз в течение 10-минутного инкубационного периода при комнатной температуре.
    3. Центрифугу при 2000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем выбросьте как можно больше супернатанта, не нарушая видимую белую гранулу. Останется примерно 50–100 мкл остаточной жидкости.
    4. Вихревую трубку энергично в течение 15 с до полного повторного суспендирований. Добавьте 3 мл раствора лизиса ядер и несколько раз пипетку. Раствор должен стать вязким.
  3. Осаждение белка
    1. Добавьте 200 мкл буфера осаждения белка в ткань или 1 мл в кровь. Вихрь энергично в течение 20 с и насиживающий на льду в течение 5 мин. Небольшие белковые сгустки могут быть видны после вихря.
    2. Центрифуга при 16 000 х г в течение 4 мин. Должна образоваться плотная гранула, содержащая осажденные белки.
    3. Осторожно перенесите супернатант, не нарушая гранулу, в новую трубку 1,7 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранулы не плотные, рассмотрите другую центрифугу при 16 000 х г в течение 4 мин.
  4. Осаждение и регидратация ДНК
    1. Добавьте 1 мл 2-пропанола в пробирку, содержащую надводный материал, и осторожно перемешайте путем инвертирования. ДНК должна стать видимой как белое плавающее вещество.
    2. Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант полностью с помощью пипетки.
    3. Добавьте 1 мл свежеприготовленного 70% этанола и несколько раз переверняйте пробирку. Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре. Осторожно выбрасывайте супернатант.
    4. Повторите шаг 1.4.3.
    5. Поместите открытую трубку перевернутой на чистую абсорбивную бумагу на 10-15 мин. Реинвертировать трубку и подтвердить полную гидратацию. При необходимости оставьте на воздухе-сухость еще на 10-15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы пеллеты полностью высохли.
    6. Добавьте 50 мкл сверхчистой воды (UPW). При необходимости ДНК может быть разбавлена больше после количественной оценки.
    7. Инкубировать в течение 1 ч на тепловом блоке при 65 °C, для регидратации ДНК.
  5. Количественная оценка ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК количественно оценивали с помощью флуорометра и назначенных реагентов, как указано в таблице материалов.
    1. Доведите стандарты до комнатной температуры и подготовьте комплект, включающий специальные трубки по 0,5 мл.
    2. Приготовьте буферную и красяную смесь в пробирке 15 мл, в зависимости от количества образцов. Добавьте 200 мкл буфера и 1 мкл красителя на образец. Включите 2 образца для стандартов. Рекомендуется рассчитать дополнительную выборку, чтобы избежать того, что буфера будет недостаточно.
      1. Для 2 стандартов поместите 190 мкл вышеприготовленной смеси в пробирку 0,5 мл. Добавьте 10 мкл стандарта.
      2. Для каждого образца поместите 199 мкл вышеприготовленной смеси в пробирку 0,5 мл. Добавьте 1 мкл ДНК.
    3. Ознакомьтесь с примерами. Результат указывает на концентрацию ДНК образца.
    4. Если образцы превысили лимит, разбавьте ДНК 1:10 с помощью UPW и повторите чтение.

2. Подготовка библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует мультиплексный набор для анализа на основе ПЦР, совместимый с секвенсорами NGS. Комплект содержит 24 различных индекса, каждый из которых ориентирован на сохраненные регионы врегионах V β и Jβ. Это позволяет проводить одношаговую реакцию ПЦР и объединение различных образцов. Подробности смотрите в таблице материалов.

  1. Подготовьте образцы ДНК. Получите 150 нг ДНК и добавьте UPW в общей сложности 5 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотечного приготовления можно использовать менее 150 нг ДНК с минимальной концентрацией 10 нг/мкл.
  2. Поместите пипетки и наконечники в капюшон с ультрафиолетовым светом на 15 минут, чтобы разрушить остаточную ДНК. Между тем, позволяют различным индексным пробиркам (для библиотечной подготовки) и ДНК-полимеразе оттаивать на льду.
  3. В биологической вытяжке добавьте 45 мкл из различных индексных пробирок в пробирки ПЦР. Для последующего добавьте 0,2 мкл ДНК-полимеразы и 5 мкл ДНК, приготовленной на этапе 2,1, в пробирки ПЦР.
  4. Запустите реакцию ПЦР с помощью предуставляемой программы, согласно инструкции производителя.

