Воздушная инфляция мышиных легких с сосудистой перфузией-фиксацией

Резюме

Представлен метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией легких, сохраняющих расположение клеток в дыхательных путях, альвеолах и интерстиции для структурно-функционального анализа. Постоянное давление в дыхательных путях поддерживается с помощью воздушно-инфляционной камеры, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек. Легкие обрабатываются для гистологических исследований.

Аннотация

Гистология легких часто используется для исследования вклада, обеспечиваемого клетками воздушного пространства во время гомеостаза легких и патогенеза заболеваний. Однако широко используемые методы фиксации на основе инстилляции могут вытеснять клетки воздушного пространства и слизь в конечные дыхательные пути и могут изменять морфологию тканей. Для сравнения, методы фиксации сосудов превосходят в сохранении местоположения и морфологии клеток в воздушном пространстве и слизистой оболочки. Однако, если одновременно не применяется положительное давление в дыхательных путях, области легких могут коллапсировать, а капилляры могут выпячиваться в альвеолярные пространства, что приводит к искажению анатомии легких. Здесь мы описываем недорогой метод воздушной инфляции во время сосудистой перфузии-фиксации для сохранения морфологии и расположения дыхательных путей и альвеолярных клеток и интерстиций в легких мышей для последующих гистологических исследований. Постоянное давление воздуха подается в легкие через трахею из герметичной, заполненной воздухом камеры, которая поддерживает давление через регулируемую колонку жидкости, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек.

Введение

Гистология легких представляет собой золотой стандарт для оценки архитектуры легких во время здоровья и болезни и является одним из наиболее часто используемых инструментов исследователями^{легких1}. Одним из наиболее критических аспектов данной методики является правильная изоляция и сохранение легочной ткани, так как вариабельность на этом этапе может привести к ухудшению качества тканей и ошибочным результатам^1,2,3. У живых животных объем легких определяется балансом между внутренней упругой отдачей легкого и внешними силами, передаваемыми от грудной стенки и диафрагмы поверхностным натяжением. Соответственно, при входе в грудную клетку теряются внешние силы и легкое разрушается. Гистологические срезы, подготовленные из коллапсированных легких, имеют переполненный вид, и границы между анатомическими компартментами (т. Е. Воздушные пространства, сосуды и интерстиции) может быть трудно различить. Чтобы обойти эту проблему, исследователи часто раздувают легкие во время химической фиксации, чтобы сохранить размер и архитектуру воздушного пространства.

Легкие могут быть раздуты воздухом или жидкостью. Давление, необходимое для надувания легких до одного и того же объема, различается между надуванием воздуха и жидкости из-за межмолекулярных сил на границе раздела воздух-жидкость. Для преодоления поверхностного натяжения и вскрытия разрушенных альвеол 4 требуется более высокое давление (например, 25 смН₂О), чем давление жидкости (например,₁₂смН²О). После того, как альвеолы были набраны, более низкое давление может держать альвеолы открытыми до того же объема, что и плато кривой давления-объема, и давления выравниваются по всему легкому в соответствии с законом Паскаля^4,5,6,7,8.

Существуют два основных метода инфляции и фиксации легких для сохранения мышиных легких для гистологии. Чаще всего воздушные пространства закапываются жидкостью , часто содержащей фиксатор. Основным преимуществом такого подхода является то, что он относительно прост и требует небольшой подготовки. В то время как интратрахеальная инстилляция фиксатора может быть предпочтительной в исследованиях, которые сосредоточены на сосудистой сети, жидкость, которая закапывается через трахею, имеет тенденцию выталкивать проксимальные клетки дыхательных путей и муцины в более дистальные области воздушного^{пространства,}в то время как инфляция воздуха не составляет^{1,3,4,9,10,11.} Более того, непреднамеренное отслоение лейкоцитов от эпителия во время жидкой инфляции изменяет их морфологию, артефактно придавая им простой, округлый вид^4,10,11,12. Наконец, надув легких жидкостью может непреднамеренно сжимать интерстиций^4,10,11. Вместе эти факторы могут искажать нормальную анатомию и клеточное распределение в сохранившихся легких, тем самым ограничивая технику.

Альтернативным методом сохранения тканей является сосудистая перфузия-фиксация. При этом методе фиксатор перфузируется в легочную сосудистую систему через полую вену или правый желудочек. Этот метод сохраняет расположение и морфологию клеток в просвете воздушного пространства. Однако, если легкие не раздуваются во время фиксации перфузии, легочная ткань, вероятно, разрушится.

Воздушная инфляция с сосудистой перфузион-фиксацией использует сильные стороны каждого из вышеперечисленных методов фиксации. Здесь мы предоставляем протокол для этой техники. Материалы и оборудование, которые требуются, относительно недороги и могут быть легко получены и собраны. Завершенная установка, показанная на рисунке 1А,обеспечивает постоянное давление в дыхательных путях легких с помощью регулируемой, заполненной жидкостью колонки, в то время как перистальтический насос обеспечивает фиксацию через правый желудочек. Легкие с сохраненной морфологией затем могут быть дополнительно обработаны для структурно-функционального анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального еврейского здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из трех компонентов. Первый компонент детализирует конструкцию воздушного накачки с перфузионным/фиксаторным оборудованием. Во втором разделе описывается, как настроить оборудование для эксперимента. В заключительном разделе описано, как подготовить животное и провести эксперимент.

1. Конструкция водотолщавого аппарата(рисунок 1В)

1. Снимите плунжер со скользящего наконечника шприца на 60 мл.
2. Прикрепите ленту вокруг шприца на отметке 30 мл. Установите высоту шприца на эту отметку для начального давления инфляции 25 смН₂О. Здесь также должен быть уровень воды в колонке на протяжении всей процедуры. Пометьте ленту либо как «25 см» (как показано на рисунке 1A),либо как «инфляция».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфляционное давление в 25 смН₂О используется для обеспечения набора разрушенных воздушных пространств. После набора альвеол давление снижается до 20 смН₂О, чтобы гарантировать, что воздушное пространство не будет растянуто.
3. Отмерьте 5 см от ленты к концу плунжера и прикрепите к шприцу еще один кусок ленты. Переместите шприц вниз к этой отметке, чтобы снизить давление инфляции до 20 смН₂О во время фиксации. Обозначьте ленту либо как «20 см» (как показано на рисунке 1А),либо как «фиксация».
4. Прикрепите трубку 180 поливинилхлорида (ПВХ) к концу шприца. Длина трубки зависит от расстояния между шприцем и воздушной инфляционной камерой (примерно 25-30 см).
5. Поместите мужской тройник в стиле нити Luer (2) (длина 1,219 дюйма, высота 0,904 дюйма, внутренний диаметр 0,0904 дюйма) на другой конец трубки. Этот самец Luer будет подключаться к запорному крану воздушно-инфляционной камеры (шаг 2.4).

2. Конструкция воздушно-инфляционной камеры(рисунок 1С)

1. Просверлите два отверстия (диаметром около 4 мм) в пластиковом контейнере объемом 500 мл с навинчиваемым колпачком. Отверстия должны быть того же размера, что и женские Luers (длина 1,224 дюйма, высота 0,312 дюйма, внутренний диаметр 0,098 дюйма).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые среды или буферные контейнеры могут быть использованы для воздушно-инфляционной камеры.
2. Покрывать резьбу женских Луеров силиконовой прокладкой и помещать меньшую сторону в предварительно просверленные отверстия контейнера.
3. Добавьте силиконовую прокладку вокруг женских Luers, где они входят в контейнер, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
4. Винт на одностороннем запорном кране на нижней женской луере на воздушно-инфляционной камере.
5. Нарежьте трубку на длину примерно 25 см и прикрепите самцы Luers к свободным концам трубки. Подключите мужской Luer на одном конце трубки к свободному женскому Luer на воздушно-инфляционной камере. Другой самец Luer подключится к контейнеру для обработки животных.

3. Конструкция контейнера для переработки животных(рисунок 1D)

1. Просверлите отверстие (диаметром около 4 мм) в боковой части большого пластикового контейнера. Отверстие должно быть диаметром самки Луэр. Пластиковый контейнер нужен для улавливания избыточного фиксирования раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался пластиковый контейнер для хранения размером 30 см х 22 см, 3,8 л.
2. Обложите резьбу женского Luer силиконовой прокладкой и поместите меньшую сторону в предварительно пробуреное отверстие контейнера.
3. Добавьте силиконовую прокладку вокруг женского Luer, где он входит и выходит из контейнера, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
4. Прикрутите односторонний запорный кран к самке Luer. Трубка из воздушно-инфляционной камеры будет прикреплена к этому запорному крану.

4. Приготовление растворов

1. Раствор гепарина
   1. Наполните контейнер безкальцийным PBS и гепарином (20 Ед/мл). Приготовьте в общей сложности 10 мл раствора гепарина для каждой мыши. Гепарин является антикоагулянтом, который предотвращает образование тромбов в сосудах во время перфузии-фиксации. Раствор гепарина будет использоваться для промывания крови из легких перед перфузией-фиксацией.
2. Фиксаторное решение
   ВНИМАНИЕ: Фиксаторы могут представлять опасность для здоровья и должны использоваться в химическом вытяжном вытяжке. Все аппараты установлены в химическом вытяжном капюшоне для предотвращения вдыхания фиксаторов.
   1. Наполните контейнер безкальцийным PBS и параформальдегидом (конечная концентрация 4%). Приготовьте в общей сложности 50 мл фиксаторного раствора для каждой мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемого фиксатора может варьироваться и будет зависеть от последующих гистологических исследований.

5.   Подготовка перфузионного аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Перистальтический насос предлагается для доставки жидкостей в сосудистую азкулятуру для обеспечения постоянного расхода. Следующие направления предназначены для настройки перистальтического насоса и могут отличаться для каждой модели. Альтернативно, если перистальтический насос недоступен, может быть сконструирован второй аппарат с водяным столбом для перфузла жидкостей с высоты 35 см H₂O.

1. Сначала поместите трубку вокруг роликового узла.
2. Закрепите трубку в насечке.
3. Зафиксирует рычаги на месте, сначала поместив левый рычаг вокруг трубки и закрепив его на месте верхним, а затем правым рычагом.
4. Поместите проксимальный конец трубки в раствор гепарина, а дистальный конец в контейнер для обработки животных.
5. Предварительно загрузите раствор гепарина в трубку, запустив насос для выталкивания воздуха из трубки.
6. Закрепите иглу 25G x 5/8" на конце левой стороны трубки.

6. Подготовка воздухо-инфляционного аппарата

1. Поместите шприц для толщи воды в держатель кольца.
2. Измерьте вертикальную высоту 25 см от платформы животного до отметки ленты «25 см» (шаг 1.2) на толще воды.
3. Прикрепите конец трубки водяного столба к запорному крану на воздушной камере.
4. Прикрепите трубку от самки Luer воздушной камеры к запорному крану на контейнере для обработки животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если воздушно-инфляционная камера сконструирована так, как показано на рисунке 1С,присоединение трубки в обратном порядке может привести к утечке воды в трубку, которая соединяется с трахеальной канюлой.
5. Убедитесь, что крышка воздушной камеры плотно закрыта.
6. Убедитесь, что запорный кран на внешней стороне контейнера для переработки животных закрыт, а запорный кран на трубке, ведущий от толщи воды к воздушно-инфляционной камере, открыт.
7. Наполните шприц водой до отметки «25 см». Вода выйдет из шприца через трубку в воздушную камеру. Как только давление будет выровняно, вода перестанет течь.
   1. Возможно, что вода будет медленно просачиваться в воздушно-инфляционную камеру, поскольку давление окружающего воздуха в химическом вытяжке колеблется. Следите за уровнем воды в шприце и при необходимости добавляйте его. Поддерживайте уровень воды на отметке «25 см» на протяжении всей процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно уровни воды остаются неизменными в течение первой части инфляции воздуха при 25 смH₂O; однако во время фиксации в шприц, вероятно, потребуется добавить больше воды. Если вода не перестает течь, вполне вероятно, что в воздушно-инфляционной камере существует утечка воздуха. Возможно, потребуется применить больше силиконового прокладки вокруг Luers, чтобы предотвратить утечки воздуха.

7. Подготовка животных (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была изменена из Gage et al¹³. Мы завершили эту процедуру на взрослых самцах и самке мышей разного возраста и не отмечаем возрастных или половых предубеждений.

1. Усыпить животное пентобарбиталом натрия (150 мг/кг, внутрибрюшинно). Убедитесь, что животное мертво до начала вскрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эта процедура выполняется на усыпленных животных, эта процедура может быть выполнена на живых животных, чтобы использовать сердце для перекачки перфузатов по всему животному.
2. Сделайте два боковых разреза через брюшную стенку. Сделайте первый разрез ниже грудной клетки, а второй над бедрами. Разрезать вдоль средней линии от нижнего разреза к верхнему разрезу.
3. Используя тупые ножницы, аккуратно сделайте разрез в боковую сторону диафрагмы. Легкие должны разрушиться, как только диафрагма будет проколота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать прокола легких. Проколотое легкое с меньшей вероятностью будет раздуваться во время более поздних шагов.
4. Разрезать поперечно вдоль диафрагмы, чтобы открыть грудную полость.
5. Разрезать вдоль грудины от мечевидного отвара до яремной выемки и сбоку над грудной клеткой, чтобы полностью обнажить сердце и легкие. Зафиксируй по бокам грудной клетки.
6. Сделайте разрез средней линии в области шеи над трахеей. Удалите кожу, мышцы, щитовидную железу и соединительную ткань, окружающую трахею.
7. Используя изогнутые щипцы, сдвиньте два куска нити или шва под заднюю трахею. Используйте один кусок шва, чтобы удерживать адаптер Накачки Luer-stub на месте, а другой в конечном итоге для связывания трахеи в конце воздушной инфляции и сосудистой перфузии-фиксации.
8. Проделайте небольшое отверстие в трахее с помощью иглы 18G x 1" или пружинных ножниц Vannas.
9. Поместите адаптер 20G Luer-stub в это отверстие в трахее.
10. Завяжите одну нить вокруг трахеи непосредственно от того места, куда входит адаптер Luer-stub, чтобы удерживать ее на месте.
11. Перенесите животное в контейнер для обработки животных.
12. Прикрепите адаптер Luer-stub к самке Luer на внутренней стороне контейнера для обработки животных.

8. Надувание воздуха, перфузия и фиксация легких(рисунок 2)

1. Поместите иглу 25G x 5/8", прикрепленную к трубке перфузионного аппарата, в правый желудочек сердца.
2. Отрежьте брюшную аорту, чтобы позволить крови стекать из сердца и способствовать потоку перфусата через легкие.
3. Откройте запорный кран на внешней стороне контейнера для обработки животных, чтобы надуть легкие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться время, чтобы легкие полностью раздули. Следите за уровнем воды в шприце, он не должен быстро снижаться, если нет утечки в легких.
4. Надувают легкие при 25 смН₂О в течение 5 минут. Инфляция при 25 смН₂О предопределяет легкое и помогает в наборе ателектатических областей легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется добавить небольшое количество воды в шприц для поддержания высоты 25 см. Воспаление и / или экспериментально индуцированное повреждение легких могут влиять на инфляцию легких. В этом случае может потребоваться повышение инфляционного давления максимум до 35 смН₂О, чтобы оказать помощь в наборе ателектических областей.
5. В последнюю минуту надувания легких включите перистальтический насос со скоростью потока 10 мл/мин. Раствор гепарина должен течь из флакона через трубку в животное.
   1. Целью инфузии гепарина является предотвращение образования тромбов в сосудах. Соответственно, вливают гепарин до тех пор, пока легкие не станут белыми и не будут лишены крови. Если легкие не белеют, может потребоваться коррекция иглы правого желудочка.
6. После надувания в течение 5 минут выключите перистальтический насос и переключите перфузионную трубку с раствора гепарина на фиксатор.
7. Опустите шприц водяного столба до отметки «20 см» (шаг 1.3). Это нормально, когда пузырьки воздуха перемещаются в толщу воды, поскольку давление изменяется от 25 до 20 смH₂O.
   1. Проверьте уровень воды в шприце. Он должен быть на отметке «25 см». Возможно, потребуется добавить больше в это время.
8. Подождите 1 мин, чтобы дать легким сдуться от 25 до 20 смН₂О.
9. Перезапустите перфузионный насос со скоростью потока 6,5 мл/мин.
10. Сосудистую перфузию - фиксируют в течение 10 - 15 минут.

9. Экстракция легких(рисунок 3)

1. Плотно привяжите второй кусок нити вокруг трахеи дистальнее адаптера Luer-stub. Извлеките адаптер Luer-stub из трахеи.
2. Извлеките иглу из сердца.
3. Освободите легкие и сердце от грудной полости, разрезав соединительную ткань с задней стороны к средостечению тупыми ножницами. Позаботьтесь о том, чтобы избежать прокола легких.
4. Осторожно выньте сердце из легких.
5. Поместите легкие в фиксатор на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность фиксатора варьируется в зависимости от последующих гистологических исследований.
   1. Поместите легкие в коническую трубку 50 мл, содержащую 20-25 мл фиксатора. Поместите нить, закрепляющую трахею, через отверстие конической трубки и закрепите нитью колпачка. Переверните коническую трубку, чтобы убедиться, что плавучие, надутые воздухом легкие остаются полностью погруженными в фиксатор, иначе они будут плавать к вершине жидкости.
6. Обработка легких для гистологических исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В неповрежденной грудной клетке легкие удерживаются открытыми внешними силами, приложенными стенкой грудной клетки через плевральное пространство^6,14. При введении диафрагмы во время рассечения целостность плеврального пространства упраздняется и лег...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя обычно используются, методы фиксации на основе интратрахеи вытесняют лейкоциты из дыхательных путей и могут изменить нормальную архитектуру легких. Метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией, который предусмотрен в данном протоколе, преодолевает эти подводные ка...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container