Использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1

Резюме

Мы описываем более последовательный и оперативный метод количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ.

Аннотация

Рак молочной железы является разрушительным злокачественным новообразованием, на долю которого приходится 40 000 случаев смерти женщин и 30% новых диагнозов рака у женщин только в Соединенных Штатах в 2019 году. Основной причиной смерти от рака молочной железы является метастатическое бремя. Поэтому доклинические модели рака молочной железы должны анализировать метастатическое бремя, чтобы быть клинически актуальными. Модель рака молочной железы 4T1 обеспечивает спонтанно метастазирующую, поддающуюся количественной оценке модель мыши для iv стадии рака молочной железы человека. Тем не менее, большинство протоколов 4T1 количественно метастатического бремени, вручную подсчитывая окрашенных колоний на пластинах культуры тканей. Хотя этого достаточно для тканей с более низким метастатическим бременем, человеческая ошибка в ручном подсчете приводит к несовместимым и переменным результатам, когда пластины стечены и трудно подсчитать. Этот метод предлагает компьютерное решение ошибки подсчета людей. Здесь мы оцениваем протокол с использованием легких, высоко метастатической ткани в модели 4T1. Изображения метиленовых голубо-окрашенных пластин приобретаются и загружаются для анализа на Фиджи-ImageJ. Затем Fiji-ImageJ определяет процент выбранной области изображения синего цвета, что представляет собой процент пластины с метастатическим бременем. Этот компьютерный подход дает более последовательные и оперативные результаты, чем ручной подсчет или гистопатологическая оценка высокомастатической ткани. Последовательность результатов Fiji-ImageJ зависит от качества изображения. Небольшие различия в результатах между изображениями могут произойти, поэтому рекомендуется сделать несколько изображений и усредить результаты. Несмотря на свои минимальные ограничения, этот метод является улучшением количественной метастатической нагрузки в легких, предлагая последовательные и быстрые результаты.

Введение

Одна из восьми женщин будет диагностирован рак молочной железы в ее жизни, и все же, несмотря на несколько вариантов лечения рака молочной железы является второй ведущей причиной рака, связанных смертей у^{американских женщин 1}. Эти женщины не умирают от первичной опухоли в груди. Вместо этого, метастатическое бремя несет ответственность за смертность от этого заболевания, как это обычно распространяется на легкие, кости, мозг, печень и лимфатические^{узлы 2}. Из-за этого, модели рака молочной железы должны оценить метастазы, чтобы способствовать сдерживанию смертности от этого заболевания. Модель рака молочной железы 4T1 murine является превосходным протоколом для достижения этой цели. Метод, описанный здесь предлагает улучшение модели 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ для количественной оценки метастазов легких, производя последовательные и оперативные результаты.

Модель 4T1 хорошо зарекомендовала себя, большинство лабораторий используют протоколы, такие как описаны Пуласки и Остранд-Розенберг в 2001^{году 3}. Линия клеток 4T1 6-Thioguanine (6TG) устойчива и представитель iv стадии, тройной отрицательный^{рак молочной железы 3,4,5}. Это клинически актуально, так как это ортопедическая модель и спонтанно метастазирует в те же органы, что и при раке молочной^{железы человека 3,4.} Клетки 4T1 спонтанно метастазируют с предсказуемой скоростью, основанной на количестве клеток, введенных^3,4. Важно отметить, что генетические различия между мышами, используемыми здесь, вызвали ожидаемую меж индивидуальную изменчивость метастатического бремени. Для оценки метастазов, ткани собирают для сбора и количественной оценки раковых клеток в отдаленных местах с использованием 6TG отбора и метиленового синего окрашивания. Результатом является коллекция пластин культуры тканей с синими точками, представляющими метастатические колонии. Однако протокол Пуласки и Остранд-Розенберга количественно определяет метастатические колонии, вручную подсчитывая их, и поэтому это было стандартным средством оценки метастазов в этой модели. Хотя это легко для тканей с низким метастатическим бременем, ткани, как легкие часто нагруженные метастазами. Поскольку легочные пластины могут быть сильно стеченными, точно и точно количественными метастатическими колониями путем ручного подсчета трудно и склонны к человеческой ошибке. Чтобы лучше определить метастатическое бремя, мы описываем использование Fiji-ImageJ для компьютерного решения ошибки подсчета людей. Гистопатологический анализ с гематоксилином и эозином (H и E) окрашивание является еще одним средством количественной оценки метастазов легких, и интересно также была улучшена с Фиджи-ImageJ программное^{обеспечение 6,7}. Однако, поскольку гистопатологический анализ наблюдает один кусочек легких, он может быть неточным и непредставительным. Это потому, что модель 4T1 вызывает несколько метастатических поражений по всему органу, которые не равномерно распределены. В то время как общие тенденции между гистопатологическим анализом и ручным^{подсчетом могут быть похожи на 8, индивидуальные}значения могут отличаться, и поэтому гистопатологический анализ не должен использоваться в качестве единственного средства количественной оценки. Мы демонстрируем преимущества по сравнению с гистопатологическим анализом и несоответствиями в ручном подсчете между различными счетчиками, а также демонстрируем последовательность использования Фиджи-ImageJ. Кроме того, мы показываем, что этот метод может сократить время инкубации с 10-14 дней до 5 дней, то есть исследователи могут анализировать данные из своего исследования гораздо раньше, чем при полагаться на ручной подсчет.

Этот метод представляет собой набор простых корректировок к протоколу Пуласки и Остранд-Розенберга^3. Поскольку модель 4T1 широко используется, и потому, что метастазы легких является критическим параметром для измерения в доклинических моделях, мы считаем, что этот метод может быть широко использован и очень ценен для исследователей рака молочной железы. Единственными дополнительными принадлежностями, необходимыми являются камера и доступ к компьютеру с Фиджи-ImageJ, свободное программное обеспечение, часто используемое в анализе^{изображений 9}. Этот метод специально фокусируется на метастазах легких, но он может быть использован для других тканей со значительным метастатическим бременем.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического института Вирджинии и в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья и использованию лабораторных животных. Выполнение этого протокола требует разрешения соответствующих учреждений и соблюдения всех соответствующих руководящих принципов.

1. Культура клеток

1. Сделать полную культуру средств массовой информации (RPMI и 10% плода крупного рогатого скота сыворотки 1% Пен Strep). Оживите клетки 4T1 в соответствии^{с протоколом 10} ATCC и инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂ в колбе Т-25 до слияния. Изменение средств массовой информации на следующий день после возрождения, чтобы удалить мертвые клетки, и снова, если средства массовой информации тратится до клетки достаточно стечены, чтобы пройти.
2. После того, как Т-25 колба стечена, проход клеток в колбу Т-75, отбрасывая средства массовой информации, стиральная колба с 5 мл 1x Dulbecco фосфат буферного солевого раствора (DPBS), и добавить 500 йл трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5-10 минут при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.
   1. После отсоединея, добавить 5 мл разогретой полной культуры средств массовой информации для клеток. Аспирировать и перенести 5 мл на колбу Т-75, содержащую 15 мл разогретых полных культурных средств массовой информации.
3. Проходные камеры в колбы Т-75 не менее четырех раз. Сделайте это после того, как колба стечена путем мытья с 8 мл 1x DPBS, добавив 1 мл трипсина-EDTA для отсоединения клеток, добавив 10 мл разогретых средств массовой информации в ячейки, и разбавления 1:6-1:8 в новую колбу Т-75, содержащую 20 мл прогретых полных средств массовой информации культуры.
4. Проходные клетки до соответствующего количества колб Т-150, содержащих 40 мл разогретых полных культурных средств массовой информации для количества мышей, которые будут введены. Большинство исследований потребует нескольких колб Т-150, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для инъекций.
5. Когда мыши готовы к инъекциям (8 недель или весом более 20 г, в зависимости от МАКУК или институциональных протоколов), собирают клетки, отбрасывая средства массовой информации, мыть каждую колбу 10 мл 1x DPBS и добавляя 2 мл трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5-10 минут при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.
6. Вымойте колбу с 10 мл полного мультимедиа и перенесите все содержимое (10 мл мультимедиа и 2 мл смеси трипсина-ЭДТА) в следующую колбу. Продолжайте мыть и собирать клетки из каждой колбы, используя те же 10 мл средств массовой информации, чтобы избежать использования чрезмерного количества средств массовой информации.
   1. После того, как все колбы были собраны, передать содержимое в 50 мл центрифуги трубки. Соберите образец 10 МКЛ для подсчета в микроцентрифуге трубки и центрифуги 50 мл конической трубки на 125 х г в течение 5 минут.
7. В то время как клетки центрифугированы, добавьте 10 МКЛ трипан-голубого до 10 МКЛ образца клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Как только общее количество клеток будет определено, вычислите концентрацию клеток, необходимых для инъекций мышей для 1,2^{х 10 6} клеток на мышь (на 100 МКЛ).
8. После центрифугации, декантированных средств массовой информации и повторного перерасхода клеточных гранул в правильном количестве стерильных 1x DPBS для 1,2^{х 10 6} клеток на 100 МЛ. Сплит ячейки / DPBS смесь в микроцентрифуг трубки для легкого доступа со шприцем при аспирации клеток для инъекций. Держите клетки на льду и вводить вскоре после этого, как клетки начнут умирать после того, как на льду в течение длительных периодов времени.

2. Инъекции

1. Подготовка клеток для инъекций, нажав или осторожно смешивания микроцентрифуг трубки для повторного перерасхода клеток, а затем аспирировать 600 йл в 1 мл шприца. Поверните шприц вверх и потяните поршень вниз, чтобы привести клетки от открытия шприца. Нажмите на шприц, чтобы избавить его от пузырьков воздуха.
2. Прикрепите иглу скошенной и обойтись клетки обратно в трубку микроцентрифуг, пока только 500 йл остаются в шприце. Положите шприц плашмя на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 клетки выпадают из подвески быстро. Поэтому важно смешивать клетки обратно в подвеску, часто нажав.
3. Анестезировать 8 недель / 20 г женщин BALB / c мыши с помощью изофлюрана или другого утвержденного обезболивающего агента. Мониторинг дыхания мыши, чтобы оценить глубину анестезии.
4. После того, как мышь правильно анестезируется, как указано на отсутствие роговицы рефлекс, поместите мышь на спину. Используя большой, указательный и средний палец, аккуратно удерживайте мышь. Используйте указательный и средний пальцы, чтобы удержать верхнюю часть тела мыши и большой палец для задней левой ноги. Будьте нежны, но тверды.
5. С скошенной иглы вверх, ввиснуть 100 йл клеток подкожно в левой брюшной молочной молочной молочной площадке мыши. Монитор для хорошего bleb и любой утечки, и обеспечить мышь просыпается и движется легко после инъекции.
   1. Изменение иглы между каждой мышью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте игле войти в брюшную полость. Это приведет к быстрой распространению рака и не будет репрезентативным для модели. Для обеспечения подкожной инъекции, осторожно потяните вверх на иглу при вставке в левой брюшной молочной молочной жир площадку. Если иглу легко поднять вверх, она правильно расположена подкожно.

3. Мониторинг

1. Мониторинг мышей по крайней мере 3 раза в неделю для веса, состояние тела оценка, размер опухоли, состояние опухоли, дыхание, уровень активности, внешний вид, и движение. Как только опухоль достигнет 0,7-0,8 см в диаметре, начать контролировать ежедневно.
   1. Рассмотрим эвтаназии, когда размер опухоли достигает 1,5 см, или потеря веса достигает 20%, или тяжелое клиническое снижение состояния тела оценка, состояние опухоли, дыхание, уровень активности, внешний вид, или движение наблюдаются на основе институциональных руководящих принципов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка состояния тела имеет решающее значение для мониторинга, как вес тела может увеличиться, как опухоль увеличивается в размерах, отрицая потерю состояния тела из-за бремени болезни. Точные протоколы мониторинга будут зависеть от утвержденных МАКУК или институциональных протоколов.

4. Некропсия

1. Euthanize мыши с использованием CO_{2 следующие} институциональные руководящие принципы.
2. Спрей мыши с 70% этанола для дезинфекции. Сделайте разрез до брюшной средней линии мыши, чтобы разоблачить полость тела.
3. Удалите почку. Продолжайте разрезать средней линии до тех пор, пока диафрагма не будет видна. Используйте ножницы, чтобы проколоть диафрагму, чтобы сдуть легкие. Обрезать диафрагму, чтобы получить лучший доступ к полости.
4. Используйте тупые ножницы, чтобы разрезать центр грудной клетки. Прикрепите грудную клетку назад, чтобы разоблачить легкие и сердце.
5. Perfuse сердце с 2 мл нестериленых 1x DPBS путем вставки иглы в вершину сердца, пока он бассейны в брюшной полости, где почка была удалена.
6. Чтобы удалить сердце и легкие, используйте тупые ножницы, чтобы сократить пищевода и трахеи непосредственно над сердцем. Используя типсы, начните тянуть сердце от тела и отрезать на любой соединительной ткани держать его прилагается. Легкие выходят с сердцем.
7. Определите многолопастные (справа) и однолопастные (левые) легкие. Держите сердце прилагается для справки, но как только легкие определены, отрезать сердце прочь.
8. Этикетка 12 хорошо пластины, содержащие 1x Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) в каждой хорошо. Каждой мыши нужно 2 колодца. Поместите многолопастное (правое) легкое в 12 хорошо пластины для оценки метастазов и держать на льду. Держите соседний колодец пустым на данный момент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать одно и то же легкое (многолопастное) от каждой мыши, чтобы гарантировать, что каждый образец близок по размеру. Однолопастное легкое может быть использовано для другого анализа, например, гистопатологии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы стабильны на льду или при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов.

5. Обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе должны быть сделаны с использованием стерильной техники.

1. Этикетка 1 15 мл конической трубки на мышь и добавить 2,5 мл типа IV коллагеназы смеси и 30 единиц эластазы для каждой трубки. Чтобы сделать тип IV коллагеназы смеси, растворить 2 мг типа IV коллагеназы на мл 1x HBSS и стерильный фильтр. Это может храниться до 12 месяцев при -20 градусов по Цельсию и оттаивать, когда это необходимо.
2. Передача легких на второй, чистый 1x HBSS хорошо для этого образца. Вихрь с помощью типсов, чтобы удалить оставшиеся крови. Передача чистого легкого в пустую пластину культуры ткани 3,5 см. Фарш легких с ножницами. Промыть пластину с 2,5 мл 1x HBSS, передачи 1x HBSS и легких частей в 15 мл конической трубки уже содержащие коллагеназы / эластасы коктейль (5 мл в общей сложности).
3. Инкубировать в течение 75 минут при 4 градусов по Цельсию. Продолжить смешивание образцов в течение этого времени, так что поместите трубки на рокер или вращающееся колесо. Во время этого шага инкубации, этикетка 50 мл центрифуг трубки и 10 см ткани культуры пластин для каждой мыши. При этом разбавления, этикетка достаточно 10 см ткани культуры пластин для разбавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка крышку пластин культуры тканей. Если маркировка самой пластины, письменной форме будет мешать Фиджи-ImageJ анализа.
4. Довнесите объем каждой трубки до 10 мл в общей сложности с 1x HBSS. Налейте содержимое более 70 мкм ситечко клеток в 50 мл конической трубки для каждого образца. Используйте поршень шприца 1 мл, чтобы аккуратно измельчить образец через ситечко, чтобы позволить больше клеток, чтобы фильтровать до конца.
5. Центрифуга в течение 5 минут при температуре 350 x г при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы с 10 мл 1x HBSS. Повторите этот шаг дважды.
6. Resuspend гранулы в 10 мл 60 МКМ 6TG полной культуры средств массовой информации, либо RPMI или IMDM. Образцы плит в пластинах культуры клеток 10 см, используя схему разбавления при желании. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию, 5% CO_{2 в} течение 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1:2, 1:10 и 1:100 являются общими разбавления, которые должны быть эмпирически определены на основе параметров исследования.
   ВНИМАНИЕ: 6TG является токсичным. Используйте осторожность при обработке и следовать всем экологическим здоровья и безопасности руководящих принципов для удаления.

6. Окрашивание пластин

1. Налейте культурные средства массовой информации с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Исправить клетки, добавив 5 мл неразбавленного метанола на тарелку и инкубировать в течение 5 минут на RT, убедившись, что вихрь метанола так, что она охватывает всю пластину.
   ВНИМАНИЕ: Метанол опасен при приеме внутрь, вдыхании или на коже. Используйте дым капот для этого шага.
2. Налейте метанол с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Промыть пластины с 5 мл дистиллированной воды на тарелку и залить водой в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте 5 мл 0,03% метиленового синего на тарелку и инкубировать в течение 5 минут в RT, убедившись, что закружить метиленовый синий раствор так, чтобы он покрывал всю пластину.
3. Налейте метиленовый синий в соответствующий контейнер отходов. Промыть тарелки снова с 5 мл дистиллированной воды на тарелку. Переверни тарелки вверх дном и помарки против бумажного полотенца, чтобы удалить избыток жидкости. Поместите пластину на крышку и дайте воздуху высохнуть на ночь в RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метастатические колонии будут синими. После того, как пластины высушиваются, они могут храниться в RT на неопределенный срок.

7. Анализ изображений

1. Снимите маркированную крышку с пластин, заботясь о четкой идентификации образцов. Выстроить все окрашенные пластины легких на чистой, светлой поверхности, чтобы сфотографировать все пластины в одном изображении.
2. Смойте коллекцию пластин в хорошо освещенной области, убедившись, чтобы свести к минимуму отражения, как пластины очень отражающей. Отражения в пластинах будут влиять на анализ изображения и, следовательно, следует избегать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи-ImageJ имеет верхний предел 2 гигапикселей. Большинство современных смартфонов будет иметь достаточно камер. Не используйте камеру менее 8 мегапикселей. Камера, используемая в этом эксперименте, была 12,2 мегапикселя на Google Pixel 2.
3. Обрезать изображение, чтобы включить пластины, но исключить крышки или что-нибудь еще в фоновом режиме изображения. Загрузите обрезанное изображение в Фиджи-ImageJ.
4. Измените изображение на черно-белое, используя следующие команды: Изображение, Отрегулируйте, Пороговый цвет, Пороговый метод: По умолчанию, Пороговый цвет: B и W, Пороговое пространство: Lab. Unselect The Dark background box. Изображение теперь должно быть черно-белым. Черный цвет представляет световой фон, а белый представляет синие метастатические колонии.
5. Используя инструмент Circle на панели инструментов Fiji-ImageJ, выберите область, которая будет проанализирована. Нарисуйте один круг для использования для всех пластин, чтобы убедиться, что каждая пластина анализируется для той же площади. Выберите размер, который максимизирует проанализированную область на пластинах, минимизируя фоновый шум, который появляется на краю пластин. Размер отображается в панели инструментов по мере ее нарисования, поэтому можно сделать идеальный круг, отслеживая высоту и ширину по мере нарисования круга.
6. Проанализируйте выбранный круг, чтобы определить, какой процент области белый, который представляет область пластины, которая имеет синие метастатические колонии. Используйте следующие команды:
   Анализ, Анализ частиц, Размер^{(пиксель 2}): 0-Бесконечность, Циркулярность: 0.00-1.00, Показать: Ничего, и проверить резюме поле. Хит ОК.
7. Запись % Площадь результат. Это процент выбранной области, которая является белой, и, следовательно, представляет метастатическое бремя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется либо сохранить результаты в Fiji-ImageJ, либо скопировать/вставить всю страницу результатов в отдельный документ. Если результаты % area являются неожиданными или подозрительными, то можно увидеть, если любой из других измерений были также подозрительными или если % Площадь была записана неправильно.
8. Перемести круг, не изменяя его размер, схватив его в центре, к следующей пластине на картинке. Повторите шаги 7.6 и 7.7 для всех пластин на картинке.
9. Повторите шаги 7.1 - 7.8 по крайней мере еще на двух изображениях. После того, как все пластины и изображения были проанализированы, средний % Площадь результаты между различными изображениями для каждой пластины, чтобы смягчить любые несоответствия между картинками.

Результаты

Этот метод содержит простые корректировки протокола³ Pulaski и Ostrand-Rosenberg 4T1 и может быть визуализирован на рисунке 1. Когда 3 отдельных исследователя вручную подсчитали метастатические колонии для 12 легочных пластин (1:10 разбавления), результаты были очень несов...

Обсуждение

Как попродемонстрировано, ручной подсчет метастатических колоний на каждой пластине легких может быть неточным и неточным методом количественной оценки метастазов легких, демонстрируя необходимость лучшего средства количественной оценки(рисунок 2). Гистопатологиче?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water