3. Очистка и количественная оценка ампликона

  1. Используйте магнитные шарики для удаления излишков праймеров, нуклеотидов и ферментов.
    1. Прогреть бусины не менее 30 мин до комнатной температуры. Приготовьте достаточно свежего 80% этанола для 400 мкл на образец.
    2. Добавьте 50 мкл (IGH) или 35 мкл (TCRβ) шариков в каждую трубку ПЦР и перемешайте путем пипетки 10 раз. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите смешанный образец на магнитную подставку на 5 мин.
    4. Аспират 95 мкл (IGH) или 80 мкл (TCRβ) прозрачной жидкости и выброса. Аспират оставшейся жидкости с использованием наконечника 10 мкл.
    5. Добавьте 200 мкл 80% этанола к каждому образцу. Инкубировать 30 с. Аспират 195 мкл этанола и выброс. Аспират оставшейся жидкости с использованием наконечника 10 мкл.
    6. Повторите шаг 3.1.5. Откройте колпачки трубок и дайте воздуху высохнуть в течение 5 минут.
    7. Сразу через 5 мин вынимают из магнитного стенда и добавляют 25 мкл буфера элюдения (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0). Перемешать путем пипетки до однородного уровня. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
    8. Поместите трубки на магнитную подставку на 5 мин. Перенесите 22 мкл в новую ПЦР-трубку. Измерьте концентрацию ДНК (шаг 1.5).
  2. Количественная оценка ампликона
    ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует автоматизированную машину электрофореза для контроля качества концентрации, размера и целостности ДНК. Подробности смотрите в таблице материалов.
    1. Поместите реагенты и просеивку при комнатной температуре не менее 30 мин.
    2. В новой микроцентрифужной трубке объемом 1,7 мл сделайте разбавление образцами ДНК, количественно оцененными на этапе 3.1.8, 1,8 с UPW для общего объема не менее 3 мкл.
    3. Вихрь разбавляет ДНК перед использованием. Поместите 2 мкл буфера вместе с 2 мкл разбавленной ДНК в предварительно меченые специализированные полоски ПЦР (входят в комплект) и поместите колпачки. Поместите на шейкер на 1 мин, после чего открутите ПЦР-полоски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вязкости буфера убедитесь, что избыточный буфер удален из наконечника перед передачей в пробоотборники.
    4. Поместите в машину, скринт и полоски ПЦР без колпачков. Откройте крышку наконечника внутри устройства. Назначьте позицию с соответствующими метками. Запустите машину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная гистограмма должна быть одним пиком при желаемом размере ампликонов(рисунок 1А). В образцах низкого качества будут наблюдаться дополнительные пики(рисунок 1В),указывающие на плохую очистку бусин или образование праймерных димеров.

4. Секвенирование нового поколения

  1. Количественная оценка и объединение библиотек
    1. Рассчитайте конечную концентрацию ДНК в nM, используя значение ДНК из шага 3.1.8, и размер в парах оснований (bp) пика продукта, полученный из результатов электрофореза машины (см. Рисунок 1).
    2. Для каждого образца рассчитайте объем ДНК для получения конечной концентрации 4 нМ в конечном объеме 10-20 мкл элюационного буфера.
    3. Подготовьте новую смесь для разбавления для каждого образца и возьмите из нее 2 мкл в новую смесь для бассейна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, которые имеют менее 4 нМ, добавьте максимально возможное количество образца.
  2. NGS запуск библиотеки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует настольная секвенсорная платформа. Подробности смотрите в таблице материалов.
    1. Готовят свежий раствор 0,2 Н NaOH. Добавить 10 мкл 0,2 Н NaOH в разбавленный библиотеку, подготовленную на этапе 4.1.3. Добавьте 5% PhiX в трубку и кратковременно вихрь. Открутите трубку, чтобы убедиться, что весь раствор осеял на дне трубки.
    2. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре для хинатации двухцепочечной ДНК. Добавьте 980 мкл предварительно охлажденного буфера из набора в трубку, содержащую ДНК и вихрь ненадолго.
    3. Поместите разбавленный библиотеку на лед и подготовьте библиотеку следующим образом. Для смеси 17 пМ добавьте 425 мкл ДНК со ступени 4.2.2 и 575 мкл буфера. Инвертировать библиотеку несколько раз и вращаться вниз. Загрузите 600 мкл конечной библиотеки на назначенный картридж и поместите образцы в машину.
    4. Запустите запуск, следуя инструкциям программного обеспечения.

5. Анализ последовательности

  1. Загрузите метрики виртуализации из секвенсора и убедитесь, что данные виртуализации находятся в следующих диапазонах (специфичных для комплекта, используемого в текущем протоколе). Образцы, не отвечающие этим критериям, подлежат повторному запуску:
    Плотность кластера (K/mm2)): 945K – 1800K
    Процент прохождения фильтра чтения (Кластеры PF (%)): >90%
    Показатели качества (%>=Q30): >85%
    Выравнивание PhiX (выравнивание %): 1,5% - 10%
    Частота ошибок PhiX (%): <1,0%

Результаты

Здесь мы описываем метод выделения ДНК из кишечной ткани и крови, подготовку библиотек для NGS и основные этапы секвенирования для секвенирования для секвенирования иммунного репертуара. Запуск будет генерировать файлы fastq, которые могут быть в дальнейшем преобразованы в файлы fasta для и...

Обсуждение

Изменения в обилии и функции В- и Т-лимфоцитов часто встречаются при различных злокачественных новообразованиях18,хронических воспалительных заболеваниях (например, язвенном колите и ревматоидном артрите)10,19,а при различных иммунодефицита?...

Раскрытие информации

Всем авторам нечего раскрывать.

Благодарности

никакой.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-propanolSigmaI9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubesAxygen8187631104051
15 mL centrifuge tubesGreiner188261
Absolute ethanolMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
Heat blockBioerNot applicable
High Sensitivity D1000 Sample BufferAgilent5067-5603For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kitInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
PCR strips4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
ShakerBiosanNot applicable
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA isolation kitPromegaA1120Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Ссылки

  1. Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
  2. Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
  4. Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
  5. Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
  6. Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
  7. Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
  8. Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
  9. Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
  10. Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
  11. Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
  12. Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
  13. Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
  14. Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
  15. Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
  16. H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
  17. Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
  18. Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
  19. Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
  20. Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
  21. Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
  22. Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
  23. Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
  24. Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
  25. Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
  26. De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
  27. Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
  28. Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE167TCRIGH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены