Создание Крыса Модель Высшего Стрельца-Синус окклюзии с помощью метода thread-Embolism

Резюме

Здесь мы устанавливаем новую крысиную модель Sprague-Dawley (SD) превосходного тромбоза сагиттала (SSS) с помощью метода эмболизации резьбы, и была проверена стабильность и надежность модели.

Аннотация

Механизмы, способствующие естественному наступлению тромбоза венозной пазухи головного мозга (CVST), в основном неизвестны, и в течение заболевания задействованы различные неконтролируемые факторы, что приводит к большим ограничениям в клинических исследованиях. Таким образом, создание стабильных моделей животных CVST, которые могут стандартизировать различные неконтролируемые смешанные факторы, помогло обойти недостатки в клинических исследованиях. В последние десятилетия были построены различные модели животных CVST, но результаты, основанные на этих моделях, были непоследовательными и неполными. Поэтому для дальнейшего изучения патофизиологических механизмов CVST необходимо создать новую и высокосовеченную модель животных, которая имеет важное практическое значение и научное значение для диагностики и лечения CVST. В настоящем исследовании, роман Спраг-Доули (SD) крыса модель превосходного sagittal пазухи (SSS) тромбоз был создан с помощью метода эмболизации резьбы, и стабильность и надежность модели были проверены. Кроме того, мы оценили изменения в венозном кровотоке головного мозга у крыс после образования CVST. В совокупности модель SD-rat SSS-тромбоза представляет собой новую модель CVST животных, которая легко устанавливается, сводит к минимуму травмы, дает хорошую стабильность, и позволяет точно контролировать ишемическое время и местоположение.

Введение

Тромбоз венозной пазухи головного мозга (CVST) является редким заболеванием венозной системы головного мозга, что составляет лишь 0,5-1,0% всех причин инсульта, но имеет относительно высокий уровень возникновения у детей и молодых^{взрослых 1}. Во время вскрытия, CVST было установлено, что причиной 10% цереброваскулярных заболеваний смертей². Тромбоз может возникнуть в любой части внутричерепной венозной системы. Превосходный sagittal пазухи (SSS) является одним из наиболее часто пострадавших районов в CVST и может включать в себя несколько кровеносных сосудов. Из-за стеноза или окклюзии венозных пазух внутричерепных венозных возвращений блокируется, что часто сопровождается повышенным внутричерепным^{давлением 3}. Клинические проявления CVST сложны и меняются с течением времени; хотя симптомы не хватает, наиболее распространенными симптомами являются головная боль (77,2%), судороги (42,7%) и неврологический дефицит (39,9%). В тяжелых случаях кома и даже смерть могут^{произойти 4,5.} В последние годы в связи с общим улучшением медицинских и медико-санитарной норм и осведомленности общественности в области здравоохранения доля связанных с этим факторов риска изменилась, доля травм и инфекций снизилась, а доля CVST, вызванного беременностью, puerperium, оральными контрацептивами и другими причинами,^{постепенно увеличилась на 5}.

В настоящее время патогенез CVST до сих пор не до сих пор хорошо изучен. Для углубленного изучения CVST необходимы дальнейшие патофизиологические исследования. Тем не менее, большинство из этих методов исследования являются инвазивными и, следовательно, трудно реализовать клинически. Из-за многочисленных ограничений клинических исследований модели животных имеют незаменимые преимущества с точки зрения фундаментальных и трансляционных исследований.

Причина CVST является сложной, так как его первоначальное начало часто не признается и расположение образования тромба является весьма переменной. К счастью, модели животных могут лучше контролировать эти факторы. За последние несколько десятилетий было создано множество моделей животных CVST, и каждая модель имеет свои недостатки. Согласно различным методам производства, они могут быть примерно разделены на следующие категории: простая модель SSS-перевязки^6,7; SSS внутренне-инъекционный ускоритель модели⁸; феррик-хлорид-индуцированной SSS тромбоз модели⁹; фотохимический индуцированный тромбоз ССЗ модель¹⁰; и самодельные эмболии-окклюзии SSS модель¹¹. Тем не менее, большинство из этих моделей не в состоянии обойти инвазивные повреждения коры головного мозга животного и не в состоянии точно контролировать ишемическое время и местоположение. В некоторых моделях тромб будет реканализировать спонтанно; в других моделях, SSS становится постоянно закрыты. Кроме того, сложные операции и/или серьезные травмы могут повлиять на последующие патофизиологические выводы в этих моделях.

В настоящем исследовании, вилка потока была вставлена в SSS крыс Sprague-Dawley (SD) для успешного создания модели CVST, которая минимизировала ущерб, позволила точно контролировать и дала хорошую стабильность. Кроме того, для проверки эффективности модели были объединены магнитно-резонансная томография (МРТ) и лазерная визуализация кровотока. Мы оценивали изменения мозгового кровотока до и после создания нашей модели, а также оценивали стабильность нашей модели, закладывая основу для дальнейших исследований, исследующих возникновение, развитие и связанные с ней патофизиологические механизмы CVST.

протокол

Процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по медицинским нормам и этике Медицинского университета Вэньчжоу и соответствуют китайскому законодательству об использовании и уходе за лабораторными животными.

1. Подготовка нити штепсельной вилки, SD крыс и экспериментального оборудования

1. В качестве основного корпуса вилки для нитей используйте нейлоновую нить диаметром 0,28 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкость и твердость нейлоновой нити должна быть умеренной.
2. Обложка один конец нейлоновой нити с силиконовым материалом. Длина силиконовой части нити составляет около 1,2 см, а диаметр - около 1,2 мм. Головной конец сужается, а силиконовая часть цилиндрическая. Зарезервировать еще 5-7 см. Нейлоновая нить легко зажимать и может быть сокращена в соответствии с конкретными потребностями после операции.
3. Используйте 75% этанола, чтобы замочить вилку для нитей в течение 3 минут до операции и промыть любой остаточный этанол с нормальным солевым раствором перед подключением.
4. Выберите 12 самцов SD крыс весом от 280 до 320 г, и случайным образом разделить их на фиктивные группы и экспериментальной группы (n No 6 в группу). После недели адаптации к окружающей среде, быстро крыс на 12 ч и воды лишить их за 4 ч до операции.
5. Подготовь для эксперимента следующее экспериментальное оборудование: небольшой аппарат для анестезии животных, стереотаксис мозга, рассеченный микроскоп, высокоскоростную сверло черепа, ножницы, пинцет, сосудистые типсы, держатель иглы, нить иглы, шприц 2 мл, лазерно-пятнистая система визуализации кровотока и мало-животный МРТ-сканер.

2. Строительство модели SD-Rat SSS-Эмболизации с помощью эмболизации резьбы

1. Поместите SD крысы в анестезии индукционной коробке и использовать мелкого животного обезболивающее машина для доставки 4% изофлюран, чтобы вызвать анестезию. После этого, использовать щипся, чтобы подтвердить, что задние конечности и ноги крысы SD не реагируют на умеренное щипать.
2. Быстро исправить SD крысы с бритыми верхними волосами в положении склонны на стереотаксис устройства мозга. Поддерживать анестезию с 1,5-2,0% изофлурана (при скорости 0,5 л/мин) и стабилизировать частоту дыхания на уровне 40-60 вдохов/мин. Стабилизуем температуру тела крысы с помощью грелки при температуре 37±0,2 градуса по Цельсию.
   1. Нанесите стерильную офтальмологическую смазку глаза после того, как крыса помещается на стереотаксисную раму, чтобы защитить роговицы от высыхания во время анестезии.
3. Стерилизовать поверхность на верхней части головы крысы с 5% povidone йод чередующихся три раза с 75% этанола. Сделайте разрез кожи (2,0 см в длину) в середине головы, а затем тщательно снимите верхнюю фасцию и периостеум, чтобы полностью разоблачить череп.
   1. Подтвердите положение передней фонтанеллы, задней фонтанеллы, коронального шва, сагиттального шва и шва из елочки.
4. Используйте область между корональным швом и шовом из елочки в качестве области наблюдения кровотока. Чтобы череп не влиял на наблюдение во время лазерной визуализации кровотока, разрежйте череп в зоне наблюдения до тех пор, пока кровеносные сосуды не будут хорошо видны. Размер истонченного черепа должен быть примерно 1,0 см, × 1,0 см. Этот шаг и следующие все выполняются под рассечением микроскопа.
   1. Во время измельчения черепа используйте физраствор для повторного полоскания сверла, чтобы избежать высокотемпо температуре ожогов коры головного мозга.
5. Используйте высокоскоростную дрель, чтобы измельчить череп в пределах 6,0 мм х 4,0 мм костного окна по центру брегмы, чтобы разоблачить SSS области брегмы.
   1. Используйте нормальный солевой раствор, чтобы охладить череп во время измельчения. Когда череп становится тонким, используйте пинцет, чтобы тщательно удалить оставшиеся части кости, чтобы избежать разрыва SSS.
6. Выберите подходящую вилку для резьбы, используйте точку SSS bregma в качестве точки вилки, тщательно проколите ее иглой шприца 2 мл и быстро вставьте головку вилки в точку вилки.
   1. В это время угол между концом головки потока и SSS должен быть приблизительно 30-45 "; затем отрегулируйте угол между концом вилки потока и SSS до 0-10 градусов, и медленно вставьте SSS в центр, пока голова не достигнет заднего края синусового слияния. После этого отрежьте лишнюю часть хвоста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрое кровотечение может произойти, когда SSS проколот. Если конец вилки потока не может быть быстро вставлен в точку вилки в одно время, используйте небольшую марлю или ватный шарик, чтобы мягко нажать на точку вилки, медленно скользя вниз, чтобы разоблачить точку вилки тщательно, а затем быстро вставить конец провода болт в SSS. После того, как вилка нити вставляется, если есть кровотечение в точке пробки, гемостатические материалы, такие как желатин губка может быть использована, чтобы остановить кровотечение.

3. Обнаружение кровотока на поверхности мозга SD Крысы

1. Используйте лазерный источник света для равномерного освещения зоны наблюдения кровотока. Отраженный свет собирается камерой и передается на компьютер для анализа. Используйте следующие параметры для лазерной системы визуализации кровотока: длина волны: 785 нм; и время экспозиции изображения: T 10 мс.
2. Центр SD-крысы кровотока наблюдательной области в поле зрения лазерной пятнышко кровотока системы и проводить непрерывный мониторинг кровотока на поверхности мозга в течение 2 минут. Соберите и обработать данные о кровотоке до и после эмболизации для каждой крысы SD, и получить лазерно-speckle крови поток карты наблюдаемой области.
3. Неоднократно промыть эксплуатируемых области с нормальным солевым раствором, чтобы смыть костного мусора и остатков. Шв кожи (0 "нить) и дезинфицировать с иодофором.
4. Поддержание температуры тела, пока крыса просыпается после операции, а затем дом в одной клетке с пищей и водой при условии, объявление libitum. Фиктивная группа не может быть подключена.
5. После завершения сбора данных выполните постобработки.
   1. Полный выбор области интереса (ROI) с помощью инструментов, предоставляемых лазерной спекл кровотока системы программного обеспечения. Полученные значения являются средним значением кровотока в рентабельности инвестиций, а также местными значениями мозгового кровотока до и после эмболизации. Используйте значение кровотока перед эмболизацией в качестве базового значения.
   2. Выберите четыре ИИ и измерьте относительное изменение мозгового кровотока в каждой рентабельности инвестиций, выраженное в виде процентного изменения от базового значения.

4. Обнаружение положения нити на мелких животных МРТ

1. Используйте следующие параметры T2-взвешенной визуализации (T₂WI) для системы МРТ-изображений: время эха (TE) 33 мс, время повторения (TR) 3000 мс, количество возбуждения (NEX) 4, кусочки 28, толщина ломтика 0,8 мм, размер матрицы²⁵⁶х 256 мм 2 , угол наклона 80 ", поле зрения (FOV) - 30"30 мм², время сканирования 6 мин 24 с; параметры магнитно-резонансной ангиографии (МРА) были установлены следующим образом: TE 4,4 мс, ТР 12 мс, NEX 4, ломтики 80, толщина ломтика - 0,4 мм, размер матрицы - 256-256^{мм 2,}угол наклона - 80 ", FOV - 30-30^{мм 2}, время сканирования - 16 мин 23 сек 40 мс.
2. Зафиксировать животное на таблице МРТ сканирования, калибровать положение мозга путем позиционирования сканирования, и выполнять T₂WI и MRA последовательности сканирования после подтверждения позиции.
3. Используйте непрерывную анестезию через аппарат анестезии животных во время обнаружения. Затем, усыплять SD крыс путем внутриперитонеальной инъекции чрезмерного пентобарбитала.
4. Приобретение изображений и постобработка: после сбора данных изображения, для более четкого наблюдения за состоянием вилки потока в SSS, используйте метод псевдоцветного улучшения для отображения изображения T₂WI крысиного мозга.

Результаты

Для создания модели SD-rat SSS-тромбоза с помощью метода шва, швы должны быть подготовлены заранее(рисунок 1A), и оборудование, необходимое для эксперимента(рисунок 1B) должны быть подготовлены. В связи с деликатным характером операции, подготовка модели должн?...

Обсуждение

В этом исследовании, новый тип модели CVST был успешно создан путем вставки самодельных нить плагин в SSS SD крыс. Кроме того, лазерно-пятнистая визуализация кровотока и МРТ мелкого животного были объединены для мониторинга изменений кровотока на поверхности мозга крыс SD до и после эмболиз?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09