JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.

Аннотация

Белки миозина связываются и взаимодействуют с нитевидным актином (F-актином) и обнаруживаются в организмах по всему филогенетическому дереву. Их структура и ферментативные свойства адаптированы к конкретной функции, которую они выполняют в клетках. Миозин 5а процессивно ходит по F-актину для транспортировки меланосом и везикул в клетках. И наоборот, немуздровой миозин 2b действует как биполярная нить, содержащая примерно 30 молекул. Он перемещает F-актин противоположной полярности к центру нити, где молекулы миозина работают асинхронно, чтобы связать актин, придать силовой удар и диссоциировать перед повторением цикла. Немуздрочный миозин 2b, наряду с другими его немузкулистыми изоформами миозина 2, имеет роли, которые включают клеточную адгезию, цитокинез и поддержание напряжения. Механохимия миозинов может быть изучена путем выполнения анализов подвижности in vitro с использованием очищенных белков. В скользящем актиновом анализе миозины связываются с поверхностью крышки микроскопа и транслокируют флуоресцентно меченый F-актин, который можно отслеживать. Однако в анализе подвижности одной молекулы/ансамбля F-актин связан с покровным листом, и наблюдается движение флуоресцентно меченых молекул миозина на F-актине. В этом отчете описана очистка рекомбинантного миозина 5а из клеток Sf9 с помощью аффинной хроматографии. После этого мы опишем два анализа на основе флуоресцентной микроскопии: анализ скользящей актиновой нити и анализ перевернутой подвижности. Из этих анализов такие параметры, как скорости транслокации актина и длины и скорости пробега одной молекулы, могут быть извлечены с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Эти методы также могут быть применены для изучения движения одиночных нитей немышечные изоформы миозина 2, обсуждаемые в настоящем документе в контексте немузкусного миозина 2b. Этот рабочий процесс представляет собой протокол и набор количественных инструментов, которые могут быть использованы для изучения динамики одной молекулы и ансамбля немуклетковых миозидов.

Введение

Миозины представляют собой моторные белки, которые оказывают силу на актиновые нити, используя энергию, полученную в результате гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ)1. Миозины содержат область головы, шеи и хвоста. Головной домен содержит актин-связывающую область, а также место связывания и гидролиза АТФ. Шейные домены состоят из мотивов IQ, которые связываются с легкими цепями, кальмодулином или кальмодулиноподобными белками2,3. Хвостовая область имеет несколько функций, специфичных для каждого класса миозинов, включая, но не ограничиваясь, димеризацией двух тяжелых цепей, связыванием молекул груза и регуляцией миозина посредством аутоингибиторных взаимодействий с головными доменами1.

Подвижные свойства миозина сильно различаются между классами. Некоторые из этих свойств включают коэффициент нагрузки (доля механического цикла миозина, в которой миозин связан с актином) и процессучность (способность двигателя делать несколько шагов на своем пути перед отслоением)4. Более 40 классов миозинов были определены на основе последовательности анализов5,6,7,8. Миозины класса 2 классифицируются как «обычные», поскольку они были первыми, которые были изучены; поэтому все другие классы миозинов классифицируются как «нетрадиционные».

Миозин 5а (M5a) является миозином класса 5 и является процессивным двигателем, что означает, что он может делать несколько шагов вдоль актина перед диссоциацией. Он имеет высокий коэффициент полезного действия, что указывает на то, что он проводит большую часть своего механическогоцикла,связанного с актином9,10,11,12,13,14. Как и другие миозины, тяжелая цепь содержит N-концевой двигательный домен, который включает в себя как актин-связывание, так и сайт гидролиза АТФ, за которым следует область шеи, которая служит рычагом-рычагом, с шестью мотивами IQ, которые связываются с основными легкими цепями (ELC) и кальмодулином (CaM)15. Хвостовая область содержит α спиральные спиральные катушки, которые димеризируют молекулу, за которой следует шаровидная хвостовая область для связывания груза. Его кинетика отражает его участие в транспорте меланосом в меланоцитах и эндоплазматического ретикулума в нейронах Пуркинье16,17. М5а считается прототипом грузового транспортногомотора 18.

Миозины класса 2, или обычные миозины, включают миозины, которые обеспечивают сокращение скелетных, сердечных и гладких мышц в дополнение к немуусочковым изоформам миозина 2 (NM2), NM2a, 2b и 2c19. Изоформы NM2 находятся в цитоплазме всех клеток и играют общую роль в цитокинезе, адгезии, тканевом морфогенезе и миграции клеток19,20,21,22. В данной статье обсуждаются обычные протоколы миозина в контексте немузкулового миозина 2b (NM2b)23. NM2b, по сравнению с M5a, имеет низкий коэффициент нагрузки и ферментарно медленнее с Vmax 0,2 с-123 по сравнению с M5a Vmax ≈18 с-124. Примечательно, что усеченные конструкции NM2b с двумя головками не легко перемещаются процессно на актине; скорее, каждая встреча с актином приводит к силовому удару с последующей диссоциацией молекулы25.

NM2b содержит две тяжелые цепи миозина, каждая с одним шаровидным головным доменом, одним рычагом-рычагом (с одним ELC и одной регуляторной легкой цепью (RLC)) и α-спиральным спиральным стержнем / хвостовым стержнем, длиной примерно 1 100 аминокислот, который димеризует эти две тяжелые цепи. Ферментативная активность и структурное состояние NM2b регулируются фосфорилированием RLC23. Нефосфорилированный NM2b, в присутствии АТФ и физиологических ионных сил (приблизительно 150 мМ соли), принимает компактную конформацию, в которой две головки участвуют в асимметричном взаимодействии, а хвостовые складки возвращаются над головами в двух местах23. В этом состоянии миозин не взаимодействует сильно с актином и обладает очень низкой ферментативной активностью. При фосфорилировании RLC кальмодулин-зависимой миозин-цепной киназой (MLCK) или Rho-ассоциированной протеинкиназой молекула расширяется и связывается с другими миозинами через хвостовую область с образованием биполярных нитей примерно из 30 молекул миозина23. Вышеупомянутое фосфорилирование RLC также приводит к повышению актин-активированной АТФазной активности NM2b примерно в четыре разав 26,27,28. Это биполярное расположение нити накала, имеющее множество миозиновых двигателей на каждом конце, оптимизировано для ролей в сжатии и поддержании напряжения, где актиновые нити с противоположными полярностями могут перемещаться относительно друг друга23,29. Соответственно, было показано, что NM2b действует как ансамбль двигателей при взаимодействии с актином. Большое количество двигателей в этой нити накала позволяют нитям NM2b двигаться процессно на актиновых нитях, что делает возможным характеристику процессичности нити in vitro дляхарактеристики 29.

Хотя был достигнут прогресс в понимании роли миозинов в клетке, необходимо понимать их индивидуальные особенности на уровне белка. Чтобы понять взаимодействия актомиозина на простом уровне белково-белкового взаимодействия, а не внутри клетки, мы можем экспрессировать и очищать рекомбинантные миозины для использования в исследованиях in vitro. Результаты таких исследований затем информируют механобиологов о биофизических свойствах специфических миозидов, которые в конечном итоге управляют сложными клеточными процессами12,13,14,25,29. Как правило, это достигается путем добавления метки аффинности к полноразмерной или усеченной конструкции миозина и очистки с помощью аффинной хроматографии29,30,31. Кроме того, конструкция может быть спроектирована так, чтобы включать генетически кодируемый флуорофор или метку для маркировки белка синтетическим флуорофором. Добавляя такую флуоресцентную метку, можно проводить исследования визуализации одной молекулы для наблюдения за механикой миозина и кинетикой.

После очищения миозин можно охарактеризовать несколькими способами. Активность АТФазы может быть измерена колориметрическими методами, обеспечивающими понимание общего энергопотребления и актинового сродства двигателя в различных условиях32. Чтобы узнать о механохимии его подвижности, требуются дальнейшие эксперименты. В этой статье подробно описываются два метода на основе флуоресцентной микроскопии in vitro, которые могут быть использованы для характеристики подвижных свойств очищенного белка миозина.

Первым из этих методов является скользящий актиновый анализ нити, который может быть использован для количественного изучения ансамблевых свойств миозиновых двигателей, а также качественного изучения качества партии очищенного белка33. Хотя в этой статье обсуждается использование микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) для этого анализа, эти эксперименты могут быть эффективно выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, обычно встречающегося во многих лабораториях34. В этом анализе насыщающий слой миозиновых двигателей прикрепляется к покровному слипу. Это может быть достигнуто с использованием нитроцеллюлозы, антител, мембран, SiO2-производныхповерхностей (таких как триметилхлорсилан), среди прочих29,33,35,36,37,38. Флуоресцентно меченые актиновые нити пропускаются через камеру крышки, на которой актин связывается с миозином, прикрепленным к поверхности. При добавлении АТФ (и киназ при исследовании NM2) камера визуалируется для наблюдения за транслокацией актиновых нитей поверхностно связанными миозинами. Программное обеспечение для отслеживания может использоваться для корреляции скорости и длины каждой скользящей актинной нити. Программное обеспечение для анализа может также обеспечить измерение количества как движущихся, так и стационарных актиновых нитей, что может быть полезно для определения качества данного препарата миозина. Пропорция заглохших нитей также может быть намеренно модулирована поверхностным привязыванием актина к другим белкам и измерена для определения зависимости нагрузки миозина39. Поскольку каждая нить актина может приводиться в движение большим количеством доступных двигателей, этот анализ очень воспроизводим, причем конечная измеренная скорость устойчива к возмущениям, таким как изменения в начальной концентрации миозина или присутствие дополнительных факторов в растворе. Это означает, что его можно легко модифицировать для изучения активности миозина в различных условиях, таких как измененное фосфорилирование, температура, ионная прочность, вязкость раствора и эффекты нагрузки, вызванной поверхностными тросами. Хотя такие факторы, как сильно связывающие «мертвые головки» миозина, неспособные к гидролизу АТФ, могут вызвать застойные актиновые нити, существует несколько методов, позволяющих смягчить такие проблемы и обеспечить точные измерения. Кинетические свойства миозина сильно различаются в зависимости от классов и, в зависимости от конкретного используемого миозина, скорость скольжения актиновой нити в этом анализе может варьироваться от менее 20 нм / с (миозин 9)40,41и до 60 000 нм / с(Characean myosin 11)42.

Второй анализ инвертирует геометрию скользящей актиновой нитианализа 12. Здесь актиновые нити прикрепляются к поверхности покрова и визуализируется движение одиночных молекул M5a или отдельных биполярных нитей NM2b. Этот анализ может быть использован для количественной оценки длины пробега и скоростей отдельных молекул миозина или нитей на актине. Покров покрывается химическим соединением, которое блокирует неспецифическое связывание и одновременно функционализирует поверхность, таким как биотин-полиэтиленгликоль (биотин-ПЭГ). Добавление модифицированных производных авидина затем грунтует поверхность, и биотинилированный актин пропускают через камеру, в результате чего слой F-актина стабильно связывается с нижней частью камеры. Наконец, активированный и флуоресцентно меченый миозин (обычно 1-100 нМ) протекает через камеру, которая затем визуализируется для наблюдения за движением миозина над стационарными актиновым нитями.

Эти модальности представляют собой быстрые и воспроизводимые методы, которые могут быть использованы для изучения динамики как немуечных, так и мышечных миозинов. В этом отчете описываются процедуры очистки и характеристики как M5a, так и NM2b, представляющие собой нетрадиционные и обычные миозины, соответственно. За этим следует обсуждение некоторых миозин-специфических адаптаций, которые могут быть выполнены для достижения успешного захвата движения в двух типах анализа.

Экспрессия и молекулярная биология
КДНК для интересующего миозина должна быть клонирована на модифицированный вектор pFastBac1, который кодирует либо C-концевой FLAG-тег (DYKDDDDK), если экспрессирует M5a-HMM, либо N-концевой FLAG-метки, если экспрессирует полноразмерную молекулу NM2b23,43,44,45,46. C-концевые FLAG-метки на NM2b приводят к ослаблению сродства белка к столбику FLAG-аффинности. Напротив, N-терминально помеченный FLAG белок обычно хорошо связывается с колонкой23FLAG-аффинности. N-терминально меченый белок сохраняет ферментативную активность, механическую активность и фосфорилирование-зависимую регуляцию23.

В этой статье использовалась усеченная мышь M5a тяжелая меромиозиновая (HMM)-подобная конструкция с GFP между FLAG-тегом и C-концем тяжелой цепи миозина. Обратите внимание, что в отличие от NM2b, M5a-HMM может быть успешно помечен и очищен с помощью тегов FLAG N- или C-терминала, и в обоих случаях результирующая конструкция будет активной. Тяжелая цепь M5a была усечена при аминокислоте 1090 и содержит три аминокислотных линкера (GCG) между GFP и областью катушки M5a47. Между GFP и FLAG-тегом не было добавлено дополнительного компоновщика. M5a-HMM был совместно экспрессирован с кальмодулином. Полноразмерная человеческая конструкция NM2b была выражена совместно с ELC и RLC. N-термины RLC сплавлены с GFP через линкер из пяти аминокислот (SGLRS). Непосредственно к FLAG-тегу был прикреплен HaloTag. Между HaloTag и N-концем тяжелой цепи миозина находился линкер, состоящий из двух аминокислот (AS).

Оба препарата миозина очищали от одного литра культуры клеток Sf9, инфицированной бакуловирусом, при плотности примерно 2 х 106 клеток/мл. Объемы бакуловируса для каждой субъединицы зависели от множественности инфекции вируса, определенной инструкциями производителя. В случае M5a клетки были совместно инфицированы двумя различными бакуловирусами - один для кальмодулина и один для тяжелой цепи M5a. В случае NM2b клетки были совместно инфицированы тремя различными вирусами - один для ELC, один для RLC и один для тяжелой цепи NM2b. Для лабораторий, работающих с различными миозинами (или другими многокомплексными белками), этот подход эффективен, поскольку он допускает множество комбинаций тяжелых и легких цепей, а обычно используемые легкие цепи, такие как кальмодулин, могут быть совместно трансфекционированы многими различными тяжелыми цепями миозина. Вся клеточная работа была завершена в шкафу биобезопасности с надлежащей стерильной техникой, чтобы избежать загрязнения.

Для экспрессии как M5a, так и NM2b клетки Sf9, продуцирующие рекомбинантные миозины, собирали через 2-3 дня после заражения путем центрифугирования и хранили при -80 °C. Клеточные гранулы получали центрифугированием коинфицированных клеток Sf9 при 4 °C в течение 30 мин при 2,800 х г. Процесс очистки белка подробно описан ниже.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Очистка белка

  1. Лизис клеток и экстракция белка
    1. Подготовьте 1,5-кратный буфер извлечения на основе таблицы 1. Фильтровать и хранить при 4 °C.
    2. Начните размораживать гранулы клеток на льду. Пока гранулы оттаивают, дополняют 100 мл экстракционного буфера 1,2 мМ дитиотрейтола (DTT), 5 мкг/мл лейпептида, 0,5 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и две таблетки ингибитора протеазы. Держитесь на льду.
    3. После того, как гранула разморозится, добавьте 1 мл дополнительного экстракционного буфера на 10 мл клеточной культуры. Например, если гранулы клеток были сформированы из 500 мл клеточной культуры, то добавьте к грануле 50 мл дополненного экстракционного буфера.
    4. Обжаивайте гранулы клеток ультразвуком, сохраняя их на льду. Для каждой гранулы используют следующие условия: 5 с ВКЛ, 5 с ВЫКЛ, продолжительность 5 мин, мощность 4-5.
    5. Соберите весь гомогенизированный лизат в замок и добавьте АТФ (0,1 М раствора; рН 7,0) таким образом, чтобы конечная концентрация АТФ была 1 мМ. Перемешивать в течение 15 мин в холодном помещении. АТФ диссоциирует активный миозин от актина, позволяя отделить его на следующей ступени центрифугирования. Поэтому важно немедленно перейти к следующему шагу, с тем чтобы свести к минимуму возможность истощения АТФ и его повторной привязки к актину.
    6. Центрифугировать лизаты при 48 000 х г в течение 1 ч при 4 °C. Пока это происходит, начните промывку 1-5 мл 50% суспензии аффинной смолы Anti-FLAG (для гранулы, образованной из 1 л клеток) 100 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), в соответствии с инструкциями производителя. Например, для 5 мл смолы промыть 10 мл 50% суспензии. На заключительном этапе промывки повторно суспендировать смолу с 1-5 мл PBS с достаточным объемом для создания 50% суспензии.
    7. После центрифугирования лизатом соедините супернатант с промытой смоляной суспензией и камнем осторожно в холодном помещении в течение 1-4 ч. Во время ожидания сделайте буферы, описанные в таблице 1, и держите их на льду.
  2. Препарат для аффинной очистки FLAG
    1. Центрифугируют раствор на этапе 1,7 при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С. Смола будет упакована в нижней части трубки. Не нарушая смолу, удалите супернатант.
    2. Повторно суспендируют смолу в 50 мл буфера А, как описано в таблице 1, и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Не нарушая смолу, удалите супернатант.
    3. Повторно суспендируют смолу в 50 мл буфера B, как описано в таблице 1, и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг еще раз и повторно суспендируете смолу в 20 мл буфера B. Затем тщательно перемешайте смолу и буфер, осторожно перевернутый тюбик вручную примерно 10 раз.
  3. Элюция и концентрация белка
    1. Сделайте 30 мл элюационного буфера, как описано в таблице 1, и дайте ему остыть на льду.
    2. Установите колонну элюдения в холодном помещении. Аккуратно вылейте смоляную суспензию в колонну. Промывайте колонну с 1-2 колонными объемами буфера B, так как смола упаковывается на дно, следя за тем, чтобы смола не высохла.
    3. Продуть 1 мл элюационного буфера через смолу и собрать поток в трубку 1,5 мл. Повторите так, чтобы были собраны фракции 12, 1 мл.
    4. На этом этапе выполните грубый тест Брэдфорда на фракциях, чтобы качественно определить, какие фракции являются наиболее концентрированными48. На одном ряду 96-скважинной пластины пипетка 60 мкл 1x реагент Брэдфорда. По мере сбора фракций смешайте по 20 мкл каждой фракции на скважину. Более темная синяя окраска указывает на более концентрированные фракции.
    5. В пробирке 50 мл соберите оставшийся белок, осторожно пипетируя оставшийся буфер элюирования через столбец, чтобы освободить любой оставшийся миозин, связанный со смолой в проточном потоке колонны. Этот поток будет сконцентрирован на следующем этапе. Убедитесь, что смола затем регенерирована для повторного использования и хранится в соответствии с инструкциями производителя.
    6. Объедините три наиболее концентрированные фракции и дополнительно сконцентрируйте проточная часть в трубе 50 мл, а также оставшиеся фракции 1 мл с помощью концентрируемой трубки MWCO 100 000 MWCO. Загрузите объединенный образец на концентрирующую трубку и центрифугу при 750 х г в течение 15 мин при 4 °C и повторяйте до тех пор, пока весь элюированный белок не будет сконцентрирован до конечного объема приблизительно 0,5-1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот размер пор позволяет удерживать молекулы миозина, которые имеют массы, в несколько раз превышающие отсечение молекулярной массы. Легкие цепи остаются тесно связанными с двигательными доменами в течение этого времени концентрации, что подтверждается выполнением электрофореза геля SDS-PAGE на конечном продукте.
  4. Диализ и флэш-заморозка
    1. Сделайте 2 л диализного буфера, как описано в таблице 1. Загрузите образец в диализный мешок или камеру и диализуйте на ночь в холодном помещении. Отметим, что состав диализных буферов отличается для NM2b и M5a.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае NM2b целью этого этапа диализа является образование миозиновых нитей в буфере низкой ионной силы. Осаждение этих нитей затем обеспечивает дополнительную ступень очистки и позволяет концентрирование образца. Таким образом, на следующий день в диализной камере будет видимый белый осадок. Эти нити будут собраны путем центрифугирования и деполимеризованы на этапе 5.1. В случае M5a-HMM, после ночного диализа, белок будет достаточно чистым для использования в последующих анализах. При необходимости могут быть выполнены дальнейшие этапы очистки, такие как фильтрация геля или ионная обменная хроматография. Для восстановления M5a после диализа перейдите к шагу 5.2.
  5. Восстановление миозина после диализа
    1. Для NM2b осторожно выгрузите весь образец из диализного мешка или камеры и центрифуги при 4 °C в течение 15 мин при 49 000 х г для сбора миозинов. Отбросьте супернатант и постепенно добавляйте буфер хранения к грануле, как описано в таблице 1, пока она не растворится. Мягкое пипетирование вверх и вниз помогает солюбилизировать гранулу. В норме для этого не требуется более 500 мкл на пробирку. После обеспечения полного растворения гранулы в буфере хранения с высокой ионной прочностью можно выполнить дополнительную ступень центрифугирования (15 мин при 49 000 х г)для удаления нежелательных агрегатов, если это необходимо, поскольку миозин теперь будет неполимеризованным и останется в надподобном веществе.
    2. Для M5a-HMM тщательно соберите весь образец из диализной камеры и центрифуги при 4 °C в течение 15 мин при 49 000 х г в случае наличия нежелательных агрегатов. Возьмем супернатант.
  6. Определение концентрации и мгновенное замораживание
    1. Чтобы определить концентрацию продукта, измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длинах волн 260, 280, 290 и 320 нм. Рассчитайте концентрацию в мг/мл(cмг/мл)с уравнением 1, где A280 представляет поглощение при 280 нм, а A320 представляет поглощение при 320 нм. Результирующая концентрация в мг/мл может быть преобразована в мкМ молекул миозина с уравнением 2,где M — молекулярная масса всего белка (включая тяжелые цепи, легкие цепи, флуорофоры и все метки).
      cмг/мл = (A280 - A320) / ε (1)
      мкМ молекул = 1000смг/мл/М(2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо разбавление, то оно должно быть сделано в буфере высокой ионной силы. Коэффициент вымирания (ε) можно определить, импортив аминокислотную последовательность белка в такую программу, как ExPASy. Типичный выход для M5a-HMM составляет приблизительно 0,5-1 мл белка 1-5 мг/мл, а для полноразмерного NM2b составляет 0,5-1 мл 0,5-2 мг/мл. Коэффициент вымирания для M5a-HMM, использованный в этой статье, составил 0,671. Коэффициент вымирания для NM2b, использованный в данной работе, составил 0,611.
    2. Храните очищенный миозин одним из двух способов. Аликвот между 10-20 мкл в тонкостенный пробирок, такой как трубка полимеризационной цепной реакции, и опускают трубку в контейнер с жидким азотом для мгновенной заморозки. Альтернативно, непосредственно пипетку между 20-25 мкл миозина в жидкий азот и хранят замороженные шарики белка в стерильных криогенных трубках. В любом случае полученные трубки могут храниться при -80 °C или жидком азоте для будущего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку оба анализа подвижности, описанные ниже, требуют очень небольшого количества белка, хранение в небольших аликвотах, как описано, является экономичным.

2. Скользящий актиновая нить

  1. Подготовка обложек
    1. Сделайте 1% раствор нитроцеллюлозы в амилацетате.
    2. Получите чашку для посева тканей (150 х 25 мм) и добавьте на дно блюда круглую фильтровальную бумагу (диаметром 125 мм).
    3. Загрузите восемь крышек No 1,5 толщиной 22 мм на стойку и промыть примерно 2-5 мл 200-стойкого этанола с последующим 2-5 мл дистиллированной воды (dH2O). Повторите этот шаг стирки, заканчивая водой. Затем полностью высушите крышки с помощьюфильтроточной воздушной линии или N 2-линии.
    4. Возьмите один обтекатель и медленно пипетку 10 мкл 1% раствора нитроцеллюлозы вдоль одного края скольжения. Затем одним плавным движением размажьте его по остальной части крышки, используя сторону гладкого наконечника пипетки 200 мкл. Поместите этот покров на блюдо для посева тканей нитроцеллюлозной стороной вверх. Повторите для оставшихся обложек и дайте им высохнуть при приготовлении оставшихся реагентов и используйте обтекаемые листы в течение 24 ч после нанесения покрытия.
  2. Подготовка камеры
    1. Протрите слайд микроскопа бумагой для оптической линзы, чтобы очистить от крупного мусора. Вырежьте два куска двусторонней ленты, примерно 2 см длиной.
    2. Поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпадает с краем слайда. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными и выровненными. Это создает проточные камеры, которые могут вмещать приблизительно 10 мкл раствора (см. Рисунок 1).
    3. Возьмем один из покрытых нитроцеллюлозой покровных листков из Части 1. Осторожно наклейте крышку на ленту так, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно контактировала с лентой (см. Рисунок 1). Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно прилипла к слайду. Отрежьте лишнюю ленту, висящую над краем горки лезвием бритвы.
  3. Препарат актина
    1. Производят 20 мкМ F-актина путем полимеризации глобулярного актина (G-актина) в полимеризационной буфере (50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2,1 мМ DTT, 25 мМ MOPS (рН 7,0)) при 4 °C в течение ночи.
    2. Разбавляют F-актин до 5 мкМ в буфере подвижности (20 мМ МОПС, 5 мММгCl2,0,1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ (рН 7,4)). Этикетка с не менее чем 1,2-кратным молярным избытком родамина-фаллоидина. Оставьте (покрытое алюминиевой фольгой) не менее 2 ч на льду. Его можно использовать до 1-2 месяцев, хранить на льду.
  4. Выполнение анализа скользящей актиновой нити миозина 5а
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробные сведения о скользящем анализе миозина 5а (HMM).
    1. Подготовьте растворы для миозина 5а, описанные в таблице 2, и держите их на льду.
    2. Протоите в 10 мкл миозина 5а (50-100 нМ) через прототочную камеру и подождите 1 мин.
    3. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT (буфер с низким содержанием соли). Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал, аккуратно поместив угол бумаги на выход из блок-камеры.
    4. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Поток в 10 мкл раствора черного актина (5 мкМ F-актина, 1 мкМ кальмодулина и 1 мМ АТФ в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT) для устранения «мертвых головок», как обсуждалось в разделе «Обсуждение».
      1. Пипетку раствора со шприцем 1 мл и иглой 27 г для сдвига актиновой нити перед введением раствора в камеру. Повторите этот шаг еще два раза и подождите 1 минуту после третьего раза. Достаточно примерно 20 событий пипетирования.
      2. Для выполнения вращения «мертвой головы» добавляют стехиометрическое количество F-актина к миозину в присутствии 1 мМ АТФ и 1 мМMgCl2 при концентрации соли 500 мМ. Затем ультрацентрифугу при 480 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Мертвый миозин будет в грануле.
    6. Поток в 50 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей.
    7. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы истощить камеру любого АТФ.
    8. Продуть в 10 мкл раствора родамина актина (Rh-Actin) 20 нМ, содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ МБ, и подождать 1 мин, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с миозином 5а, прикрепленным к поверхности покровного листа.
    9. Промывайте 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT для смывания rh-актиновых нитей, не связанных с поверхностью. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Расход в 30 мкл конечного буфера.
    11. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп, используя длину волны возбуждения 561 нм для визуализации Rh-актина. Соответствующее время экспозиции составляет 200 мс при мощности лазера 1,4 мВт при общей продолжительности захвата 0,5-1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скорость захвата масштабируется соответствующим образом в соответствии со скоростью движущихся нитей. Важным соображением перед сбором данных для использования с программами отслеживания является частота кадров сбора. Субпиксельные движения между кадрами приведут к завышенности скорости, а для получения точных значений потребуются движения в несколько сотен нанометров. Оптимальная скорость захвата обеспечивает актин-скольжение на расстоянии не менее одного пикселя между кадрами. В случае микроскопа TIRF, используемого для визуализации здесь, этот порог переводится в 130 нм; поэтому миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 1 мкм/с, должен быть визуален со скоростью 5 кадров/с (интервал 0,2 с) для достижения 200 нм движения, в то время как миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 10 нм/с, требует 0,05 кадра/с (интервал 20 с). Поэтому при необходимости данные могут быть понижены на этом этапе (см. Обсуждение для получения более подробной информации).
  5. Выполнение анализа скользящей актиновой нити на миозин 2b скольжения миозина
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробности полноразмерного немышечно-скользящего анализа миозина 2b. Протокол анализа скользящего актина с немышечной миозиновой нитью 2b отличается от протокола миозина 5а на определенных этапах. Убедитесь, что для каждого из этих шагов используются правильные буферы. Например, анализ NM2b требует прикрепления миозина к крышке в буфере с высоким содержанием соли, в то время как M5a может быть присоединен к крышке в буферах с высоким или низким содержанием соли. Кроме того, скользящий анализ актиновой нити M5a использует более низкую концентрацию миозина для смягчения частоты разрушения актиновых нитей во время приобретения.
    1. Подготовьте растворы для NM2b, как описано в таблице 2, и держите их на льду.
    2. Протойте в 10 мкл немышечного миозина 2b (0,2 мкМ) в буфере подвижности (МБ) 500 мМ (буфер с высоким содержанием соли) и 1 мМ дитиотрейтола (DTT) через проточную камеру и подождите 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы с высоким содержанием соли диссоциируют нити миозина и позволяют прикреплять одиночные молекулы миозина к поверхности, поскольку немузкусный миозин 2b может полимеризоваться в нити при ионной концентрации <150 мМ.
    3. Расход в 10 мкл 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 500 мМ МБ с 1 мМ DTT (буфер с высоким содержанием соли), как описано в таблице 2. Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    4. Промывка с 10 мкл 500 мМ МБ с 1 мМ DTT, как описано в таблице 2. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Поток в 10 мкл раствора черного актина, как описано в таблице 2, для устранения «мертвых головок», как обсуждается далее в разделе «Обсуждение». Раствор черного актина содержит 5 мкМ немаркированного F-актина, 1-10 нМ MLCK, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ CaCl2,1 мкМ CaM и 1 мМ DTT в буфере подвижности NaCl 50 мМ для фосфорилировать немуускуловый миозин 2b на поверхности камеры.
      1. Пипетку раствора со шприцем 1 мл и иглой 27 г для сдвига актиновой нити перед введением раствора в камеру. Повторите этот шаг еще два раза и подождите 1 минуту после третьего раза. Приблизительно достаточно 20 событий пипетирования.
    6. Поток в 50 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей.
    7. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы истощить камеру любого АТФ.
    8. Продуть в 10 мкл раствора rh-актина 20 нМ, содержащего 1 мМ ДТТ в 50 мМ МБ, и подождать 1 мин, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с немуусковым миозином 2b, прикрепленным к поверхности покровного листа.
    9. Промывайте 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT для смывания rh-актиновых нитей, не связанных с поверхностью. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Расход в 30 мкл конечного буфера. Для анализа скользящей актиновой нити на основе немузклового миозина 2b конечный буфер также включает кальмодулин, CaCl2и миозиновую легкоцепочечной киназу для обеспечения полного фосфорилирования немуускового миозина 2b во время видеоизображения. 0,7% метилцеллюлозы также может быть включено в конечный буфер, если актиновые нити только слабо связаны или не связаны с поверхностью. Этот вопрос обсуждается далее в разделе Обсуждение.
    11. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп с использованием длины волны возбуждения 561 нм. Соответствующее время экспозиции составляет 200 мс при мощности лазера 1,4 мВт при общей продолжительности захвата 0,5 -3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скорость захвата масштабируется соответствующим образом в соответствии со скоростью движущихся нитей. Важным соображением перед сбором данных для использования с программами отслеживания является частота кадров сбора. Субпиксельные движения между кадрами приведут к завышенности скорости, а для получения точных значений потребуются движения в несколько сотен нанометров. Оптимальная скорость захвата обеспечивает актин-скольжение на расстоянии не менее одного пикселя между кадрами. В случае микроскопа TIRF, используемого для визуализации здесь, этот порог переводится в 130 нм; поэтому миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 1 мкм/с, должен быть визуален со скоростью 5 кадров/с (интервал 0,2 с) для достижения 200 нм движения, в то время как миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 10 нм/с, требует 0,05 кадра/с (интервал 20 с). Поэтому при необходимости данные могут быть понижены на этом этапе (см. Обсуждение для получения более подробной информации).

3. Одномолекулярный анализ TIRF

  1. Подготовка обложек
    1. Разделите запас порошка на 10 мг аликвот (в пробирках по 1,5 мл) метокси-пег-силана (mPEG) и 10 мг аликвот биотин-пег-силана (bPEG). Хранить при -20 °C в герметичном, неувлажняемом контейнере и использовать в течение 6 месяцев.
    2. Загрузите восемь No 1,5Н (высокоточных) толщиной 22 мм квадратных крышек на стойку и промывайте 2-5 мл 200-стойкого этанола с последующим 2-5 мл дистиллированной воды. Повторите этот шаг стирки, заканчивая водой. Затем полностью высушите крышки с помощью воздушной линии илиN2 и плазменно очистите аргоном в течение 3 мин.
    3. Поместите чистые крышки на фильтровальную бумагу (90 мм) в чашку для культивации тканей (100 x 20 мм) и высиживайте в духовке с 70 °C, выполняя следующие шаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная очистка может быть заменена другими методами химической очистки49.
    4. Приготовьте 80% раствор этанола с dH2O и отрегулируйте рН до 2,0 с помощью HCl. Добавьте 1 мл этого к 10 мг аликвоты mPEG и 1 мл к 10 мг аликвоты bPEG. Вихрь растворяется, что не должно занимать более 30 с.
    5. Взять 100 мкл раствора BPEG и добавить 900 мкл 80% этанола (рН 2,0). Этот раствор составляет 1 мг/мл bPEG. Затем внесите раствор обоих ПЭГ следующим образом, тщательно перемешав.
      1. 200 мкл 10 мг/мл mPEG (конечная концентрация: 2 мг/мл).
      2. 10 мкл 1 мг/мл бПЕГ (конечная концентрация: 10 мкг/мл).
      3. 790 мкл 80% раствора этанола (рН 2,0).
    6. Доберите крышки из духовки. Осторожно распределите 100 мкл раствора ПЭГ по центру каждого облицовки, следя за тем, чтобы только верхняя поверхность была влажной. Затем поместите слипы обратно в духовку и высиживайте в течение 20-30 минут.
    7. Когда покровные листы начнут принимать дырявый вид, с небольшими кругами, видимыми по всей поверхности, снимите их из духовки.
    8. Вымойте каждую крышку 100% этанолом, высушите воздушной линией и поместите обратно в духовку. Инкубировать только в течение времени, необходимого для создания камер на этапе 2.
  2. Подготовка камеры
    1. Очистите слайд микроскопа для использования в камере. Вырежьте два куска двусторонней ленты, примерно 2 см длиной.
    2. Поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпадает с краем слайда. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными и выровненными.
    3. Возьмите одну из функционализированных обложек из духовки (созданную в 3.1). Осторожно наклейте крышку на ленту так, чтобы сторона, покрытая ПЭГ, была лицевой стороной вниз и непосредственно контактировала с лентой, как показано на рисунке 1. Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно прилипла к слайду.
    4. Отрежьте лишнюю ленту, висящую над горкой, лезвием бритвы. Эти камеры могут быть использованы немедленно или помещены попарно в трубку 50 мл и храниться в морозильной камере при -80 °C для будущего использования. Важно хранить сразу, иначе поверхность разлагается.
  3. Выполнение микроскопии миозина 5a TIRF
    1. Готовят растворы для анализа миозина 5а с перевернутой моторизостью, описанного в таблице 3, и держат их на льду.
    2. Промывайте камеру с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT.
    3. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    4. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Продуть в 10 мкл раствора НейтрАвидина в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и подождать 1 мин.
    6. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    7. Протоите в 10 мкл биотинилированного родамин-актина (bRh-Актина), содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ МБ и выжидайте 1 мин. На этом этапе используйте большой наконечник пипетки и избегайте пипетки вверх и вниз, чтобы свести к минимуму сдвиг флуоресцентных актиновых нитей, чтобы обеспечить прикрепление длинных актиновых нитей к поверхности (20-30 мкм или дольше). Эффективной альтернативой является резка конуса стандартного наконечника пипетки (с отверстием ≈1-1,5 мм).
    8. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    9. Поток в 30 мкл конечного буфера с добавлением 10 нМ миозина 5а, затем немедленно загружается на микроскоп TIRF и записывается после нахождения оптимального фокуса для модальности визуализации TIRF. Время воздействия между 100-200 мс подходит при мощности лазера 1,4 мВт для актина и меченого GFP миозина. Подходящее время сбора для анализа скорости составляет 3 мин.
  4. Выполнение немышечного миозина 2b TIRF микроскопии
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем разделе приведены подробные сведения о немышечном анализе миозина 2b TIRF с использованием полимеризованных и фосфорилированных нитей. Включен подробный протокол (разделы 4.1-4.3) для фосфорилирования и полимеризации немуускового миозина-2b в пробирке.
    1. Чтобы фосфорилировать очищенный NM2b, внесите 10-кратную киназную смесь со следующими условиями: 2 мМCaCl2,1 мкМ CaM, 1-10 нМ MLCK и 0,1 мМ АТФ. Это может быть доведено до объема с 500 мМ МБ с 10 мМ DTT. Добавьте 10-кратную киназную смесь к миозину в объемном соотношении 1:10 и дайте ему инкубировать в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Как правило, концентрация миозина для этой ступени составляет 1 мкМ.
    2. Для полимеризации фосфорилированного миозина в нити снижают концентрацию соли NM2b до 150 мМ NaCl. Для этого сделайте 1-кратный буфер подвижности (1 МБ) без соли, разбавлив 4 МБ четыре раза в dH2O. Этот 1x MB может быть использован для снижения концентрации соли, потому что NM2b был заморожен в соляном буфере 500 мМ.
    3. На каждые 3 мкл запаса NM2b добавляют 7 мкл 1x MB для снижения концентрации соли до 150 мМ NaCl и инкубируют на льду в течение 20-30 мин с образованием нитей NM2b.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок, приведенный в разделах 4.1-4.3, не имеет решающего значения, если NM2b фосфорилирован и конечная концентрация соли составляет 150 мМ. Инкубация порядка 30 мин-1 ч дает достаточно времени для полного фосфорилирования и полимеризации.
    4. Готовят растворы для немуускового анализа миозина 2b с перевернутой моторизостью, описанного в таблице 3, и держат их на льду.
    5. Промывайте камеру с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT.
    6. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 150 мМ МБ с 1 мМ DTT Повторите эту промывку еще два раза и подождите 1 мин после третьей промывки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    7. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    8. Продуть в 10 мкл раствора НейтрАвидина в 150 мМ МБ с 1 мМ DTT и подождать 1 мин.
    9. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Протоите в 10 мкл bRh-актина и подождите 1 мин. На этом этапе используйте наконечник пипетки с большим растонием и избегайте пипетки вверх и вниз, чтобы свести к минимуму сдвиг флуоресцентных актиновых нитей, чтобы обеспечить прикрепление длинных актиновых нитей к поверхности (20-30 мкм или дольше). Эффективной альтернативой является вырезание конуса стандартного наконечника пипетки.
    11. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    12. Протоите в 10 мкл немышечные растворы миозина 2b (приблизительно 30 нМ) и подождите 1 мин.
    13. Промывка с 10 мкл 150 МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    14. Протейте в 30 мкл конечного буфера, затем немедленно загрузите его на микроскоп TIRF и запишите после нахождения оптимального фокуса для метода визуализации TIRF. Время воздействия между 100-200 мс подходит при мощности лазера 1,4 мВт для актина и меченого GFP миозина. Подходящее время сбора для анализа скорости составляет 3 мин.

4. Анализ изображений

  1. Анализ изображений для анализа скользящей актиновой нити
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения и руководств, связанных с Перечнем материалов. Важно отметить, что описанная здесь программа требует TIFF-стеков для анализа. Процесс анализа скользящей актиновой нити накаливания выглядит следующим образом50.
    1. Загрузите необработанные стеки фильмов в указанную структуру папок и введите в программу самый верхний каталог папок фильмов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа анализирует файлы в этом каталоге и подкаталогах, рассматривая каталоги самого низкого уровня как реплики. Будут подготовлены средние статистические данные по каждой группе реплик. В этом случае для каждого миозина использовался один фильм. При характеристике нового миозина или исследовании нового экспериментального состояния рекомендуется анализировать фильмы из трех полей зрения (FOV) на камеру в общей сложности три камеры и повторять этот рабочий процесс для трех препаратов исследуемого миозина.
    2. Используйте скрипт "stack2tifs" в сочетании с введенной пользователем частотой кадров для преобразования каждого стека TIFF в папку, содержащую серию отдельных файлов TIFF и соответствующий файл метаданных.txt содержащий время начала каждого кадра. Для данных, не в формате стека TIFF, преобразование должно быть сначала применено с использованием программного обеспечения, такого как перечисленные в Таблице материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт является частью программного пакета. Информацию о скрипте можно найти здесь: «https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs»
    3. Используйте параметр -px, который представляет собой размер пикселя (в нм) во время получения. В этом случае размер пикселя составляет 130 нм. Параметры -xmax и -ymax используются для масштабирования осей выходов точечной диаграммы. Они соответствуют самой длинной построенной длине нити накаливания и максимальной построенной скорости (в нм/с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это оценочные значения, которые могут быть установлены на более высокие, чем ожидалось, значения, чтобы обеспечить содержание данных на графике. После анализа необработанные данные также могут быть экспортированы для использования в другом статистическом или графическом программном обеспечении для просмотра и анализа.
    4. Используйте параметр -minv, который является параметром минимальной скорости отсечения, для определения нитей, которые не движутся, и поэтому могут быть исключены из анализа. Для медленного миозина, такого как NM2b, этот параметр должен быть низким (в данном примере 5 нм/с), чтобы избежать вырезания истинных скользящих движений. Для быстрого миозина, такого как M5a, этот параметр может быть выше (в данном примере 100 нм/с), чтобы применить более строгий фильтр, сохраняя при этом истинное распределение скорости скольжения.
    5. Используйте параметр отсечения -pt для определения плавного движения. Для каждого окна выборки вычисляется значение, эквивалентное 100 x стандартному отклонению скорости/средней скорости. Треки с более высокими значениями, чем отсечки, имеют больше переменных скоростей и исключаются из дальнейшего анализа. В этом примере использовалось значение отсечения, равное 33. Треки с более высокими значениями имеют больше переменных скоростей и исключены из дальнейшего анализа.
    6. Используйте -maxd для установки максимально допустимого расстояния связи между кадрами. Это рассчитанное расстояние между кадрами, перемещаемое центроидом нити накала в единицах нм. Это может быть полезно для исключения спорадических движений или неправильной связи между нитями. В приведенных здесь примерах параметр был оставлен со значением по умолчанию 2 000 нм.
  2. Анализ изображений для микроскопического анализа TIRF
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа анализа одной молекулы TIRF на программном обеспечении для визуализации, специально указанном в Таблица материалов выглядит следующим образом:29.
    1. Щелкните и перетащите записанное видео микроскопии в рабочее пространство программного обеспечения, чтобы открыть его51. Затем разделите каналы сбора. Нажмите на Изображение > Цвет > Разделенные каналы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае заметного дрейфа стадии во время съемки изображения должны быть стабилизированы для коррекции инструментального дрейфа на плоскости изображения. При этом компенсация дрейфа оси Z не использовалась, так как микроскоп, используемый для получения этих данных, хорошо стабилизирует Z-фокус. Чтобы стабилизировать изображение в программе анализа изображений, установите соответствующий плагин стабилизатора, который связан со списком материалов. Стабилизатор изображения принимает фиксированные положения для объектов на изображении и использует скользящее среднее предыдущих кадров в качестве эталона. Поэтому рекомендуется начинать с канала, содержащего изображения меченого актина, поскольку он находится в фиксированном положении.
    2. Нажмите на Плагины,затем найдите Стабилизатор изображения; Убедитесь, что выбран параметр «Трансляция» и сохраняют параметры по умолчанию. Установите флажок Коэффициенты преобразования журналов. Применение этого шага Log позволяет применить вычисляемые параметры сдвига к другому каналу на следующем шаге. Обеспечьте завершение процесса.
    3. Затем откройте канал с меткой миозина и примените стабилизацию, нажав на Плагины > Image Stabilizer Log Applyr. Если изображения актина не могут быть получены во время одного и того же сбора из-за требования к более высокой скорости визуализации в одном канале, дрейф стабилизирует стек изображений, выбрав область, содержащую статические объекты, такие как биотинилированный фидуциальный маркер или флуорофоры, не связанные конкретно с поверхностью биотин-ПЭГ. Эта область может быть обрезана из исходного стека и стабилизирована с последующим применением результирующих значений сдвига к исходному стеку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На практике дрейф, наблюдаемый в экспериментах по мотористи, будет незначительным по сравнению с движением миозинов, которые движутся со скоростью несколько сотен нм / с, но для самых медленных миозинов это становится важным соображением.
    4. Затем откройте TrackMate, нажмите на Плагины; затем, в его выпадающем меню нажмите на Отслеживание и, наконец, на TrackMate. На этом этапе анализ изображения подлежит оптимизации на основе параметров флуорофора и условий анализа. Однако идеальные стартовые параметры заключаются в следующем.
      1. Настройки калибровки: сохраните все значения по умолчанию.
      2. Детектор: Детектор LoG.
      3. Расчетный диаметр капли: 0,5-1,0 мкм.
      4. Порог: 25-200. (Это можно определить, щелкнув «Предварительный просмотр» после выбора номера, чтобы увидеть, соответствуют ли обнаруженные пятна фильму, и соответствующим образом настроить его.)
      5. Начальное пороговое значение: не установлено.
      6. Вид: Дисплей HyperStack.
      7. Установка фильтров на пятнах: не установлена.
      8. Трекер: Простой ТРЕКЕР LAP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Они зависят от частоты кадров и скорости миозина и должны быть достаточно большими, чтобы соединить последующие положения, исключая нежелательные соединения между различными частицами.
      9. Максимальное расстояние связи: 1,0 микрон.
      10. Максимальное расстояние закрытия зазора: 1,0 мкм.
      11. Максимальный зазор при закрытии кадра: 1.
      12. Установка фильтров на треках: Смещение трека (>0,39 - для включения только пятен, движущихся более чем на 3 пикселя), Пятна в треках (>3 - для включения только треков с не менее чем 3 пятнами). Другие фильтры, такие как Minimal Velocity, могут быть введены для исключения пятен, которые останавливаются в течение длительных периодов времени. Результаты фильтрации должны быть проверены визуальным осмотром следов, чтобы гарантировать, что ложные следы (т. Е. Движение миозина в фоновом режиме, которое не находится вдоль актинового трека) удаляются при сохранении дорожек, связанных с актином.
    5. Как только появится экран Параметры отображения, нажмите «Анализ» для соответствующих выходных данных. Сохраните три созданные таблицы (Статистика треков, Ссылки в статистике треков и Места в статистике треков). Таблица Track Statistics будет содержать данные о скорости и смещении, которые затем могут быть впоследствии проанализированы для характеристики нового белка или эффектов определенного экспериментального условия, например.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Очистку миозина можно оценить, выполнив восстанавливающий додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) гель-электрофорез, как показано на рисунке 2. Хотя этот рисунок представляет собой окончательный, постдиализированный миозин, SDS-PAGE может быть выполнен на аликвотах из ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь представлен рабочий процесс для очистки и характеристики in vitro миозина 5a и немузмускового миозина 2b. Этот набор экспериментов полезен для количественной оценки механохимических свойств очищенных миозиновых конструкций быстрым и воспроизводимым способом. Хотя два миозина, пока?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Фан Чжана за техническую помощь в подготовке реагентов, используемых для сбора этих данных. Эта работа была поддержана фондами NHLBI/NIH Intramural Research Program HL001786 для J.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 Gauge NeedleBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acetic AcidThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor TabletsMillipore Sigma5056489001This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AThe diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
EthanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Unstained Standard LadderThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMillipore SigmaMX0482
MethylcelluloseMillipore SigmaM0512
Microscope SlidesFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding AssayCorning353025Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted AssayCorning353003Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette TipsThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope CameraAndorModel: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control BoxTokai HITCustom Thermobox
Microscope Laser UnitNikonLU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench CentrifugeThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderModel: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

Ссылки

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены