Анализ церебрального спазма сосудов в мышиной модели субарахноидального кровоизлияния с помощью высокочастотного транскраниального дуплексного ультразвука

Резюме

Целью этой рукописи является представление метода на основе сонографии, который позволяет in vivo визуалировать кровоток в мозговых артериях у мышей. Показано его применение для определения изменений скоростей кровотока, связанных с спазмом сосудов в мышиных моделях субарахноидального кровоизлияния (САГ).

Аннотация

Церебральный спазм сосудов, возникающий через недели после субарахноидального кровоизлияния, разновидность геморрагического инсульта, способствует задержке ишемии головного мозга. Проблема, встречаемая в экспериментальных исследованиях с использованием мышиных моделей SAH, заключается в том, что отсутствуют методы мониторинга in vivo церебрального спазма сосудов у мышей. Здесь мы демонстрируем применение высокочастотного ультразвука для выполнения транскраниальных дуплексных сонографических исследований на мышах. С помощью метода можно было идентифицировать внутренние сонные артерии (ICA). Скорости кровотока в внутричерепных ICO значительно ускорялись после индукции SAH, в то время как скорости кровотока в экстракраниальных ICO оставались низкими, что указывает на церебральный спазм сосудов. В заключение, метод, продемонстрированный здесь, позволяет осуществлять функциональный, неинвазивный in vivo мониторинг церебрального вазоспазма в мышиной модели SAH.

Введение

Спонтанное субарахноидальное кровоизлияние (САГ) является формой геморрагического инсульта, в основном вызванного разрывом внутричерепной аневризмы^1. На неврологический исход в основном влияют два фактора: ранняя черепно-мозговая травма (ЭБР), которая вызвана последствиями кровотечения и связанной с ним транзиторной глобальной ишемии головного мозга, и отсроченная ишемия головного мозга (ДКИ), которая возникает в течение недель после кровотечения^2,3. Сообщалось, что DCI затрагивает до 30% пациентов с САГ^2. Патофизиология DCI включает ангиографический церебральный спазм сосудов, нарушенную микроциркуляцию, вызванную микровасоспазмами и микротромбозом, кортикальные распространяющиеся депрессии и эффекты, вызванные воспалением^4. К сожалению, точная патофизиология остается неясной, и нет доступного лечения, которое эффективно предотвращает DCI^3. Поэтому DCI исследуется во многих клинических и экспериментальных исследованиях.

В настоящее время большинство экспериментальных исследований SAH используют модели мелких животных, особенно у мышей^{5,6,7,8,9,10,11,12,13.} В таких исследованиях церебральный спазм сосудов часто исследуется как конечная точка. Принято определять степень спазма сосудов ex vivo. Это связано с тем, что отсутствуют неинвазивные методы исследования in vivo церебрального спазма сосудов, требующие короткого времени анестезии и наносящие лишь небольшой дистресс животным. Тем не менее, обследование церебрального спазма вазоса in vivo будет выгодным. Это связано с тем, что это позволило бы проводить продольные исследования in vivo по спазму сосудов у мышей (т. Е. Визуализация церебрального спазма сосудов в разные моменты времени в течение нескольких дней после индукции SAH). Это повысило бы сопоставимость данных, полученных в разные моменты времени. Кроме того, использование продольного дизайна исследования является стратегией сокращения численности животных.

Здесь мы демонстрируем использование высокочастотного транскраниального ультразвука для определения кровотока в мозговых артериях у мышей. Показано, что, подобно транскраниальной допплерографии (ТХД) или транскраниальной цветной дуплексной сонографии (ТКХД) в клинической практике^{14,15,16,17,18,}этот метод может быть использован для мониторинга церебрального спазма сосудов путем измерения скоростей кровотока внутричерепных артерий после индукции САУ в мышиной модели.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены ответственным комитетом по уходу за животными (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) и проведены в соответствии с Немецким законом о благополучии животных (TierSchG). Были соблюдена все применимые международные, национальные и институциональные руководящие принципы по уходу за животными и их использованию. В этом исследовании мы провели измерения скоростей кровотока внутричерепных и экстракраниальных артерий у самок мышей C57BL/6N в возрасте 11-12 недель с массой тела 19-21 г. Мышей подвергали либо индукционной САХ, либо фиктивной хирургии, которая была подробно описана в другом месте^10,12,13.

1. Подготовка материалов

1. Включите ультразвуковой аппарат и введите идентификатор животного.
2. Нагреть нагревательную пластину ультразвуковой системы до 37 °C. Убедитесь, что ректальный датчик температуры готов к использованию.
3. Используйте водяную баню, чтобы нагреть ультразвуковой гель до 37 °C. Приготовьте крем для удаления волос, контактный крем для электродов и глазную мазь.

2. Анестезия

1. Индуцируют анестезию, помещая мышь в камеру, промытую 4% изофлураном и 40% O₂ в течение 1 мин. Защитите глаза глаз глазной мазью. Продолжают только после того, как будет достигнута достаточно глубокая анестезия (отсутствие реакций на болевые раздражители).
2. Поддерживайте анестезию с 1,5% изофлураном и 40% O₂ с помощью анестезии маски на протяжении всей процедуры.

3. Определение скоростей кровотока внутричерепных внутренних сонных артерий с помощью транскраниальной высокочастотной дуплексной сонографии

1. Поместите мышь в положение лежа на нагревательной пластине ультразвуковой системы для поддержания температуры тела 37 °C.
2. Покрывайте четыре конечности животного проводящей пастой и закрепляйте их скотчем на электродах ЭКГ, встроенных в доску. Проверьте, правильно ли отображаются физиологические параметры (ЭКГ, сигнал дыхания) на экране системы визуализации (например, Vevo3100). При необходимости корректируют уровень анестезии для получения целевой частоты сердечных сокращений 400-500 ударов в минуту (уд/мин).
3. Поместите смазку на ректальный температурный зонд и осторожно вставьте его, чтобы контролировать температуру тела. При необходимости используйте дополнительную нагревательную лампу.
4. Перед первым обследованием удалите мех на затылочном затылочном химическом методе с помощью крема для удаления волос. Используйте ватный тампон для намазыва и растирайте крем в течение 2 минут, пока волоски не начнут выпадать.
   1. Через дополнительные 2 мин удалите крем и волоски шпателем и продезинфицируйте кожу спиртовым антисептиком для кожи. Покрыть ультразвуковым гелем, подогретым до 37 °C.
5. Используйте линейный преобразователь с частотой 38 МГц и частоту кадров выше 200 кадров/с для получения ультразвуковых изображений и фиксации зонда в механическом рычаге. Поместите преобразователь на затылку, наклоненный назад на 30°.
6. Используйте режим яркости (B) и доплеровский режим цветной волны (CW) для визуализации правой внутричерепной внутренней сонной артерии и перемещения датчика с блоком управления назад и вперед, пока не будет найден максимальный поток артерий.
7. Для сбора анатомической информации используйте традиционный B-mode и CW-doppler-режим и начните сбор, нажав на кнопку Acquire.
   1. Для записи информации о характеристиках потока внутричерепных сосудов нажмите кнопку Pulse-Wave (PW) Doppler, поместите объем образца в центр сосуда и приобретите кинопетлю длиной более 3 с.
8. Действуйте аналогично с левой стороны.
9. Продолжают проводить экстракраниальные сонные артерии.

4. Определение скоростей кровотока экстракраниальных внутренних сонных артерий с помощью высокочастотной дуплексной сонографии

1. Поместите мышь в положение лежа на спине на нагревательной пластине ультразвуковой системы для поддержания температуры тела 37 °C.
2. Покрывайте четыре конечности животного проводящей пастой и закрепляйте их скотчем на электродах ЭКГ, встроенных в доску. Проверьте еще раз правильность отображения физиологических параметров на экране.
3. Перед первым обследованием удалите волосы на передней шее химическим путем, используя крем для удаления волос, как описано выше. Обработать переднюю шею ультразвуковым гелем, нагретым до 37 °C.
4. Используйте линейный преобразователь массива 38 МГц и частоту кадров выше 200 кадров/с для получения ультразвуковых изображений. Поместите преобразователь параллельно животному и отрегулируйте положение, чтобы получить продольные изображения правой сонной артерии.
5. Используйте режим яркости (B) и доплеровский режим цветной волны (CW) для визуализации правой сонной артерии. Изображение должно содержать правую общую сонную артерию (RCC), правую внутреннюю сонную артерию (RICA) и правую наружную сонную артерию (RECA).
6. Для сбора анатомической информации используйте традиционный B-mode и CW-doppler-режим и начните сбор, нажав на кнопку Acquire.
   1. Для записи информации о характеристиках потока экстракраниальной сонной артерии нажмите кнопку Pulse-Wave (PW) Doppler, поместите объем образца в центр середины общей сонной артерии, внутренней сонной артерии и наружной сонной артерии и приобретите кинопетлю длиной более 3 с.
7. Действуйте аналогично с левой стороны.
8. Прекратите анестезию и выньте животное из согревающей пластины. Верните животное в клетку, помещенную в инкубатор, нагретый до 37 °C, в течение 1 часа, чтобы предотвратить переохлаждение и проверить полное выздоровление.

5. Обработка данных УЗИ

1. Используйте внешнюю рабочую станцию для постобработки высокочастотных ультразвуковых данных. Экспортируйте изображения b-режимов, CW-доплеровских и PW-доплеровских режимов и киноциклов.
2. Откройте экспортируемый ультразвуковой кабинет. Выберите одно животное и вскройте ПВ-допплеровскую кинопетку внутричерепной сонной артерии. В этом протоколе обычно регистрируется от 7 до 8 сердечных сокращений и соответствующих кривых скорости потока.
3. Приостановите цикл кино и нажмите кнопку Измерение. Выберите сосудистый пакет и нажмите на RICA PSV, чтобы измерить пиковое систолическое давление (PSV). Теперь нажмите влево на пик кривой скорости и потяните прямую линию к нулевой линии. Определите измерение одним щелчком правой кнопки мыши.
4. Теперь выберите RICA EDV для измерения конечной скорости (EDV). Нажмите влево на минимальную сыпь кривой скорости в конце диастолы. Потяните линию прямо к нулевой линии и определите измерение щелчком правой кнопкой мыши.
5. Выберите RICA VTI для измерения интеграла времени скорости (VTI). Щелкните влево в начале кривой скорости и следуйте по кривой мышью до конца диастолического плато. Затем нажмите правую кнопку еще раз, чтобы определить измерение.
6. Экспортируйте данные внутримозговых внутренних сонных артерий с помощью кнопки отчета. Нажмите экспорт и сохраните данные в виде файла отчета VSI.
7. Используйте тот же подход для измерения ПСВ, ЭДВ и ВТИ правых экстракраниальных внутренних сонных артерий и экспортируйте данные соответствующим образом.
8. Действуйте аналогично с левой стороны.

Результаты

У 6 мышей, у 3 из которых SAH индуцировали с использованием модели перфорации эндоваскулярной нити, в то время как у 3 была получена фиктивная операция, скорости кровотока внутричерепной внутренней сонной артерии (ICA) и экстракраниальной ICA были определены за день до операции и через 1, 3 и 7 д...

Обсуждение

Насколько нам известно, это исследование является первым, в котором представлен протокол мониторинга церебрального спазма сосудов в мышиной модели SAH с высокочастотным транскраниальным цветным дуплексным ультразвуком. Показано, что этот метод может измерять увеличение скоростей вну...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software