JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описаны вычислительные инструменты и методы, позволяющие визуализировать и анализировать трех- и четырехмерные данные изображения эмбрионов мышей в контексте осевого удлинения и сегментации, полученные методом оптической проекционной томографии, а также путем живой визуализации и полноразмерного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием многофотонной микроскопии.

Аннотация

Сомитогенез является отличительной чертой эмбрионального развития позвоночных. В течение многих лет исследователи изучали этот процесс в различных организмах, используя широкий спектр методов, охватывающих подходы ex vivo и in vitro. Тем не менее, большинство исследований по-прежнему полагаются на анализ данных двумерной (2D) визуализации, что ограничивает надлежащую оценку процесса развития, такого как осевое расширение и сомитогенез, включающий высокодинамические взаимодействия в сложном 3D-пространстве. Здесь мы описываем методы, которые позволяют мышам получать изображения в реальном времени, обрабатывать наборы данных, визуализировать и анализировать в 3D и 4D для изучения клеток (например, нейромезодермальных предшественников), участвующих в этих процессах развития. Мы также предоставляем пошаговый протокол для оптической проекционной томографии и полноразмерной иммунофлуоресцентной микроскопии у эмбрионов мышей (от подготовки образцов до получения изображений) и показываем конвейер, который мы разработали для обработки и визуализации данных 3D-изображений. Мы расширяем использование некоторых из этих методов и выделяем специфические особенности различного доступного программного обеспечения (например, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira и Imaris), которые могут быть использованы для улучшения нашего текущего понимания осевого расширения и формирования сомита (например, 3D-реконструкции). В целом, описанные здесь методы подчеркивают важность визуализации и анализа 3D-данных в биологии развития и могут помочь другим исследователям лучше рассматривать данные 3D и 4D изображений в контексте осевого расширения и сегментации позвоночных. Наконец, в работе также используются новые инструменты для облегчения обучения эмбриональному развитию позвоночных.

Введение

Формирование оси тела позвоночных является очень сложным и динамичным процессом, происходящим во время эмбрионального развития. В конце гаструляции [у мыши, около эмбрионального дня (E) 8,0], группа клеток-предшественников эпибластов, известных как нейромезодермальные предшественники (NMP), становится ключевым фактором осевого расширения в последовательности голова-хвост, генерируя нервную трубку и параксиальные мезодермальные ткани во время формирования шеи, туловища и хвоста 1,2,3,4 . Интересно, что положение, которое эти НМП занимают в каудальном эпибласте, по-видимому, играет ключевую роль в принятии решения о дифференциации в мезодерму или нейроэктодерму5. Хотя в настоящее время у нас нет точного молекулярного отпечатка для NMP, эти клетки, как правило, считаются коэкспрессирующими T (Brachyury) и Sox2 5,6. Точные механизмы, регулирующие судьбоносные решения NMP (т. Е. Принимают ли они нейронные или мезодермальные пути), только начинают точно определяться. Экспрессия Tbx6 в области примитивной полосы является ранним маркером решения судьбы NMP, так как этот ген участвует в индукции и спецификации мезодермы 6,7. Интересно, что ранние клетки мезодермы, по-видимому, экспрессируют высокие уровни Epha18 и передачи сигналов Wnt / β-катенина, а также Msgn1 также играют важную роль в дифференцировке параксиальной мезодермы и образовании сомита 9,10. Полный пространственно-временной анализ НМП на уровне одной клетки, безусловно, будет способствовать полному пониманию молекулярных механизмов, контролирующих спецификацию мезодермы.

Образование сомитов (предшественников позвонков) является ключевой особенностью позвоночных. Во время осевого удлинения параксиальная мезодерма сегментируется в ряд двусторонних повторяющихся единиц, известных как сомиты. Количество сомитов и время, необходимое для формирования новых сегментов, варьируется у видов11,12. Сомитогенез включает периодические сигнальные колебания (известные как «часы сегментации»), которые могут наблюдаться циклической экспрессией нескольких генов сигнальных путей Notch, Wnt и Fgf в пресомитической мезодерме (например, Lfng)11,12. Современная модель сомитогенеза также постулирует существование «волнового фронта созревания», серии сложных сигнальных градиентов, включающих передачу сигналов Fgf, Wnt и ретиноевой кислоты, которые определяют положение задней границы каждого нового сомита. Поэтому скоординированное взаимодействие между «часами сегментации» и «волновым фронтом созревания» имеет основополагающее значение для генерации этих модулей-предшественников позвонков, поскольку возмущения в этих ключевых морфогенетических процессах могут привести к эмбриональной летальности или к образованию врожденных пороков развития (например, сколиоза)13,14,15.

Несмотря на значительные последние достижения в области методов визуализации, методов анализа биоизображений и программного обеспечения, большинство исследований осевого удлинения и сомитогенеза по-прежнему опираются на одиночные/изолированные двумерные данные изображения (например, срезы), что не позволяет провести полную многомерную визуализацию тканей и затрудняет четкую дифференциацию между патологическими пороками развития (т.е. из-за мутаций) и нормальными морфологическими вариациями, происходящими во время эмбрионального развития16 . Визуализация в 3D уже обнаружила новые морфогенетические движения, ранее не идентифицированные стандартными 2D-методами 17,18,19,20, подчеркивая силу визуализации in toto для понимания механизмов сомитогенеза позвоночных и осевого расширения.

3D- и 4D-микроскопия эмбрионов мышей, особенно живая визуализация, технически сложна и требует критических шагов во время подготовки образцов, сбора изображений и предварительной обработки данных, чтобы обеспечить точный и значимый пространственно-временной анализ. Здесь мы описываем подробный протокол для живой визуализации и иммунофлуоресцентного окрашивания эмбрионов мышей, который может быть использован для изучения как NMP, так и мезодермальных клеток во время осевого расширения и сегментации. Кроме того, мы также описываем протокол оптической проекционной томографии (ОПТ) старых эмбрионов и плодов, который позволяет 3D в тото визуализации и количественной оценке патологических аномалий, которые могут возникнуть в результате проблем во время сомитогенеза (например, сращения костей и сколиоза)13,21,22. Наконец, мы иллюстрируем силу реконструкций 3D-визуализации в изучении и обучении сегментации позвоночных и осевого удлинения.

протокол

Эксперименты с участием животных проводились в соответствии с португальским (Portaria 1005/92) и европейским (Директива 2010/63/EU) законодательствами, касающимися жилья, животноводства и социального обеспечения. Проект был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике "Instituto Gulbenkian de Ciência" и Португальским национальным образованием "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (ссылка на лицензию: 014308).

1. Пробоподготовка для 3D и 4D визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы приводим подробное описание того, как препарировать и готовить эмбрионы мыши от E8.25 до E10.5 для живой визуализации (1.1), эмбрионы E7.5 до E11.5 для полной иммунофлуоресцентной микроскопии (1.2) и плоды для оптической проекционной томографии (1.3).

  1. Пробоподготовка для визуализации в реальном времени
    1. Рассечение эмбриона мыши и подготовка к визуализации в реальном времени (например, LuVeLu reporter 23).
      1. Рассечение эмбрионов мышей между E8.25 и E10.5 в предварительно нагретой среде M2 (37 °C). Аккуратно удалите желточный мешок с помощью чистых щипцов и вымойте эмбрион один раз свежей средой M2, чтобы удалить кровь и мусор, образующиеся во время рассечения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать повреждения эмбриона каким-либо образом, иначе он не будет развиваться должным образом во время процедуры визуализации в реальном времени.
      2. Во время процедуры визуализации в реальном времени инкубируют эмбрионы в нагретой камере (37 °C), в среде 65%O2 и 5%CO2 (сбалансированныйN2 ), в среде DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% HyClone определенной фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия культивирования позволяют эмбриональному развитию происходить в течение примерно 10 ч. Другие протоколы 9,10, использующие другие условия культуры, могут допускать еще более длительные периоды.
  2. Пробоподготовка для иммунофлуоресцентной микроскопии
    1. Процедура рассечения и фиксации эмбриона мыши
      1. Рассечение эмбрионов мышей от E7.5 до E11.5 в холодной (4 °C) фосфатной буферизованной физиологической (PBS) среде или среде M2. После удаления всех внеэмбриональных мембран (например, мембраны Райхарта или желточного мешка) промыть эмбрион в свежем PBS, чтобы удалить кровь и мусор, образующиеся во время процедуры рассечения.
      2. Фиксируют эмбрионы при 4 °C, в 4% параформальдегиде (PFA) в PBS, за время, указанное в таблице 1.
        ВНИМАНИЕ - PFA следует обрабатывать внутри вытяжного шкафа
        Стадия развитияРекомендуемое время фиксации (PFA 4%)
        Е7,51ч30ч.
        Е8,52ч
        Е9,53ч
        Е10,54ч
        Е11,54ч
        Таблица 1 - Время фиксации эмбрионов на разных стадиях развития
      3. После фиксации промывайте эмбрионы не менее двух раз (по 5-10 мин) в PBS, чтобы полностью удалить PFA. На этом этапе эмбрионы могут быть взяты непосредственно в протокол иммунофлуоресцентного окрашивания (этап 1.2.2) или могут быть обезвожены и сохранены для будущего использования (этап 1.2.1.4).
      4. При необходимости храните эмбрионы при -20 °C в 100% метаноле в течение длительных периодов времени.
        1. Для улучшения сохранности тканей обезвоживают эмбрион постепенно с 10% увеличением концентрации метанола (разбавленного в PBS), каждый шаг 10 мин при комнатной температуре (RT) на шейкере, до достижения 100% метанола. Замените 100% метанол один раз, используя свежую аликвоту.
        2. Восстанавливайте замороженные эмбрионы путем регидратации после серии обратного метанола / PBS, каждый шаг 10 мин в RT на шейкере и с окончательными промывками в PBS (дважды, 5-10 мин каждая) перед входом в протокол иммуноокрашения.
          ОСТОРОЖНО - Метанол следует обрабатывать внутри вытяжного шкафа.
    2. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол иммунофлуоресцентного окрашивания был адаптирован из процедуры, описанной в Osorno et al.24. Все промывки должны выполняться на шейкере. После стадии блокировки проводят инкубацию при 4 °C для обеспечения целостности/сохранения антител.
      1. Промывайте эмбрионы три раза (по 30 мин каждый) в PBS, содержащих 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST), а затем один раз в 0,5% PBST в течение 1 часа (RT) для улучшения пермеабилизации.
      2. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание, промыть 1 М глицина в PBS (рН 7,5) в течение 30 мин при RT.
      3. Промыть три раза в 0,1% PBST в течение 30 мин, чтобы полностью удалить глицин.
      4. Инкубировать эмбрионы в течение ночи при 4 °C в блокирующем растворе, содержащем: 3% сыворотки (из видов животных, у которых были вырабатывались вторичные антитела), 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% тритона X-100, в PBS.
      5. Разводят первичные антитела в блокирующем растворе (обычно 1:200 для антител T и Sox2) и инкубируют в течение двух-трех дней при 4 °C.
      6. Перед добавлением вторичных антител промыть эмбрионы три раза (по 30 мин) в 0,1% ПБСТ при 4 °C. Разводят вторичные антитела в блокирующем растворе (1:1000) и инкубируют в течение 2 дней при 4 °С, защищенные от света.
      7. Промывайте эмбрионы шесть раз (по 30 мин каждый) в 0,1% PBST при 4 °C.
      8. Для ядерного контрокрашения инкубируют эмбрионы в 4',6-диамидино-2-фенилиндоле, дигидрохлориде (DAPI), разбавленном 1:500 в ПБСТ, на ночь на шейкере при 4 °C, защищенном от света.
      9. Наконец, промыть эмбрионы три раза (по 30 мин каждый) в 0,1% ПБСТ при 4 °C.
    3. Очистка тканей и подготовка слайдов
      1. Очистка тканей с помощью метилсалицилата или смеси бензилового спирта с бензилбензоатом (BABB)
        1. Перед очисткой с использованием метилсалицилата или BABB полностью обезвоживать эмбрионы, доводя их до 100% метанола, через серию метанола/ PBS, состоящую из последовательного 10% увеличения концентрации метанола (время инкубации 10 мин каждый при 4 °C). Для достижения полного обезвоживания замените 100% метанол на свежий и подождите еще 10 мин.
        2. Выполняют очистку эмбриона путем встраивания в серию метилсалицилата или BABB в метанол с 20% последовательным увеличением концентрации, 20-минутная инкубация для каждой стадии. Когда раствор метилсалицилата или BABB достигнет 100%, внесите два дополнительных изменения для свежего раствора.
          ВНИМАНИЕ: Как метилсалицилат, так и BABB должны обрабатываться внутри вытяжного шкафа.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной очистки важно, чтобы эмбрионы были полностью обезвожены. Также важно, чтобы метанол полностью смешивался с метилсалицилатом или BABB в серии очищающих растворов.
        3. После того, как эмбрионы станут полностью прозрачными, обрабатывайте их индивидуально, используя преимущественно флуоресцентный стереоскоп, чтобы уменьшить вероятность повреждения тканей.
        4. Для визуализации установите эмбрионы либо в вогнутое стекло с углублением 75 мм x 25 мм, либо в защитное стекло 20 мм x 60 мм #1.5. Последний вариант позволит проводить визуализацию с обеих сторон, если это необходимо, но он гораздо более хрупкий и его трудно запечатать. Переносите эмбрионы на предметные стекла микроскопа с помощью зубочистки, тонкого хлопкового наконечника, пипетки Пастера или любого другого подобного инструмента.
        5. Чтобы избежать сжатия эмбрионов, добавьте распорки, изготовленные из осколков покровного стекла No 1 (толщиной 170 мкм), силиконовых или тонких металлических шайб. Затем добавьте каплю монтажного материала, накройте крышкой #1 или #0 20x20 мм и уплотнением.
        6. Если используется стеклянная или металлическая распорка, запечатайте расплавленным парафином для лучшей стабилизации препарата – не запечатывайте лаком для ногтей, потому что он растворяется метилсалицилатом или BABB. Чтобы избежать пузырьков, поместите крышку на одну сторону, а затем, постепенно и осторожно сдвиньте ее в сторону; при необходимости добавьте больше носителя.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, посмотрите видео, чтобы лучше понять, как манипулировать очищенными эмбрионами и как установить их на предметное стекло микроскопа.
      2. Очистка тканей с помощью RapiClear
        1. При использовании RapiClear обезвоживание эмбриона не требуется. После шага 1.2.2.9 поместите эмбрионы в центр вогнутого стеклянного предметного стекла размером 75 мм x 25 мм, удалите весь PBST в депрессионном слайде микроскопа и добавьте 200 мкл очищающего раствора.
        2. Через 10 мин, защищенных от света, когда эмбрионы начнут становиться прозрачными, замените очищающий раствор, подождите еще 20 мин (защищенных от света) и затем сверху укрывкой, начиная с одной стороны и осторожно двигаясь в сторону другую.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Время полной очистки эмбриона может длиться от нескольких минут до ночи в зависимости от стадии и размера эмбрионов. Также весь процесс следует делать под стереомикроскопом. Чтобы лучше понять очистку и подготовку слайдов микроскопа, пожалуйста, ознакомьтесь с видеопротоколом.
  3. Пробоподготовка к оптической проекционной томографии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры были адаптированы из предыдущих протоколов19,25,26. Протокол будет описан для анализа плодов мышей E18.5.
    1. Процедура рассечения и фиксации плода мыши
      1. Рассекните плоды мышей E18.5 в холодном (4 °C) PBS, удалите все внеэмбриональные мембраны, а затем несколько раз промыть плоды в свежем PBS, чтобы удалить кровь и мусор, образующиеся во время процедуры рассечения.
      2. Фиксируйте плоды в 4% PFA, сделанных в PBS, при 4 °C в течение 5 - 7 дней.
      3. Промывайте плоды один раз (15 мин) в PBS, а затем три раза (по 30 мин каждый) в деминерализованной воде или PBS. Выполняйте промывки на шейкере.
      4. Обезвоживать плод путем инкубации (25 мин серии при РТ на шейкере) в растворах метанола повышенной концентрации (10% увеличение разбавлено в деминерализованной воде или ПБС) до 100% метанола.
      5. Замените 100% раствор метанола (используйте свежую аликвоту) три раза (по 20 мин каждый), чтобы обеспечить полное обезвоживание. Затем эмбрионы могут храниться при -20 °C или приниматься непосредственно (через один день) в процесс отбеливания (этап 1.3.2).
    2. Процесс отбеливания
      1. Чтобы удалить естественную пигментацию, инкубируют плоды (отдельно) на шейкере, сначала в течение одного дня в 5%H202 в метаноле, а затем в 10% H202 в метаноле в течение 3 дней, пока эмбрионы не потеряют всю естественную пигментацию.
        ВНИМАНИЕ: H2O2 следует осторожно обрабатывать внутри вытяжного шкафа. Отбеливающий раствор, содержащийН2О2при контакте с образцом, создает пары и, следовательно, трубка, содержащая плоды, должна оставаться открытой в течение всей процедуры отбеливания. Некоторые протоколы отбеливания предполагают сочетаниеH2O2 с формамидом. Если используется эта альтернатива, необходимо проявлять особую осторожность, так как добавление H2O2 к неразбавленному формамиду может привести к взрыву.
      2. Постепенно регидратируют эмбрионы в обратном метанольном ряду (с уменьшением на 10%)) в деминерализованной воде, каждый инкубируют в течение 20 мин при РТ на шейкере, и, наконец, промыть три раза (по 30 мин) в деминерализованной воде. Подождите один день, замените деминерализованную воду и продолжайте дальше.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативный результат процесса отбеливания см. на дополнительном рисунке 1 .
    3. Протокол деминерализации
      ПРИМЕЧАНИЕ: Деминерализация является необязательной, но рекомендуется для плодов или щенков.
      1. Выполняют деминерализацию путем промывания плодов в 0,1 М ЭДТА при 42 °C в течение нескольких часов [см. также Cho et al.27] с последующим пяти промывками (по 20 мин каждая) деминерализованной водой для полного удаления ЭДТА. Выполняйте все процедуры на шейкере.
    4. Пробоподготовка к очистке
      1. Встраивание плодов в 1% блок агарозы. Для подготовки этих блоков заполните 50 мл пластиковую трубку или шприц (построив цилиндрическое пространство, отрезав выходную сторону шприца и используя плунжер для блокировки противоположной стороны) расплавленной агарозой, поместите плод в агарозу в вертикальное положение и удерживайте это положение в центре блока с помощью щипцов во время затвердевания агарозы.
      2. Поместите форму с блоком при 4 °C (30 мин), чтобы агароза полностью желеобразилась. В случае неправильного позиционирования плода внутри блока или появления пузырьков воздуха расплавите агарозу, поместив блок при 50 °C на ночь, и повторите процедуру на следующий день.
      3. Удалите блок агарозы с плодом из плесени и поместите его в емкость с деминерализованной водой. Заменить свежей деминерализованной водой через 15 мин.
      4. Перед очисткой с помощью BABB обезвоживание образца. Чтобы лучше сохранить целостность тканей, выполняйте обезвоживание плода постепенно с 10% увеличением концентрации метанола (разбавленного в деминерализованной воде или PBS), каждый шаг в течение более 45 мин при РТ на шейкере, до достижения 100% метанола.
      5. Меняйте 100% метанол (используйте свежую аликвоту) сначала четыре раза с интервалом в один час, а затем снова на следующий день, чтобы обеспечить полное обезвоживание.
    5. Процесс очистки и монтажа образцов для визуализации OPT
      1. Очистите плоды на шейкере через серию (по 2,5 часа каждая) раствора BABB в метаноле, с 25% увеличением концентрации BABB, до достижения 100% BABB.
      2. Заменяйте раствор BABB на свежий каждый день, пока плод не станет полностью прозрачным. Этот процесс может занять от 3 до 5 дней. Держите блок, содержащий плод, на шейкере в течение всей процедуры. Плоды могут оставаться в 100% растворе BABB в течение длительных периодов времени.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если плод неправильно обезвожен, он станет слегка полупрозрачным («белесая» эмульсия) после первого добавления BABB. Если это произойдет, вернитесь к чистому метанолу и выполните две дополнительные промывки в свежем метаноле. Никогда не охлаждайте образцы во время обезвоживания и очистки, так как изменения температуры могут привести к конденсации воды.
      3. Прикрепите очищенный блок агарозы к оси двигателя сканера OPT, настройте оптику для получения изображения всего плода и приступайте к получению полного набора проекционных данных19,28.

2. Микроскоп / Получение изображений

  1. Для правильной 3D- и 4D-визуализации выберите микроскоп, который наилучшим образом соответствует экспериментальной цели. В таблице 2 приводится общая информация для руководства выбором.
Методы оптической микроскопииПринцип визуализацииЭкспериментальная цель и соображения
Широкоугольная визуализацияИспользует флуоресценцию, отраженный или проходящий свет.Идеально подходит для быстрого и общего обзора эмбриона (например, для скрининга и оценки стадий развития и очевидных фенотипов). Уменьшенная глубина резкости по сравнению с наблюдаемой толщиной при больших увеличениях не позволяет точно интерпретировать или анализировать 3D-морфологию.
Конфокальные (лазерное сканирование; CLSM)Использует лазерное сканирование подсветки и обнаружение флуоресценции через точечное отверстие.Позволяет визуализировать оптические срезы флуоресцентно меченых образцов, в идеале с сильным сигналом. Визуализация через точечное отверстие удаляет сигнал из глубины резкости, тем самым позволяя точно различать информацию в 3D. Приобретение происходит на порядки медленнее, чем широкоугольное, но с беспрецедентной контрастностью и 3D-дискриминацией морфологии. Высокое временное разрешение недостижимо, поскольку изображения приобретаются по 1 пикселю за раз. Хорошо подходит для 3D-визуализации фиксированных эмбрионов мышей до E9.5. Визуализация через всю пресомитовую мезодерму или сомиты требует очистки тканей из-за рассеяния света в более глубоких тканях. Фототоксичность и отбеливание являются важными. Фотоотбеливание может в определенных пределах компенсироваться задним числом. Однако фототоксические эффекты в живых образцах не могут, и часто их нелегко определить. Это более очевидно, если образцы показывают низкую экспрессию, и необходимы высокие мощности лазера.
Флуоресценция двухфотонного возбуждения (TPEFM)Он использует импульсное ближнее инфракрасное (NIR) лазерное возбуждение вместо видимого лазерного освещения.TPEFM позволяет проводить оптическую нарезку через более толстые образцы, чем CLSM. Разрешение немного ниже, но контраст в более глубоких тканях значительно лучше, что делает его идеальным для живой визуализации эмбрионов мышей. Хотя TPEFM часто считается менее фототоксичным, чем обычный CLSM, он требует высокой мощности лазера, который также может оказывать вредное воздействие на клетки и ткани. Идеально подходит для 3D-визуализации эмбрионов до E11.5, хотя визуализация через всю пресомитовую мезодерму по-прежнему требует очистки тканей.
Конфокальный (вращающийся диск)Форма конфокала, которая вместо одного лазера использует несколько точечных источников.Использование нескольких точечных структур позволяет быстрее создавать оптические срезы (достижимо несколько кадров в секунду или стеков в минуту), чем CLSM. Приобретение происходит практически так же быстро, как и широкоугольное, с разумной 3D-дискриминацией. Тем не менее, он позволяет визуализировать только самые поверхностные ткани эмбриона мыши. Обеспечивает более чувствительное обнаружение, чем CLSM, что делает его альтернативой для эмбрионов с низкой экспрессией флуоресцентных белков.
Световой лист / одиночная плоскость (LSFM/SPIM)Вместо широкоугольного или точечного освещения образец освещается по одной ортогональной плоскости за раз. В большинстве конфигураций он позволяет создавать изображения под несколькими углами.Также требуются образцы с флуоресцентной маркировкой. Получение оптических срезов происходит чрезвычайно быстро (несколько кадров в секунду) и имеет уменьшенные эффекты фототоксичности или отбеливания. Однако, если требуется множественное представление, последующие этапы предварительной обработки набора данных могут потребовать часов / дней вычислений. LSFM/SPIM позволяет лучше обнаруживать более низкие уровни экспрессии, чем CLSM. Идеально подходит для 3D-визуализации эмбрионов мышей in toto во время гаструляции. Образцы часто необходимо монтировать и поддерживать в суспензии (нетрадиционная подготовка).
Оптическая проекционная томография (ОПТ)Оптические срезы не обнаруживаются, а вычисляются по серии широкоугольных изображений всего эмбриона под разными углами («проекции»).Идеально подходит для 3D-визуализации эмбрионов / плодов мышей на более поздней стадии (>5 мм), но только фиксированных и очищенных. Имеет преимущество в производстве 3D-стеков оптических срезов как флуоресцентных, так и нефлуоресцентных образцов. Наборы данных являются изометрическими (срезы с равным разрешением во всех трех измерениях), что делает его идеальным для анатомического анализа. Получение набора проекционных данных может занять всего несколько минут, а затем 15-30 минут реконструкции.
Оптическая когерентная томография (OCT)Использует NIR-освещение через образец для получения оптических срезов на основе интерференции с отражением света.OCT позволяет легко визуализировать живую ткань (несколько миллиметров вглубь образца без флуоресцентного контраста) с разрешением в несколько десятков микрометров. Приобретение происходит очень быстро (несколько ломтиков в секунду). Хотя это возможная альтернатива для OPT, этот метод обычно не доступен.
Сверхразрешение (SR), атомная сила (AFM) или визуализация ближнего поля (NSOM)SR обычно основан на одномолекулярной локализации и AFM/NSOM на сканирующих поверхностях с субдифракционным разрешением (несколько нанометров).Позволяет получать изображения на субдифракционном уровне (разрешение <200 нм), часто с целью обнаружения отдельных молекул или молекул на поверхности клетки. Не идеально подходит для морфологического анализа больших образцов, таких как эмбрионы мышей. Сбор обычно происходит медленно (от секунд до минут на изображение).

Таблица 2 - Общая информация для выбора метода визуализации / микроскопа, более подходящего для конкретной экспериментальной цели исследователя.

3. Предварительная обработка набора данных изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы выделяем некоторые из ключевых этапов предварительной обработки набора данных изображений, а именно шумоподавление (3.1) и деконволюцию (3.2), и предоставляем алгоритмы, которые позволяют правильно подготовить и предварительно обработать наборы 3D-данных временных рядов (3.3) и иммунофлуоресцентных окрашиваний (3.4). Наконец, мы указываем ссылки, которые подробно описывают протокол предварительной обработки и реконструкции набора данных OPT.

  1. Шумоподавление
    1. Если изображения показывают пониженное отношение сигнал/шум, рассмотрите возможность применения классического метода, такого как фильтр «Медиана» или «Анизотропная диффузия», доступных в Fiji/ImageJ29, или более сложного метода, основанного на машинном обучении, такого как «CARE»30 или «Noise2Void»31.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно актуально для наборов данных изображений в реальном времени, где фотоотбеливание и фотоповреждения являются серьезной проблемой, и необходимы более низкие экспозиции и более высокие усиления детектора.
  2. Деконволюция
    1. Если изображения были получены с высоким разрешением (вблизи или при выборке Найквиста), рассмотрите возможность восстановления изображения с деконволюцией для повышения качества набора данных перед анализом. Имейте в виду, что некоторые инструменты деконволюции также включают этап шумоподавления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вопрос был подробно рассмотрен в Krull et al.32 и в документации, доступной на веб-сайте программного обеспечения для деконволюции Huygens (https://svi.nl/HomePage).
  3. Подготовка временных рядов набора 3D-данных для правильной визуализации и анализа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто дрейф эмбриона или стадии может произойти во время покадровой визуализации. Это необходимо исправить перед выполнением анализа. Иногда дрейф настолько серьезен, что приобретение необходимо прервать и внести коррективы. В этом случае лучше всего сохранить те же размеры X, Y и Z.
    1. Отдельные 4D-стеки могут быть объединены в один гиперстек 4D с помощью функции «конкатенировать» Фиджи. Однако этот инструмент не обрабатывает композитные/гиперстеки, поэтому необходимо преобразовать все 4D-сегменты в простые стеки с помощью операции Image | Гиперстеки | Гиперстек в стек. Сохраните некоторую систему нумерации, чтобы поддерживать порядок этих 4D-сегментов и запишите информацию о каждом из них (каналы, срезы, временные точки). Повторите процедуру для всех сегментов, а затем объедините их с помощью процедуры Image | Стеки | Инструменты | Сцепление.
    2. Восстановите сцепленный гиперстек с помощью операции Image | Гиперстеки | Переложите в Hyperstack и выберите правильный порядок различных размеров. Проверьте Hyperstack, чтобы убедиться, что все измерения правильно упорядочены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каналов (c) и slices (z) должно быть одинаковым для всех сегментов 4D; количество (временных) кадров (t) должно быть равно сумме временных точек, добавленных для всех сегментов 4D. Важно просмотреть стек, чтобы понять, как интерполируются различные измерения, прежде чем выполнять преобразование в гиперстек. Fiji/ImageJ по умолчанию — чередующиеся каналы, затем чередующиеся Z-срезы, а затем чередующиеся временные точки («XYCZT»). Убедитесь, что это относится к данным, генерируемым микроскопом.
    3. Выберите «Композитный» в качестве режима отображения и сохраните в формате TIFF. Для больших наборов данных рассмотрите возможность преобразования в формат BigDataViewer33 , выполнив операцию Plugins | | BigDataViewer Экспортируйте текущее изображение в формате XML/HDF5. Это создает набор данных, который можно просматривать более эффективно и в 3D с помощью BigDataViewer и может обрабатываться другими инструментами Fiji / ImageJ для наборов данных больших данных.
    4. Зарегистрируйте сцепленный гиперстек (временные ряды 3D-стеков) для компенсации дрейфа эмбриона/стадии с помощью плагина ImageJ34 «Правильный 3D-дрейф» или плагина BigStitcher35, в зависимости от степени необходимой коррекции дрейфа. Файлы XML/HDF5 можно открыть с помощью BigStitcher.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо выполнить регистрацию 3D-таймлапсов, которые показывают дрейф эмбриона, перед любой попыткой выполнить отслеживание клеток или анализ движения; коррекция дрейфа также необходима для правильной интерпретации морфогенетических движений.
  4. Предварительная обработка наборов данных иммунофлуоресцентной визуализации
    1. Затухание сигнала Z-глубины
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя метод, который мы предлагаем для коррекции затухания сигнала, может быть полезен, его следует использовать осторожно, так как часто меньший глубинный сигнал может фактически отражать биологическое, а не оптическое явление. Рассмотрите возможность измерения распада в области ткани, где интересующая молекула не должна присутствовать или выражаться, и скорректировать компенсацию для этой области. Если все еще есть более низкий положительный сигнал в глубине, это может выявить фактическое биологическое явление. Учтите также, что некоторые области образца могут производить большее рассеяние или лазерное затухание, чем другие, и что это не будет полностью исправлено с помощью этого простого метода.
      1. Для эмбрионов более толстой/поздней стадии затухание пучка, фотоотбеливание и сферическая аберрация, вызванные несоответствием показателей преломления (между монтажной средой и объективом микроскопа), могут привести к наборам данных, в которых интенсивность флуоресценции значительно ослаблена в более глубоких срезах Z-стека. Поэтому компенсируйте эту потерю сигнала перед анализом. Определение аналитически наиболее точного затухания является сложным и сильно зависит от выборки36, но быстрое приближение может быть определено эмпирически в ImageJ/Fiji с использованием Process | Математические | Функция макроса и нажатие на Предварительный просмотр.
      2. Загрузите Z-стек в Fiji/ImageJ и выполните процедуру Image | Стеки | Реликвия. Начните с: вверху, установите флажок Избегать интерполяции и ОК. Теперь «Z» будет осью «Y». Далее выполните | изображений таблицы подстановки (LUT) | Огонь (или любой другой разноцветный ЛТУ). Это поможет визуально оценить наилучшую компенсацию на следующих этапах. Переключитесь на срез в середине эмбриона, где хорошо видны эффекты затухания в глубине (интенсивность падает сверху [поверхностно] на дно [глубже]).
      3. Приступаем к определению коррекции вертикального («y») падения интенсивности с помощью процедуры Process | Математические | Выполните макрос и добавьте следующий «Код» в точности так, как написано здесь:
        v = v * A * exp ( B * y/h )
        В этом выражении «v» — переменная для интенсивности пикселей (которая будет корректироваться как функция по глубине), «y» — переменная для глубины, а «h» — для полной глубины, а «exp» — экспоненциальная функция; "A" следует заменить числом от 0,5 до 1,0 (выбирайте более низкие значения, чтобы избежать перенасыщения верхних слоев Z-стека); B заменяется числом между 0,5 и 2,0, в зависимости от того, насколько сильным является затухание Z-глубины - в идеале оно должно быть 1, однако в некоторых случаях для правильной компенсации нижних слоев необходимо меньше (или больше); более высокое значение B приведет к большей компенсации затухания. Нажмите «Предварительный просмотр», чтобы сделать первую оценку. Протестируйте различные значения A и B до получения адекватной компенсации сверху вниз изображения (LUT «Огонь» может быть полезен для этой оценки). Когда это будет выполнено, примените параметры, нажав кнопку ОК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть выполнено в каждом канале индивидуально, потому что красители с красным смещением и лазеры могут ослабевать меньше, а некоторые красители отбеливаются быстрее, чем другие. Имейте в виду, что эта процедура может быть недостаточно точной, чтобы обеспечить надежную количественную оценку изменений интенсивности флуоресценции в глубине, хотя она, безусловно, более надежна, чем выполнение количественных оценок непосредственно в исходном наборе данных 3D, на который серьезно влияет ослабление сигнала в глубине. Одним из способов выявления и контроля этого эффекта является сравнение изображений различных эмбрионов с дорсальной или вентральной сторон.
      4. Восстановите исходную геометрию компенсированного Z-стека, выполнив image | Стеки | Reslice, начните сверху, держите галочку Избегайте интерполяции , и теперь «Y» должна снова стать плоскостью «Z»; Замените цвет, выполнив команду "Image | Таблицы подстановки | Серые» (или другой ЛТУ по выбору). Отбросьте исходный некомпенсированный z-стек и сохраните компенсированную версию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: См. дополнительный рисунок 2 в качестве репрезентативного результата метода затухания сигнала Z-глубины.
    2. Коррекция масштабирования по оси Z
      1. Если визуализация с целью, предназначенной для показателя преломления, отличного от того, который используется для монтажа эмбрионов, необходимо выполнить повторное масштабирование толщины среза, в противном случае измерения глубины будут неправильными (потенциально на 50% при использовании «сухого» объектива на очищенном тканью эмбрионе). Это объясняется, рассматривается и различные методы обсуждаются в 37 и 38. Аналитическое определение фактической шкалы искажений оси Z является сложным, но приемлемое приближение может быть легко определено путем нахождения соотношения между показателем преломления образца и показателем преломления объектива (например, 1,53/1,0 для очищенного метилсалицилатом эмбриона, изображенного с сухим объективом 20 x, или 1,56/1,33 для эмбриона, очищенного с помощью BABB и изображенного с целью погружения в воду).
      2. Поскольку набор данных Z-стека уже открыт в Fiji/ImageJ (для многоканальных изображений после того, как они были собраны как «составные» со всеми каналами), перейдите в Image | Свойства и изменение глубины вокселя на толщину среза, полученного при получении изображения, умноженное на коррекцию масштабирования оси Z, определенную на предыдущем шаге (4.2.1; Раздел "Предварительная обработка набора данных изображений"). Подтвердите результат с помощью | Image Стеки | Ортогональные виды.
    3. Репозиционирование эмбриона в анатомически стандартное положение с использованием Fiji/ImageJ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репозиционирование эмбриона (см. преимущества, выделенные в Дополнительный рисунок 3) в стандартизированное передне-заднее [A-P] и дорсально-вентральное [D-V] положение оси с использованием Fiji/ImageJ, требует установки TransformJ 39 набор плагинов с веб-сайта обновления "ImageScience" на Фиджи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод предпочтительнее раундов вращений в трех плоскостях, которые вводят артефакты сглаживания и ухудшение разрешения. Однако, поскольку подключаемый модуль просмотра 3D Fiji/ImageJ не может правильно обрабатывать наборы данных размером более 200-300 Мб (плагин может не отображать или демонстрировать непредсказуемое поведение при попытке повернуть угол обзора), исходный набор 3D-данных должен быть сначала уменьшен.
      1. Начните с уменьшения размера набора данных в | изображений Фиджи Масштабируйте , а затем вставьте значения «шкалы» X, Y и Z, необходимые для уменьшения набора данных до менее чем 200 Мб (например, понижающая выборка 0,5 x 0,5 x 0,5 приведет к уменьшению набора данных в 8 раз). Убедитесь, что установлен флажок Создать новое окно .
      2. Затем перейдите в раздел Плагины | 3D viewer. В окне просмотра 3D нажмите на эмбрион, чтобы выбрать его, и должно появиться красное 3D-окно. При использовании этого режима (с активированным красным полем) поворотом набора данных можно управлять с помощью мыши, в отличие от поведения по умолчанию, которое заключается в повороте угла обзора. При перемещении эмбриона с помощью мыши никогда не щелкайте снаружи, иначе набор данных будет снят.
      3. Когда вы удовлетворены новым положением эмбриона, выберите Редактировать | | трансформации Экспорт преобразованного изображения в меню окна "3D viewer". Чтобы осмотреть различные ортогональные плоскости, перейдите в Image | Стеки | Ортогональные виды. Если эмбрион неправильно позиционируется, закройте окно и вернитесь в окно 3D-просмотра и снова настройте его. Повторите шаг 4.3.2.
      4. Когда эмбрион правильно позиционируется, выберите в окне «3D-просмотрщик» меню «Редактировать | | трансформации Сохраните transform и сохраните матрицу преобразования в текстовый файл с расширением *.mat. Откройте этот текстовый файл с помощью Fiji/ImageJ, удалите первые две строки (текст) и повторно сохраните. Это создает файл матрицы преобразования, совместимый с плагином "TransformJ", описанным в 39.
      5. Переключитесь на набор данных полного разрешения (может быть многоканальным композитным гиперстеком) и выполните операцию Плагины | | TransformJ Аффина TransformJ. В новом окне выполните поиск ранее сохраненного матричного файла, выберите интерполяцию Cubic B-Spline | ресамплей изотропно | Хорошо.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта операция интенсивно использует память и процессор. В зависимости от рабочей станции и размера набора данных операция может занять от нескольких минут до нескольких часов. Использование параметра ресамплей изотропно гарантирует, что во время операции преобразования не будет потеряно разрешение, поэтому набор данных значительно увеличится в размерах и больше не будет анизотропным, как исходный конфокальный z-стек; следует ожидать, что количество срезов по оси Z увеличивается до одинакового количества пикселей X и Y каждого фрагмента, а стек раздувается до 5-10 раз от исходного размера. Это необходимо для того, чтобы гарантировать, что никакая информация не будет потеряна в ходе интерполяции вокселей во время вращения и трансляции.
      6. Как только эмбрион правильно репозиционирован, часто можно обрезать большую часть пустого пространства, созданного вокруг эмбриона. Выполните полную Z-проекцию image | Стеки | Z Проект... и выберите Максимальная интенсивность; нарисуйте минимальную рентабельность инвестиций, содержащую весь эмбрион в X и Y. Переключитесь на окна исходного набора данных, перейдите в раздел Редактировать | | выбора Восстановите выделение и обрежьте, выбрав Изображение | обрезку.
      7. Обрежьте срезы в начале и конце, которые не пересекают ткани эмбриона. Для этого выберите | изображений Стеки | Инструменты | Slice remover и укажите первый и последний фрагмент для удаления, обязательно изменив «приращение» на 1 (в противном случае он удаляет только каждый второй фрагмент).
      8. После изменения положения и обрезки нового набора данных обязательно сохраните его как новый TIFF-файл. Если этот набор данных слишком велик (больше, чем оперативная память графического процессора), рассмотрите возможность использования BigDataViewer для экспорта в формате XML/DHF5, как описано в шаге 3.3 (из раздела «Предварительная обработка набора данных изображений»).
  5. Предварительная обработка и реконструкция набора данных OPT
    1. Используйте протокол для предварительной обработки и реконструкции набора данных OPT, описанный в Martins et al.19 и Gualda et al.28.

4.3D рендеринг, визуализация и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы предоставляем список возможных применений различных программных инструментов, которые позволяют или улучшают визуализацию и анализ наборов данных 3D-изображений.

  1. 3D-рендеринг и визуализация с помощью Drishti
    ПРИМЕЧАНИЕ: Drishti40 - это бесплатное научное программное обеспечение для визуализации, предназначенное для изучения и представления наборов данных 3D и 4D из микро-КТ, конфокальной / многофотонной и световой микроскопии. Здесь мы используем это программное обеспечение для 3D-рендеринга и визуализации иммунофлуоресцентного окрашивания (шаг 2; Раздел «Пробоподготовка к 3D-визуализации»). В Интернете есть несколько учебных пособий, которые помогут пользователям понять, как управлять Drishti; поиск в Интернете по запросу "Аджай Лимайе Дришти 3D учебники". Drishti не может напрямую читать стеки файлов TIFF, поэтому они должны быть преобразованы сначала в родной формат «pvl.nc».
    1. Запустите инструмент "drishtiimport.exe", расположенный в папке установки Drishti: Файлы | Загрузка | Файлы | выберите «Файлы изображений TIFF в градациях серого» и загрузите одноканальный 3D-стек, сохраненный из Fiji/ImageJ. В случае многоканального композитного стека разделите каналы в Fiji/ImageJ и сохраните каждый по отдельности. Тип вокселя – «ушорт»; "Файл"..."Сохранить как"..."TIF", ответьте "y" на все вопросы. В окне Дополнительная информация , запрашивающая размер вокселя, обязательно добавьте правильные размеры вокселя "X Y Z".
    2. Загрузка *.pvl.nc файлов в Drishti и рендеринг: В главном окне Drishti, Файл | Загрузка | Загрузка 1 ( - 4 ) томов в зависимости от количества доступных каналов (в виде отдельных файлов). После загрузки нажмите клавишу F2 для получения высококачественного рендеринга. Для этого действия требуется мощная видеокарта. Информация для обработки параметров рендеринга, редактор функций передачи, поиск в онлайн-учебниках. Удовлетворившись свойствами рендеринга, приступайте к созданию анимированного рендеринга.
    3. Перейдите в раздел Просмотр и активируйте редактор ключевых кадров. Обработайте эмбрион и поместите его в нужное исходное положение. Используйте правую кнопку мыши, чтобы «перетащить» эмбрион в центр, если это необходимо, или прокрутите мышь для масштабирования. Нажмите установить ключевой кадр в редакторе ключевых кадров, затем выберите другое положение, угол или масштаб, перетащите маркер временной линии в другую точку времени и снова установите ключевой кадр . Теперь есть 2 ключевых кадра, где эмбрион представлен в 2 разных положениях / углах / зуме и нескольких кадрах между ними. Нажав кнопку Play , Drishti может интерполировать недостающие условия и воспроизводить его как анимацию. Перейти к файлу | Сохраните последовательность изображений , чтобы сохранить анимированную последовательность всех кадров. Эта последовательность кадров позже может быть открыта в Fiji/ImageJ и сохранена как AVI (File | Импорт | Последовательность изображений ... Файл | Сохранить как | Сжатие JPEG с разумной частотой кадров (мы предлагаем 15 - 30).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя Drishti позволяет сохранять *.wmv видео, рекомендуется вместо этого сохранять в виде отдельных кадров и только позже конвертировать серию в формат видео AVI или MOV (это можно сделать с помощью Fiji / ImageJ).
  2. 3D-восстановление и ручная сегментация тканей с помощью Amira
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это коммерческое программное обеспечение позволяет вручную или автоматически/полуавтоматически сегментировать 3D-ткани эмбриональных тканей в наборах 3D-данных. Существует онлайн-«Учебный центр» для этого программного обеспечения с несколькими учебными пособиями, доступными 41. Ниже описаны основные этапы, необходимые для ручного сегментирования эмбриональных тканей из эмбрионов, окрашенных иммунофлуоресценцией (этап 1.2). Ручная сегментация намного проще после правильного позиционирования эмбриона по стандартной оси A-P/D-V (см. раздел «Предварительная обработка набора данных изображения», шаг 4.3).
    1. Загрузите набор данных 3D TIFF. Убедитесь, что укажите правильные размеры вокселя, когда появится соответствующий запрос. Создайте и подключите модуль визуализации (например, «Orthoslice» или «Volren») и проверьте набор данных в 3D.
    2. Подключите поле «Метка» (или «Изменить новое поле метки» в более новых версиях Amira). В этом программном обеспечении результаты ручной сегментации хранятся в «материалах», поэтому создайте по одному материалу для каждой интересующей ткани. Используйте инструмент «лассо» для ручной сегментации. Существует несколько учебных пособий, объясняющих, как это сделать (поиск в Интернете по «Учебнику по редактору сегментации Amira»).
    3. Закончив сегментацию всех интересующих тканей, выйдите из редактора сегментации , переключившись обратно в режим project . Создав новую версию набора данных («поле меток», которое теперь прикреплено к исходному модулю набора данных), в которой пиксели, принадлежащие каждому материалу, имеют одинаковое значение.
    4. Преобразуйте эти «материалы» в 3D-объекты, генерируя 3D-модели поверхностей из набора данных «Метки». Это можно сделать, подключив модуль «Создать поверхность», регулируя параметры по мере необходимости (активируйте опции «компактифицировать», «граница», «Регулировать коорды» и «Неограниченное сглаживание»). Нажмите Применить , и будет сгенерирован новый модуль *.surf.
    5. Визуализация поверхностных объектов, извлечение и экспорт по отдельности в виде файлов *obj. Подключение | дисплея Модуль SurfaceView в модуль *.surf, и проверка в главном просмотрщике. В панели «Свойства» модуля «SurfaceView» в свойстве «Материалы» выберите Все + Все и нажмите « Удалить», чтобы буфер зрителя был очищен. Затем во втором выпадающем опускании свойства Materials выберите только один материал и нажмите кнопку Добавить в буфер; только этот материал должен быть виден.
    6. В свойстве Стиль рисования щелкните в дополнительных опциях | создать поверхность , и новый модуль *.surf будет создан и добавлен в проект. Переименуйте его в имя ткани (нажмите клавишу F2 на клавиатуре) и файл | Экспорт данных как... и Сохранить как тип: Волновой фронт (*.obj). Повторите операцию для каждого материала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти файлы *.obj, каждый из которых содержит одну из тканей, сегментированных в Amira, могут использоваться другими инструментами (плагин "3Dviewer" от Fiji/ImageJ и SimLab).
  3. Интерактивная 3D-визуализация в формате переносимого документа (PDF) с помощью SimLab Composer
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение для 3D-компьютерной графики облегчает создание поверхностных изображений, анимаций и симуляций. Полезные учебные пособия можно найти в строке 42. Здесь мы описываем, как это программное обеспечение позволяет создавать интерактивные иллюстрации 3D PDF, используя файлы 3D-поверхности волнового фронта (*.obj), созданные с помощью Amira (шаг 2.3; Раздел «3D-рендеринг, визуализация и анализ»).
    1. Перейти к файлу | Создать и создать пустую сцену. Затем Файл | импортировать и импортировать 1-й *.obj файл, сохраненный из Amira. Оставьте все параметры окна Импорт файла снятыми и нажмите кнопку ОК.
    2. Если в окне отображения Composer ничего не отображается, нажмите клавиши CTRL+F или щелкните значок Подходить всем. Теперь сегментированный объект должен появиться в центре окна. Повторите процесс, чтобы добавить еще один сегментированный объект и подтвердить его положение относительно 1-го (например, 2 смежных сомитов).
    3. Выберите один из объектов в окне отображения, щелкнув левой кнопкой мыши, измените его имя, чтобы отразить имя анатомической структуры или ткани, затем переключитесь на представление «3DGeom~1» и с помощью панели «Материалы » измените цвет, изменив значения R, G, B.
    4. Повторяйте для всех объектов, пока 3D-иллюстрация не будет полностью собрана. Обратите внимание, что некоторые материалы также можно сделать прозрачными, манипулируя каналом «Альфа» рядом со значениями RGB, и тем самым позволяют наблюдать за внутренними или закрытыми объектами.
    5. С помощью этого программного обеспечения собранная иллюстрация эмбриона может быть экспортирована в виде файла «3D PDF», который может быть включен в публикации. Сначала создайте «шаблон» с текстом и активными ссылками, чтобы изменить «Состояния сцены», чтобы иметь возможность включать инструкции и три разных этапа в одну и ту же иллюстрацию. Это можно сделать, переключившись из режима «Создание сцены» в режим «Общий доступ» (кнопки слева от окна Composer), затем щелкнув в настройках Show PDF и создав новый шаблон страницы. Чтобы создать простую интерактивную фигуру для включения в рукопись, не используйте шаблон и просто экспортируйте PDF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте программное обеспечение Adobe Acrobat Reader для взаимодействия с 3D PDF-файлами (работоспособность функций интерактивной иллюстрации 3D PDF может варьироваться в зависимости от доступных версий Acrobat Reader). Большинство других средств просмотра не совместимы с форматом 3D PDF, включая веб-браузеры. Такие интерактивные иллюстрации в формате 3D PDF могут быть включены в публикации; заранее спросите редакторов об этой возможности.
  4. 3D визуализация и анализ с помощью Imaris
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение позволяет комплексно визуализировать, анализировать и интерпретировать наборы данных 2D-4D микроскопии с интуитивно понятным интерфейсом и рабочими процессами. В Интернете есть несколько полезных руководств о том, как начать работу с этим программным обеспечением, доступных на веб-сайте (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Для более эффективной загрузки и взаимодействия с большими наборами данных в Imaris (как правило, размерами, превышающими память GPU) рекомендуется сначала преобразовать набор данных в «*.ims», используя программу «ImarisFileConverter.exe», установленную в папке установки Imaris. ImarisFileConverter может считывать многие форматы изображений микроскопии, включая файлы OME и «h5», сохраненные Фиджи BigDataViewer.
    1. 3D визуализация
      1. Это программное обеспечение может отображать 3D-визуализацию набора данных с использованием режима «3D View», и пользователь может внести несколько корректировок в то, как отображается набор данных [например, выбрать между MIP (проекция максимальной интенсивности) или режимом наложения (улучшенный рендеринг с подсказками глубины и тенями)].
      2. Ортогональные виды" - с правильным позиционированием эмбриона (Шаг 4.3; Раздел «Предварительная обработка набора данных изображения») можно воспользоваться вкладкой «Секция» и перемещаться по всему эмбриону и видеть оптические участки из нормальной плоскости (поперечной, корональной и сагиттальной). Если эмбрионы не репозиционированы должным образом, интерпретация их анатомии с ортогональными плоскостями чрезвычайно затруднена (см. Дополнительный рисунок 3). Хотя Imaris имеет функцию, известную как «система отсчета», для обхода этой проблемы при анализе 3D-эмбрионов, предпочтительнее априори перемещать наборы данных.
    2. 3D анализ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение также имеет несколько инструментов для анализа морфологии и интенсивности флуоресценции. В качестве примера здесь мы описываем простой рабочий процесс для анализа изменений интенсивности флуоресценции тканей с течением времени с помощью инструмента Imaris «Spots», где пользователь вручную помещает сферические области интереса (ROI) в эмбрион в 3D, а Imaris может затем измерить флуоресценцию ткани внутри этих сферических ROI.
      1. Загрузите набор 3D- или 4D-данных в Imaris и добавьте новое пятно в режиме 3D-просмотра . Затем можно выбрать конкретные точки эмбриона (также в течение нескольких временных точек, если использовать набор данных 4D) и количественно оценить внутри этих пятен, например, среднюю интенсивность.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение также позволяет отображать интенсивность с течением времени. Это позволяет пользователю легко отвечать на такие вопросы, как: «Как изменяется флуоресценция внутри сомита с течением времени?».
      2. Добавьте плашечный модуль, нажав на кнопку Добавить новое пятно или выбрав 3D-вид | Места в меню Имариса. Выберите Пропустить автоматическую реакцию, редактировать вручную. Переключите режим указателя Imaris с кнопки «Переход» на «Выбрать» (это также можно сделать, нажав клавишу ESC на клавиатуре).
      3. В окне свойств Spots выберите Конкретный канал, к которому будет прикреплено пятно (например, "Channel 1"), и активируйте в разделе Отслеживание вручную опции Автоматическое подключение к выбранному месту и Включить задержку перед автоматическим продвижением.
      4. Переместите курсор мыши в окно визуализации, и курсор должен измениться на полую желтую проволочную сферу. Перейдите к точке времени 1 и добавьте точку (=сферу), щелкнув по интересующей ткани. Сфера («Пятно») добавляется только при щелчке при удержании клавиши shift . Повторите для всех желаемых временных точек, чтобы убедиться, что отслеживается одна и та же часть ткани с течением времени.
      5. В окне Свойства пятен перейдите на вкладку Статистика , а внутри Статистики переключитесь с Общей на Подробную статистику. В первом выпадающем списке выберите Конкретные значения, а во втором выпадающем списке выберите «Значение интенсивности Ch=*...», где Ch* — канал, в котором будет выполняться измерение. Кнопка справа от кнопки "Нажмите, чтобы открыть панель временного графика" будет найдена в левом нижнем углу окна свойств пятен. Нажатие на эту кнопку открывает график со средней интенсивностью флуоресценции внутри «пятен», построенных с течением времени. Эти значения также могут быть экспортированы в электронную таблицу для дальнейшего анализа.

Результаты

Репрезентативные результаты, показанные в этой статье как для живой, так и для иммунофлуоресцентной визуализации, были получены с использованием двухфотонной системы с водным объективом 20 × 1,0 NA, лазером возбуждения, настроенным на 960 нм, и фотоприемниками GaAsP (как описано в Dias et al. (2020)

Обсуждение

Осевое удлинение и сегментация являются двумя наиболее сложными и динамичными процессами, происходящими во время эмбрионального развития позвоночных. Использование 3D- и 4D-визуализации с одноклеточным отслеживанием применялось в течение некоторого времени для изучения этих процессо...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Оливье Пуркие и Александра Аулехлу за штамм репортера LuVeLu, лабораторию SunJin за тестовый образец RapiClear, Уго Перейру за помощь с использованием BigStitcher, Нуну Гранжейру за помощь в настройке аппарата визуализации в реальном времени, объект для животных IGC и бывших и нынешних членов лаборатории Mallo за полезные комментарии и поддержку в ходе этой работы.

Мы благодарим за техническую поддержку Центра расширенной визуализации МКГР, который поддерживается португальским финансированием ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 и ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, совместно финансируемым Региональной оперативной программой Лиссабона (Lisboa 2020) в соответствии с Соглашением о партнерстве с Португалией 2020 года, через Европейский фонд регионального развития (FEDER) и Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Португалия). Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Португалия) и SCML-MC-60-2014 (Санта-Каса-да-Мизерикордия, Португалия) M.M., исследовательской инфраструктурой Congento, проектом LISBOA-01-0145-FEDER-022170 и стипендией PhD PD/BD/128426/2017 для A.D.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira softwareThermofisher-Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albuminBiowestP6154For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0(any)-100um thick
Coverglass 20x20 mm #1(any)-170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5(any)-To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571For immunofluorescence
Drishti software(open source)-Free software tool
EDTASigmaED2SSFor demineralization
Fiji/ImageJ software(open source)-Free software tool
GlycineNZYtechMB01401For immunofluorescence
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serumGE Healthcare#HYCLSH30070.03For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %Milipore1085971000For clearing
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commerial software tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Use as spacers for preparations
L-glutamineGibco#25030–024For live imaging medium
Low glucose DMEMGibco11054020For live imaging medium
M2 mediumSigmaM7167To dissect embryos
MethanolVWRVWRC20847.307For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylateSigmaM6752Used to clear embryos
ParaformaldehydeSigmaP6148Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycinSigma#P0781For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambersSigmaC5474Use as spacers for preparations
simLab softwareSimLab soft-Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm(any)-To mount thick embryos.
Triton X-100SigmaT8787For immunofluorescence

Ссылки

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
  42. . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1683D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены