JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В модели эксайтотоксичности C. elegans этот протокол использует визуализацию in vivo для анализа регуляции некротической нейродегенерации, влияния генов, кодирующих кандидаты в медиаторы, и вовлечения митохондрий. Диссоциация и сортировка клеток используются для получения нейронов из группы риска для клеточно-специфического транскриптомного анализа механизмов нейродегенерации и нейропротекции.

Аннотация

Эксайтотоксический некроз является ведущей формой нейродегенерации. Этот процесс регулируемого некроза запускается синаптическим накоплением нейромедиатора глутамата и чрезмерной стимуляцией его постсинаптических рецепторов. Тем не менее, информация о последующих молекулярных событиях, которые приводят к отчетливой морфологии набухания нейронов этого типа нейродегенерации, отсутствует. Другие аспекты, такие как изменения в специфических субклеточных компартментах или основа дифференциальной клеточной уязвимости отдельных подтипов нейронов, остаются недостаточно изученными. Кроме того, ряд факторов, которые вступают в игру в исследованиях с использованием препаратов in vitro или ex vivo, могут модифицировать и искажать естественное развитие этой формы нейродегенерации. Поэтому важно изучать эксайтотоксический некроз у живых животных путем мониторинга эффектов вмешательств, которые регулируют степень нейронального некроза в генетически поддающейся и прозрачной модельной системе нематоды Caenorhabditis elegans. В этом протоколе описаны методы изучения эксайтотоксического некроза в нейронах C. elegans , сочетающие оптический, генетический и молекулярный анализ. Чтобы индуцировать эксайтотоксические состояния у C. elegans, нокаут гена транспортера глутамата (glt-3) сочетается с нейрональным сенсибилизирующим генетическим фоном (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) для получения гиперстимуляции глутаматных рецепторов и нейродегенерации. Дифференциальный интерференционный контраст (ДВС-синдром Номарски), флуоресцентная и конфокальная микроскопия у живых животных являются методами, используемыми для количественной оценки нейродегенерации, наблюдения за субклеточной локализацией флуоресцентно меченых белков и количественной оценки морфологии митохондрий в дегенеративных нейронах. Сортировка нейрональных флуоресцентных активированных клеток (FACS) используется для четкой сортировки нейронов из группы риска для транскриптомного анализа нейродегенерации по типу клеток. Сочетание методов визуализации в реальном времени и FACS, а также преимущества модельного организма C. elegans позволяют исследователям использовать эту систему для получения воспроизводимых данных с большим размером выборки. Результаты этих анализов могут привести к созданию новых мишеней для терапевтического вмешательства при нейродегенеративных заболеваниях.

Введение

Эксайтотоксичность является основной причиной гибели нейронов при ишемии головного мозга и фактором, способствующим развитию множественных нейродегенеративных заболеваний 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Нарушение притока насыщенной кислородом крови к мозгу (например, из-за тромба) приводит к нарушению работы транспортеров глутамата, что приводит к накоплению глутамата в синапсе. Этот избыток глутамата чрезмерно активирует постсинаптические глутаматные рецепторы (GluR), что приводит к чрезмерному (каталитическому, нестехиометрическому) притоку Ca2+ в нейроны (рис. 1A). Этот вредный приток приводит к прогрессирующей постсинаптической нейродегенерации, которая морфологически и механистически варьируется от апоптоза до регулируемого некроза 10,11,12. Несмотря на то, что они были основаны на успешных вмешательствах на животных моделях, многочисленные клинические испытания антагонистов GluR, которые были направлены на блокирование проникновения Ca2+ и повышение жизнеспособности клеток, не увенчались успехом вклинических условиях. Вероятным критическим фактором этих неудач является тот факт, что (в отличие от животных моделей) лечение в клинических условиях проводится через несколько часов после начала инсульта, в результате чего вмешательство блокирует нейропротекторные механизмы позднего действия, в то же время не прерывая дегенеративную передачу сигналов после GluRs 14,16,17. Альтернативный подход, основанный на тромболизисе, может быть применен только в строго ограниченное временное окно, в результате чего многие пациенты (которые страдают от инсульта в домашних условиях с плохо идентифицируемым временем начала) не могут извлечь из него пользу17. Эти неудачи подчеркивают необходимость сосредоточить исследования эксайтотоксичности на изучении событий, происходящих после гиперстимуляции GluR, и дифференцировать последующие дегенеративные каскады от сопутствующих нейропротекторных процессов. Этот подход может помочь предотвратить повреждение клеток и определить эффективные мишени для лекарств, которые могут быть введены позже после начала повреждения.

Одним из подходов к выявлению последующих событий эксайтотоксичности является изучение сигнальных механизмов клеточной смерти после гиперстимуляции GluR, таких как те, которые приводят к митохондриальному коллапсу. Резкие сбои в физиологии и динамике митохондрий являются отличительной чертой нейродегенерации, что проявляется в эксайтотоксичности 18,19,20. В то время как все клетки зависят от митохондриальной функции и доступности для выживания, активности и поддержания клеток, нейроны особенно зависят от производства митохондриальной энергии для передачи и распространения сигналов. В частности, нейроны тратят ~50% своей энергии, связанной с передачей сигналов, на восстановление мембранного потенциала покоя после активации постсинаптических рецепторов/каналов21, с высокой зависимостью от кислорода и глюкозы. Снижение доступности глюкозы и кислорода, наблюдаемое при инсульте, приводит к серьезным изменениям в митохондриях, вызывая дальнейшее снижение продукции АТФ 19,22,23,24. Тем не менее, исследования по выявлению последовательности событий, которые приводят к митохондриальному коллапсу, дали противоречивые результаты и не привели к консенсусу. Анализ морфологии митохондрий может помочь понять эти события, приводящие к митохондриальной патологии, поскольку это хороший показатель здоровья нейронов 25,26,27,28,29. Нитевидные митохондрии являются представителями здорового нейрона, в то время как фрагментированные митохондрии обнаруживают значительные повреждения нейронов, которые могут привести к гибели клеток. Анализ морфологии митохондрий у живых животных с различными генетическими условиями может помочь сосредоточиться на конкретных генах и путях, участвующих в митохондриально-зависимой нейродегенерации в условиях эксайтотоксичности.

Другой подход к выявлению последующих событий, которые могли бы регулировать степень эксайтотоксической нейродегенерации, заключается в изучении транскрипционных нейропротекторных механизмов, которые смягчают некоторые эффекты эксайтотоксичности14,16. Тем не менее, недостаточная специфичность ключевых нейропротекторных факторов транскрипции и расхождение экспериментальных установок препятствуют успеху усилий по четкому определению основных нейропротекторных программ (особенно при регулируемом некрозе).

Таким образом, как изучение нисходящих сигнальных путей смерти, так и изучение транскрипционной нейропротекции при эксайтотоксичности столкнулись с большими трудностями и разногласиями по поводу наблюдаемых исходов. Большая часть этих противоречий, вероятно, возникает из-за использования моделей эксайтотоксичности ex vivo или in vitro, а также из-за изменчивости, вносимой спецификой различных экспериментальных установок. Поэтому очень полезно сосредоточиться на выявлении основных механизмов, которые высоко консервативны, и изучить их in vivo. Простая модельная система нематоды C. elegans предлагает особенно эффективный вариант благодаря мощной комбинации особенно мощных и разнообразных исследовательских инструментов, сохранению основных путей клеточной смерти, а также богатой информации о структуре и связях ее нервной системы 30,31,32,33. Действительно, плодотворная работа лаборатории Дрисколла по генетическому анализу некротической нейродегенерации в механосенсорных нейронах является прекрасной демонстрацией мощиэтого подхода. Важным для анализа эксайтотоксичности является тот факт, что сохранение сигнальных путей у нематоды включает в себя все основные компоненты глутаматергической нейротрансмиссии35,36.

Модель эксайтотоксичности нематод основана на этих плодотворных исследованиях, что позволяет исследователю изучать биохимические процессы, сходные с теми, которые происходят при инсульте и других нейродегенеративных заболеваниях, вызванных глутамат-зависимой нейротоксичностью. Чтобы индуцировать эксайтотоксические состояния у C. elegans, в этом экспериментальном подходе используется штамм эксайтотоксичности, который представляет собой комбинацию нокаута гена транспортера глутамата (glt-3) и нейронального сенсибилизирующего генетического фона (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) для получения гиперстимуляции GluR и нейродегенерации37. Этот штамм эксайтотоксичности подвергает 30 специфических (glr-1-экспрессирующих) нейронов, которые являются постсинаптическими глутаматергическими соединениями, эксайтотоксической нейродегенерации. Из этих 30 нейронов, входящих в группу риска, отдельные нейроны подвергаются некрозу по мере развития животного (со смешанной стохастичностью и частичным предпочтением определенных специфическихнейронов), в то время как клеточные трупы также постепенно удаляются. В сочетании с доступностью многих мутантных штаммов такой подход позволяет изучать множественные пути, влияющие на нейродегенерацию и нейропротекцию. Эти подходы уже использовались для анализа некоторых нисходящих каскадов передачи сигналов смерти39 и транскрипционных регуляторов эксайтотоксической нейродегенерации в условиях эксайтотоксичности38,40. Как и другие случаи некротической нейродегенерации учервя 41, эксайтотоксическая нейродегенерация нематоды не связана с классическим апоптозом40.

В данной методике описывается основная система индуцирования, количественного определения и манипулирования эксайтотоксической некротической нейродегенерацией у C. elegans. Кроме того, в нем изложены два основных протокола, которые в настоящее время используются для оптимизации исследований конкретных аспектов эксайтотоксичности нематод. Используя флуоресцентные репортеры и визуализацию in vivo, исследователь может изучить вовлечение и динамику митохондрий в модели эксайтотоксической нейродегенерации у нематоды. Чтобы определить влияние специфических нейропротекторных транскрипционных факторов, исследователь может использовать специфическую для типа клеток экспрессию флуоресцентных маркеров, диссоциацию животных на отдельные клетки и FACS для выделения специфических нейронов, подверженных риску некроза, от эксайтотоксичности. Эти выделенные нейроны, специфичные для клеточного типа, затем могут быть использованы для секвенирования РНК в штаммах, которые содержат мутации в ключевых факторах транскрипции. В совокупности эти методы могут позволить исследователям выявить молекулярные основы эксайтотоксической нейродегенерации и нейропротекции in vivo с большой ясностью и точностью.

протокол

1. Штаммы, используемые для исследования эксайтотоксической нейродегенерации и нейропротекции

  1. Используйте штамм эксайтотоксичности нематоды ZB1102 в качестве точки отсчета для стандартной эксайтотоксической нейродегенерации.
    Глутамат-зависимая эксайтотоксичность у C. elegans продуцируется у штамма ZB1102 путем комбинации нокаута (ko) транспортера глутамата с трансгеном, который сенсибилизирует нейроны у этих животных к нейротоксичности и экспрессируется в подмножестве нейронов, постсинаптических к глутаматергическим связям37. Эта генетическая комбинация называется штаммом эксайтотоксичности нематоды, и она свободно доступна в Центре генетики Caenorhabditis (CGC).
  2. Чтобы изучить влияние генов, кодирующих кандидатов в регуляторы эксайтотоксического некроза, комбинируйте мутацию в таких генах ( например, dapk-1 или crh-1) со штаммом эксайтотоксичности нематоды.
  3. Проводите генетические скрещивания в соответствии со стандартными методами C. elegans 30, изложенными в wormbook.org42,43.
  4. Поскольку молекулярная основа мутации обычно документирована, проследите за перекрестным потомством, генотипируя конкретный локус с помощью ПЦР. Дифференцируйте WT и мутантный по размеру фрагмента (для делеций) или секвенированию (для точечных мутаций).
    Примечание: В таблице 1 представлены штаммы, которые были использованы для изучения различных путей нейродегенерации и нейропротекции, специально для этого протокола.
  5. Выведите все критические штаммы по двум независимым линиям и протестируйте их по отдельности, чтобы подтвердить валидность наблюдаемого фенотипа.

2. Питательные среды и животноводство

  1. Выращивайте червей при температуре 16-25 °C на стандартных планшетах NGM 30,37,42 или MYOB 38,44, засеянных OP50 E.coli в соответствии со стандартными методами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты MYOB дают те же результаты, что и планшеты NGM, но их немного проще в приготовлении.
  2. Поддерживайте подопытные сорта стабильно хорошо подкармливайте.
    Примечание: Голодание может повлиять на нейродегенерацию и уменьшить количество отмирающих нейронов головы. Если червей плохо кормят или морят голодом, положите их на свежие тарелки и подождите несколько поколений, прежде чем продолжать эксперименты. Трансгенерационный эффект голода ослабнет через несколько поколений.

3. Количественная оценка дегенеративных нейронов головы с помощью дифференциального интерференционного контраста Номарского (DIC) и скоринга

  1. Используйте штамм эксайтотоксичности нематоды (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) в качестве экспериментального контроля для количественного определения, представляющего нормальные уровни эксайтотоксичности. Протокол не отслеживает одно и то же животное на разных стадиях развития. Вместо этого он дает снимок популяции животных на смешанных стадиях, так что в целом мы собираем информацию от разных животных, чтобы представить все стадии развития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансген nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (который экспрессирует активированные Gαs и GFP в нейронах постсинаптических и глутаматергических связей) продуцирует фоновый GluR-независимый уровень некротической нейродегенерации ~1 умирающего головного нейрона/животного (в любой момент времени, когда развивается). Добавление glt-3 (ko) увеличивает некротическую нейродегенерацию постсинаптических нейронов, экспрессирующих nuIs5, в зависимости от GluR, достигая 4-5 умирающих головных нейронов на животное на третьей личиночной стадии (L3)37.
  2. Для тестовых штаммов используйте животных от недавно завершенного генетического скрещивания или размораживайте интересующие штаммы из замороженных запасов при температуре -80 °C, полученных от свежих скрещиваний. Подождите несколько поколений (≥4), прежде чем определить фенотип и нейродегенерацию.
  3. Отрежьте и удалите небольшой кусочек агара с тарелки смешанной популяции хорошо откормленных животных и закрепите его на покровном листе, перевернув кусок агара так, чтобы животные, которые ползали по поверхности агара, теперь обращены к покровному листу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные все еще могут двигаться, но теперь они несколько ограничены, и их можно наблюдать без анестезии. Такой кусок можно использовать в течение ~1 часа, прежде чем заменить его на новый.
  4. Используя перевернутый прицел DIC с окуляром x10 и объективом x40 или x63, сканируйте животных случайным образом, сдвинув покровное стекло вручную. В то время как другие описанные ниже этапы визуализации могут быть проведены как на инвертированном, так и на вертикальном микроскопе, для исследования червей в куске агара требуется инвертированный эндоскоп.
  5. Определите стадию развития каждого животного по форме матки (см. диаграммы матки в wormbook.org).
  6. Для каждого животного запишите стадию его развития и количество умирающих (т.е. вакуолизированных) нейронов. Подсчитайте и запишите общее количество умирающих нейронов в голове, количество умирающих нейронов в ретровезикулярном ганглии (что позволяет легко идентифицировать конкретные клетки) и количество умирающих нейронов в хвосте (которое не подвержено влиянию глутамата и служит внутренним контролем, подтверждающим, что сенсибилизирующий трансген nuIs5 полностью активен).
  7. Запишите эти данные в таблицу, где животные из данного штамма сгруппированы по категориям стадии развития.
  8. На каждом сеансе собирайте наугад данные от червей с несколькими стадиями развития; Проведите несколько сеансов оценки в течение нескольких дней, чтобы собрать достаточно данных для статистического анализа. Запишите уровни нейродегенерации на нескольких стадиях и постройте гистограмму, аналогичную рисунку 1C.
    Примечание: Этот метод позволит определить, повышает ли определенное лечение или мутация уровень нейродегенерации на всех стадиях (сдвиг распределения вверх/вниз) или сдвигает пик нейродегенерации на более раннюю или позднюю стадию развития (сдвиг распределения влево/вправо).
  9. Выполняйте сбор данных, не зная идентичности генотипа. Подтвердите в двух независимых изолятах генетической линии (чтобы свести к минимуму опасность непреднамеренных эффектов других/неожиданных генетических различий между изолятами) и объедините данные для анализа.
  10. Для каждого штамма рассчитайте среднее значение и SEM количества дегенерирующих нейронов в голове (включая ретровезикулярный ганглий) на каждой стадии развития (рис. 1D). При необходимости проведите аналогичный анализ умирающих ретровезикулярных ганглиев только -и хвостовых нейронов.

4. Идентификация специфических дегенеративных нейронов головы

  1. Посадите отдельных (или небольших групп) животных на агаровую площадку46 и парализуйте червя с помощью тетрамизола (см. ниже, раздел 5).
  2. С помощью комбинированной флуоресценции и ДВС-эндоскопа (вертикального или инвертированного) локализуют определенные вакуолизированные нейроны.
  3. Определите специфическую нейронную идентичность вакуолированного нейрона, отслеживая его меченые GFP процессы и сравнивая расположение тела клетки и форму процессов с нейронами, которые, как известно, экспрессируют glr-1 , с помощью WormAtlas47.
    Примечание: В качестве альтернативы идентификация может быть облегчена новыми методами быстрой идентификации нейронов с помощью многоцветной маркировки, которые скоро появятся в лаборатории Хоберта48.

5. Живая визуализация морфологии нейрональных митохондрий с помощью флуоресцентной микроскопии репортерных штаммов

  1. Для визуализации митохондриальных изменений в дегенерирующих постсинаптических нейронах (которые помечены цитоплазматическим GFP в исходном штамме эксайтотоксичности) исследуйте флуоресценцию mito-mCherry.
  2. Скрестите тестовый штамм эксайтотоксичности со штаммами, которые помечают митохондрии постсинаптических нейронов красной флуоресценцией (путем экспрессии слияния между флуоресцентным белком и N-концевым концом TOM-20 под действием промотора glr-1 ; подробнее о конструкциях и штаммах см.49). Животные теперь могут быть визуализированы с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа (вертикального или инвертированного) или конфокального микроскопа.
  3. Чтобы парализовать червя, не влияя на выживаемость нейронов, пипетку 5 мкл 10 мМ тетрамизола на свежеприготовленную агарозную подушечку. Смотрите Arnold et al.46 для получения подробного протокола по подготовке прокладок.
  4. Поместите животных в центр капли тетрамизола и закрепите на ней покровное стекло.
  5. Заклейте боковые стороны покровного стекла лаком для ногтей и дайте лаку высохнуть.
  6. В течение 20 минут после лечения тетрамизолом и с помощью эндоскопа с ДВС-синдромом и флуоресцентной визуализацией определите местонахождение червей с помощью объектива с 20-кратным увеличением.
  7. Как только головка червя будет обнаружена (или нейроны, представляющие интерес), перейдите к 100-кратному масляному объективу и сосредоточьтесь на флуоресцентном мечении митохондрий в соме.
  8. Захватывайте изображения Z-стека с помощью настроек фильтров DIC, GFP и TxRed.

6. Оценка и количественная оценка морфологии нейрональных митохондрий

  1. Анализируйте морфологию митохондрий либо во время визуализации червя в реальном времени, либо после получения изображения с помощью ImageJ или другого программного обеспечения для визуализации.
  2. Для облегчения идентификации и повторного анализа конкретных нейронов определите три нейрона в ретровезикулярном ганглии, RIGL/R и AVG (в некоторых случаях присутствуют только два из-за клиренса клеточного трупа в эксайтотоксичности).
  3. Классифицируйте митохондрии на три основные группы: нитевидные, промежуточные и фрагментированные 50,51,52.
    Примечание: Нитевидные митохондрии проявляются в виде непрерывных тонких структур в соме нейронов, обычно окружающих ядро. Промежуточные митохондрии представляют собой комбинацию по крайней мере одной видимой нитевидной сети, хотя и с разрывами, и некоторой фрагментацией в соме. Фрагментированные митохондрии демонстрируют полные разрывы в митохондриальной сети, имеют опухший вид и разбросаны по всей соме (рис. 2А).
  4. Для каждого червя подсчитайте процент нейронов с нитчатыми, промежуточными или фрагментированными митохондриями, что в общей сложности составляет не менее 30 червей.
  5. Выполните статистический анализ с использованием одностороннего ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки для каждой морфологии митохондрий между штаммами53.

7. Буферно-реагентный препарат для диссоциации червей при FACS нейронов, подверженных риску нейродегенерации

  1. Приготовьте буфер M9 следующим образом: 3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г NaCl, H2O до 1 л. Стерилизуйте автоклавированием. Добавьте 1 мл стерилизованного фильтром 1 М MgSO4. Хранить при комнатной температуре.
  2. Приготовьте яйцевой буфер следующим образом: 118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2 ; Автоклав для стерилизации. Добавьте 2 М стокового раствора HEPES pH 7,3 (предварительно отфильтрованного с помощью фильтра на крышке бутылки 0,2 мкм) до конечной концентрации 25 мМ. Отрегулируйте pH до 7,3 с 1 Н NaOH (не более 10 мл). Используйте осометр, чтобы убедиться, что окончательная осмолярность находится в пределах 335 -345 мОсм. Фильтр стерилизует яйцевой буфер с помощью бутылочных фильтров 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соли легче растворяются при использовании MgCl2 ·6H2O и CaCl2·2H2O для получения соответствующих исходных растворов MgCl2 и CaCl2 . Вы также можете сделать запас из 10 яиц и разбавить его при необходимости в стерильной деионизированной воде.
  3. Приготовьте SDS-DTT следующим образом: 20 мМ HEPES pH 8,0, 0,25% SDS, 200 мМ DTT, 3% сахарозы. В вытяжке для культуры тканей простерилизовать SDS-DTT с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Храните 300 μL аликвот при температуре -20 °C, накрыв фольгой для защиты от света.
  4. Приготовьте раствор проназы следующим образом: приготовьте в день диссоциации 15 мг/мл проназы в яйцевом буфере. Хранить на льду.

8. Возрастная синхронизация для нейроноспецифичных FACS

  1. Используйте животных, которые сочетают генотип эксайтотоксичности (и другие мутации, по желанию) с трансгенной экспрессией сильного флуоресцентного маркера, который можно легко использовать для сортировки (например, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. Выращивайте животных на двух или трех 100-мм пластинах NGM/MYOB при температуре 20 °C, пока пластина не заполнится преимущественно гравидными червями.
  2. Смойте червей с пластин с помощью буфера M9. Перенесите червей в конические пробирки объемом 50 мл с помощью стеклянной серологической пипетки объемом 10 мл.
  3. Центрифугируйте при комнатной температуре в течение 2,5 мин при 250х г и удалите надосадочную жидкость.
  4. Суспендировать гранулу червя в 10 мл раствора отбеливателя (2% 10 Н NaOH и 5% свежего бытового отбеливателя в стерильной деионизированной воде).
  5. Установите трубки на шейкер горизонтально, покачивайте на небольшой скорости. Следите за тем, чтобы черви не оседали на дно трубки. Отбеливатель вскрывает кутикулу червя, но не влияет на эмбрионы, которые защищены яичной скорлупой.
    1. Этот этап отбеливания занимает примерно 5 минут, но это может варьироваться. Чтобы избежать чрезмерного обесцвечивания, контролируйте процесс, извлекая образец каждую минуту: аккуратно пипетируйте 10 мкл из каждой пробирки на предметном стекле стеклянного микроскопа и исследуйте червей с помощью препарирующего микроскопа.
  6. После того, как большая часть гравидных червей будет раскрыта, но не полностью растворится, остановите этап отбеливания, заполнив конические трубки буфером для яиц.
  7. Чтобы извлечь яйцеклетки/эмбрионы, центрифугируйте пробирки при 250x g в течение 2,5 минут, удалите надосадочную жидкость и снова промойте яйцевым буфером.
  8. Повторите еще четыре промывки.
  9. Повторно суспендируйте яйца, аккуратно дозируя гранулы, и распределите по четырем 100 мм засеянным пластинам NGM/MYOB. Дайте эмбрионам вылупиться и расти при температуре 20 °C в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь пластины должны быть заполнены преимущественно гравидными червями.
  10. Повторите синхронизацию возраста, повторив этот протокол синхронизации отбеливателя/возраста.
  11. Нанесите яйца пипеткой на восемь 100 мм пластин NGM/MYOB. Дайте животному вылупиться и расти при температуре 20 °C до желаемой личиночной стадии.

9. Диссоциация цельных клеток червей при FACS

  1. Выращивайте синхронизированных червей до желаемой стадии развития. Аккуратно промойте планшеты 100 мм буфером M9 и стеклянными серологическими пипетками и переложите в конические пробирки объемом 50 мл.
  2. Добавьте холодный М9 до 45 мл. Поместите трубки на лед на 30 минут, чтобы позволить червям осесть на дне под действием силы тяжести, в то время как любой остаточный бактериальный мусор с пластин будет плавать в надосадочной жидкости.
  3. Удалите надосадочную жидкость и промойте червей свежим М9.
  4. Повторите 30-минутное погружение силы тяжести на лед.
  5. Удалите надосадочную жидкость, добавьте M9 до 45 мл и центрифугируйте при 250 x g в течение 5 минут.
  6. Переложите гранулу в микроцентрифужную пробирку и добавьте M9 до 1 мл.
  7. Вращайте со скоростью 14 000 об/мин на настольной центрифуге в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
  8. Чтобы нарушить кутикулу, повторно суспендируйте гранулу червя с помощью SDS-DTT, используя (приблизительно) удвоенный объем гранулы, и инкубируйте с покачиванием при комнатной температуре в течение 4 минут для взрослых стадий L2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 4 минут инкубации при SDS-DTT, так как сигнал флуоресцентного белка резко снизится при более длительном лечении SDS-DTT. Поскольку SDS-DTT светочувствителен, его возраст не должен превышать 3 месяцев, поскольку со временем раствор может потерять свою эффективность; Диссоциации лучше всего работают с недавно подготовленным решением SDS-DTT.
  9. Добавьте 1x яйцевой буфер (pH 7,3, 335-345 mOsm) до 1 мл, чтобы остановить лечение SDS-DTT.
  10. Вращайте со скоростью 14 000 об/мин на настольной центрифуге в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
  11. Чтобы еще больше нарушить работу кутикулы и диссоциировать клетки животных, суспендируйте гранулу раствором проназы комнатной температуры, используя в три раза больший объем гранулы.
  12. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15-30 минут.
  13. Пипеткой P-200 или P-1000 делайте пипетку вверх и вниз 40 раз каждые 5 минут, касаясь наконечником пипетки дна пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление, создаваемое соприкосновением наконечника с дном трубки, способствует диссоциации червяка. Используйте наконечник фильтра, чтобы черви случайно не попали в шахту пипетки во время быстрого пипетирования.
  14. Через 15 мин проверьте прогресс диссоциации червя, аккуратно пипетируя 5 мкл на предметном стекле и наблюдая за прогрессом под препарирующим микроскопом. Когда большинство (~90%) неповрежденных червей лопаются, процесс завершается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация проназы может быть продлена, если многие черви остаются неповрежденными.
  15. В капюшон для клеточных культур добавьте 1x яйцевой буфер объемом до 1,5 мл, чтобы остановить обработку проназой.
  16. Переложите в пробирки FACS, добавьте 5 мл яйцевого буфера и вращайте при 800 x g в течение 5 минут.
  17. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 3 мл яйцевого буфера.
  18. Поместите колпачок фильтра 70 мкм на новые пробирки FACS, суспензию ячеек пипетки на сетчатый фильтр и вращайте при давлении 800 x g в течение 1 минуты. Соберите суспензию клеток откачивания.
  19. Поместите колпачок сетчатого фильтра 5 μм на новые пробирки FACS, суспензию пипеток на сетчатый фильтр и вращайте со скоростью 800 x g в течение 1 минуты.
  20. Добавьте DAPI до конечной концентрации 0,5 мкг/мл в яйцевой буфер, поместите на лед с крышкой/крышкой для защиты от света.
  21. Выполните FACS как можно скорее. Сигнал флуоресцентного белка уменьшается со временем и воздействием света, поэтому важно выполнить протокол диссоциации как можно быстрее и выполнить FACS сразу после завершения диссоциации.
    Примечание: Протокол диссоциации червей был адаптирован из протоколов из лабораторий Миллера 55,56,57, Мерфи 58 и Шахама59.

10. Модификации работы машины FACS для идентификации нейронов C. elegans

  1. Используйте 4 литра охлажденного (4 °C) яйцевого буфера вместо стандартной жидкости оболочки при сортировке нейронов C. elegans .
    Примечание: Осмолярность клеток C. elegans намного выше, чем у клеток млекопитающих, и стандартная жидкость оболочки может лопнуть нейроны. Все настройки и калибровки машины выполняются после добавления буфера для яиц, поскольку вязкость буфера для яиц отличается от вязкости стандартной жидкости оболочки. Техник по сортировке пропустит диагностические шарики через машину, чтобы убедиться, что лазеры работают должным образом.
  2. Когда отсортированные нейроны будут использоваться в последующих исследованиях транскриптомики, отсортируйте минимум 100 000 клеток GFP+ непосредственно в 800 мкл тризол-LS + 10 мкл ингибитора РНКазы.
  3. Инвертируйте клетки в Тризоле 15 раз для перемешивания.
  4. Заморозьте в ванне с сухим льдом и этанолом и храните при температуре -80 °C до тех пор, пока не будете готовы извлечь РНК из всех образцов для одного эксперимента по секвенированию РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как большинство отсортированных клеток собираются непосредственно в тризол для анализа транскриптома, обязательно возьмите небольшой образец отсортированных клеток GFP+ (из каждого штамма), собранных в яйцевой буфер, для микроскопической проверки эффективности сортировки.

11.Стратегия стробирования FACS

  1. Для определения положительного сигнала GFP используется лазер с длиной волны 488 нм с фильтром 530/30 и длинночастотным фильтром (LP) 502.
  2. Для идентификации положительных и отрицательных клеток DAPI используйте лазер с длиной волны 405 нм и фильтром 450/50.
  3. Для идентификации аутофлуоресцентных клеток, которые можно принять за GFP-положительные, используется лазер с длиной волны 488 нм с фильтром 610/20 и 595 LP (личное сообщение, Станка Семова, операционный менеджер, Ресурсный центр проточной цитометрии, Университет Рокфеллера).
  4. Выполните стандартную стратегию стробирования и удалите события с большой областью бокового рассеяния (SSC-A) и малой областью прямого рассеяния (FSC-A), которые могут представлять собой скопления клеток и мусора.
  5. Выделите предисловие разбросанными синглетами, а затем боковыми разбросанными синглетами.
  6. Изолируйте клетки с высоким сигналом GFP и низким сигналом автофлуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки с высоким уровнем аутофлуоресценции и низким GFP не являются истинными GFP-положительными клетками.
  7. Порог для гейта GFP+ определяется путем сравнения GFP-клеток (т.е. N2) с GFP+ ячейками55,56.
  8. Удалите все мертвые клетки с помощью живого/мертвого затвора, основываясь на селективной проницаемости DAPI для мертвых клеток: порог для живого мертвого затвора определяется путем сравнения неокрашенных клеток с окрашенными DAPI клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сортировке нескольких образцов промывайте поток между образцами, чтобы убедиться в отсутствии перекрестного загрязнения.

12. Микроскопия отсортированных нейронов для проверки эффективности стратегии стробирования FACS

  1. Нарисуйте круг на предметном стекле стеклянного микроскопа с помощью жидкоотталкивающей ручки.
  2. Пипетку 10 мкл взвешенных отсортированных клеток в яйцевой буфер внутри круга. Наденьте на образец покровный лист и заклейте его лаком для ногтей по периметру покровного стекла.
  3. После того, как лак для ногтей высохнет, проверьте под вертикальным/инвертированным флуоресцентным микроскопом, что отсортированные клетки действительно в первую очередь являются клетками GFP+.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту проверку после каждого сеанса сортировки для проверки стратегии стробирования FACS57.

13. Экстракция РНК и количественное определение качества РНК на автоматизированной системе электрофореза контроля качества

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с РНК должны выполняться с особой осторожностью, чтобы избежать загрязнения РНКазой (включая тщательную подготовку реагентов, расходных материалов и лучшие безопасные для РНКазы методы).

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы, если образцы содержат фенол и/или хлороформ в вытяжном шкафу.

  1. Разморозьте флаконы с клетками в Тризоле при комнатной температуре.
  2. С помощью наконечника для фильтра Р200 сделайте пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы гомогенизировать образец.
  3. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  4. Добавьте 0,2 мл хлороформа на 1 мл реагента Тризола, используемого для лизиса, затем надежно закройте пробирку.
  5. Переверните трубки 15 раз, и выдерживайте (при 20-25 °C) в течение 2-3 минут.
  6. Центрифугируйте образец в течение 15 минут при 12 000 × г при 4 °C. Смесь разделяется на нижнюю красную фенол-хлороформу, интерфазу и бесцветную верхнюю водную фазу.
  7. Соберите исключительно верхнюю водную фазу, содержащую РНК, и перенесите в новую пробирку с низким уровнем связывания ДНК/РНК объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, если соотношение клеток в яйцезащитном буфере, выпавших из клеточного сортировщика в Тризол, превышает соотношение образец к Тризолу-LS 1:3, высокое содержание соли в яйцевом буфере может привести к инвертированию слоев; если это произошло, добавьте еще Тризол-LS и повторите инверсию и центрифугирование. Этого также можно избежать, если обратить внимание на увеличение объема образца после сортировки; Если соотношение 1:3 не поддерживается, добавьте достаточное количество тризола перед началом экстракции РНК.
  8. Для дальнейшей очистки РНК используют химический состав колонки для экстракции РНК.
  9. Используйте автоматизированную систему электрофореза Quality Control для измерения числа целостности РНК (RIN) и подтверждения RIN РНК 8,0 или выше для ввода в последующие эксперименты по секвенированию РНК.

Результаты

Нематодная модель эксайтотоксичности и идентификация вакуолированных дегенеративных нейронов
Представленные здесь данные воспроизведены из предыдущих публикаций37,38. Для имитации эксайтотоксически инду...

Обсуждение

В то время как распространенные споры и неудачи свидетельствуют о том, что эксайтотоксичность представляет собой исключительно сложный процесс для расшифровки, анализ эксайтотоксичности у нематоды предлагает особенно привлекательную стратегию для освещения консе...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим всех членов Лаборатории Мано и Лаборатории Ли (нынешних и недавних) за их помощь и поддержку. Мы благодарим доктора Монику Дрисколл (Университет Рутгерса) за новаторский анализ некротической нейродегенерации у нематод и обеспечение постоянной поддержки; д-ру Крису Ли (CCNY) за поддержку и советы; Джеффри Уокеру (CCNY Flow Cytometry Core facility), д-ру Бао Вунгу (CCNY) и Станке Семовой (Rockefeller Univ. Sorting Faculty Core) за практическую поддержку и советы по сортировке клеток; д-р Крис Ронго (Университет Рутгерса) за реагенты; Доктора Дэвид Миллер (Университет Вандербильта), Колин Мерфи (Принстонский университет), Шай Шахам, Менахем Кац и Кэтрин Варандас (все трое из Университета Рокфеллера) за протоколы диссоциации C. elegans.

Лаборатория в Мано получила финансирование от NIH NINDS (NS096687, NS098350, NS116028) для I.M., а также через партнерство NIH U54 CCNY-MSKCC (CA132378/CA137788).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

Ссылки

  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523 (2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1 (1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  36. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  37. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  38. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25 (2015).
  39. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060 (2014).
  40. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  41. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  42. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  43. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368 (2020).
  44. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  45. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
  46. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  47. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  48. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  49. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180 (2016).
  50. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  51. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42 (2005).
  52. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  53. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  54. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882 (2019).
  55. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  56. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  57. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены