In Vitro 3D клеточные модели артерий для изучения сосудистых препаратов, нацеленных на поток

Резюме

Здесь мы представляем новый протокол для изучения и отображения целевого осаждения носителей лекарств в эндотелиальные клетки в изготовленных, реальных, трехмерных моделях артерий человека в физиологическом потоке. Представленный способ может служить новой платформой для таргетирования носителей лекарственного средства в сосудистой системе.

Аннотация

Использование трехмерных (3D) моделей артерий человека, которые спроектированы с правильными размерами и анатомией, позволяет правильно моделировать различные важные процессы в сердечно-сосудистой системе. В последнее время, хотя было проведено несколько биологических исследований с использованием таких 3D-моделей артерий человека, они не были применены для изучения сосудистого таргетирования. В этой статье представлен новый метод изготовления реконструированных моделей артерий человека реального размера с использованием метода 3D-печати, их линии с эндотелиальными клетками человека (ЭК) и изучения нацеливания частиц в физиологическом потоке. Эти модели имеют преимущество в воспроизведении физиологических размеров и состояния кровеносных сосудов в организме человека с использованием недорогих компонентов. Этот метод может служить новой платформой для изучения и понимания нацеливания лекарств в сердечно-сосудистой системе и может улучшить дизайн новых инъекционных наномедицин. Кроме того, представленный подход может обеспечить значительные инструменты для изучения адресной доставки различных агентов при сердечно-сосудистых заболеваниях в специфических для пациента течении и физиологических условиях.

Введение

В последнее время было применено несколько подходов с использованием 3D-моделей артерий человека^1,2,3,4,5. Эти модели воспроизводят физиологическую анатомию и окружающую среду различных артерий в организме человека in vitro. Тем не менее, они в основном использовались в исследованиях клеточной биологии. Текущие исследования сосудистого нацеливания частиц на эндотелий включают в себя в silico вычислительное моделирование^6,7,8, in vitro микрофлюидные модели^9,10,11и in vivo животные модели^12. Несмотря на понимание, которое они предоставили, эти экспериментальные модели не смогли точно смоделировать процесс нацеливания, который происходит в артериях человека, где кровоток и гемодинамика являются доминирующими факторами. Например, изучение нацеливания частиц на атеросклеротические области в бифуркации сонной артерии, которые известны своей сложной схемой рециркуляционного потока и градиентом напряжения сдвига стенки, может повлиять на путешествие, предпринятое частицами до того, как они достигнут эндотелия^13,14,15,16. Поэтому эти исследования должны выполняться в условиях, которые воспроизводят физиологическую среду, то естьразмер, размер, анатомию и профиль потока.

Недавно эта исследовательская группа сфабриковала 3D-реконструированные модели артерий человека для изучения осаждения и нацеливания частиц на сосудистую^17. Модели были основаны на геометрических 3D-копиях кровеносных сосудов человека, которые затем культивировались с человеческими ЭК, которые впоследствии выстилали их внутренние стенки. Кроме того, при воздействии перфузионной системы, которая производит физиологический поток, модели точно воспроизводили физиологические условия. Перфузионная система была разработана для перфузии жидкостей с постоянной скоростью потока, используя перистальтический насос как в замкнутой, так и в открытой конфигурациях(рисунок 1). Система может быть использована в качестве замкнутого контура для отображения осаждения частиц и нацеливания на клетки, засеянные внутри модели сонной артерии. Кроме того, его можно использовать в качестве разомкнутого контура для вымывания неприлипших частиц в конце экспериментов, а также для очистки и обслуживания системы. В данной работе представлены протоколы изготовления 3D-моделей бифуркации сонной артерии человека, проектирования перфузионной системы и картирования осаждения целевых частиц внутри моделей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает изготовление 3D-модели сонной артерии и может быть применен для генерации любой другой интересующей артерии путем простого изменения геометрических параметров.

1. Проектирование и изготовление 3D-бифуркации модели сонной артерии человека

1. Выбирайте изображения пациентов или ранее изученные геометрии бифуркации сонной артерии человека, и создайте автоматизированную модель проектирования формы, которую необходимо напечатать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бифуркация сонной артерии имеет одно впускное и два выхода. Важно спроектировать рамку 3D-формы вокруг артерии и временные печатные опоры между рамой и артикулярной формой(рисунок 2A-C).
2. Печать геометрии с помощью 3D-принтера. Вырежьте временные печатные опоры и используйте наждачную пасту для полировки и сглаживания форм, особенно в тех областях, где были вырезаны опоры. Промыть отшлифованную модель изопропиловым спиртом, чтобы удалить пластичную пыль, и дать полностью высохнуть в химической вытяжке в течение 2-3 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь печатные формы были изготовлены из прозрачной смолы v4(рисунок 2D,E).
3. Чтобы легко растворить пластик, распылите формы прозрачным лаком внутрь химической вытяжки, и дайте высохнуть на воздухе в течение 1 ч. Повторите это 3x.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался 2X Ultra Cover Clear Spray, но любой другой вид должен подходить, если это не древесный лак. Убедитесь, что не осталось открытого пластика, потому что пластик может вреагировать с силиконом и помешать ему должным образом затвердеть. Качество напыляемой поверхности будет определять качество поверхности конечной силиконовой модели.
4. Вырежьте прозрачные прямоугольные слайды/полоски из гладкого пластика тех же размеров, что и рама пресс-формы, и приклейте их с помощью лака к раме со всех сторон и с одной стороны рамы, чтобы она была запечатана снизу и открыта сверху. Нанесите лак с помощью кисти внутрь химической вытяжки и дайте слайдам полностью высохнуть в течение не менее 24 ч(рисунок 2F).
5. Чтобы приготовить смесь силиконового каучука, добавьте жидкий силикон с его отверждателем (массовое соотношение 1:10) в пластиковую пластину и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить полное перемешивание. Для модели сонной артерии добавьте 54 г силикона и 6 г его отверждающего агента.
6. Охладите смесь в течение 15 мин при 4 °C, затем дегазуйте ее в вакуумном адсорбаторе до тех пор, пока все пузырьки воздуха не будут устранены. Поместите форму в адсорбатор (открытой стороной вверх), медленно вылейте силиконовую смесь в форму и снова удалите пузырьки воздуха, пока смесь не очистится.
7. Дайте форме постоять с силиконом на ночь при комнатной температуре (если возможно, оставьте ее в адсорбаторе без вакуума). Если смесь не полностью высохла, инкубируют ее при 60 °C еще на несколько часов.
8. Как только смесь полностью высохнет, удалите прозрачные слайды и погрузите модель в абсолютный ацетон на 48 ч в химическую вытяжку, пока пластик полностью не растворится. Удалите остатки пластика деревянной палочкой. Чтобы испарить ацетон, захваченный внутри модели, инкубируйте его при 60 °C в течение не менее 4 дней до посева клеток.

2. Культивирование клеток и посев в моделях

1. Подготовьте три разъема для модели сонной артерии: один для входного отверстия и два для розеток (см. Таблицу материалов). Стерилизуйте модель и разъемы ультрафиолетовым облучением в биологической вытяжке в течение 20 мин.
2. Покрывайте модели 4 мл 100 мкг/мл фибронектина (в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) в течение 2 ч при 37 °C или на ночь при 4 °C. Вводят раствор фибронектина в модель через вход с помощью пластикового шприца объемом 5 или 10 мл. Удалите фибронектин через розетку и промыть модель эк-средой.
3. Суспендировать 2,5 ×^{10 6} клеток/мл эндотелиальных клеток пуповинной вены человека (HUVECs, пассаж < 6) и заполнить модель 4 мл клеточной суспензии с помощью пластикового шприца объемом 5 или 10 мл(рисунок 3A). Поместите модель на ротатор внутри инкубатора (37 °C) со скоростью 1 об/мин в течение 48 ч для обеспечения однородного посева. Убедитесь, что модель хорошо прикреплена к ротатору(рисунок 3B). Измените среду через 24 ч внутри биологической вытяжки и вернитесь к ротатору внутри инкубатора еще на 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через 24 ч клетки засеваются и могут быть визуаграфированы с помощью микроскопа.
4. Снимите модель с ротатора и мойте 1x PBS с помощью пластикового шприца объемом 10 мл. Чтобы зафиксировать клетки, инкубируйте клетки с 4 мл 4% параформальдегида (PFA) на модель в течение 15 минут внутри химической вытяжки, а затем промыть 3x PBS. Добавьте 4 мл PBS и храните при 4 °C до эксперимента(рисунок 3C). Окрашивание клеток внутри модели с использованием стандартных протоколов окрашивания(например, ядерное окрашивание 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), рисунок 3D).

3. Проектирование перфузионной системы

1. Перфузионный аппарат имеет два входа и две выпускные трубки. Объедините два входа в одну идентификационную трубку диаметром 4 мм и снова в две 6-миллиметровые идентификационные трубки, которые соединяются с перистальтическим насосом. Объедините две 6-мм идентификационные трубки, выходящие из перистальтического насоса, в одну 4-миллиметровую трубку и подключите ее к заслонке колебаний, чтобы устранить любые колебания насоса. Используйте бутылку с узким горлом объемом 250 мл с трехстворячной крышкой в качестве заслонки.
2. Подключите одно отверстие к входу из насоса, закройте второе пробкой, которая используется для сброса давления в чрезвычайных ситуациях, и протяните третье отверстие (которое является выпускным отверстием) до дна бутылки.
3. Подключите амортизатор к входу модели культивируемой сонной артерии с помощью выпускной трубки. Объедините два выхода модели в одну трубку, которая будет выходом системы (все трубки имеют идентификатор 4 мм).
4. Разделите выпускную трубку на две выпускные трубки (одна для замкнутого контура, а другая для контейнера для отходов в открытом контуре). Прикрепите пластиковый зажим к каждой трубке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинация открытых/закрытых зажимов определяет, находится ли система в конфигурации замкнутого или разомкнутого контура. Как показано на рисунке 1,если зажимы a и d близки, а b и c открыты, система представляет собой замкнутый контур; обратный ход приводит систему к конфигурации с открытой цепью.
5. Подготовьте три контейнера: один, который может вместить жидкость 300 мл (для замкнутого контура) и два других по 1 л каждый: один для промывки, а другой для отходов (для открытого контура).

4. Конфигурация замкнутого контура: перфузионный эксперимент и визуализация

1. Добавьте 300 мл PBS в контейнер замкнутого контура, что достаточно для заполнения всей системы, включая трубки и модель. Поместите одну впускную трубку и одну выходную трубку (открытые зажимы b и c) внутрь контейнера.
2. Наполните емкость для промывки объемом 1 л дистиллированной водой (для стирки в конце эксперимента), а остальные 1 л контейнера для отходов оставьте пустым. Поместите другую впускную и выпускную трубки (закрытые зажимы a и d) в емкости для мойки и отходов соответственно.
3. Возьмите модель с фиксированной клеточной культивируемой сонной артерией из хранилища с 4 °C и очистите PBS. Соедините вход и выходы сонной артерии, как описано в шагах 3.3-3.4. Не оставляйте модель сухой в течение длительного времени. После подключения модели активируйте насос для прокачки жидкости.
4. Поместите модель сонной артерии под микроскоп. Откройте трубку до входа и после выхода со сонной модели. Установите перистальтический насос на 10 об/мин и включите его. Увеличивайте скорость с шагом 5 об/мин, каждые 4-5 мин. Убедитесь, что нет утечек.
5. При 100 об/мин, что равно максимальному расходу физиологической формы волны сонной артерии человека (~400 мл/мин), добавляют флуоресцентные частицы карбоксилированного полистирола (PS) (2 мкм, при концентрации 1,6 мкг/мл) к 300 мл PBS в контейнере замкнутого контура. Изобращайте интересуемую область каждые 10 с в течение 1,5 ч (при необходимости по-прежнему одиночные изображения или видео).

5. Конфигурация с открытым контуром: шаг промывки

1. Откройте зажимы моечных и отработанных труб в контейнерах объемом 1 л (зажимы a и d) и немедленно закройте зажимы как впускных, так и выпускных труб в контейнере объемом 300 мл (зажимы b и c), чтобы изменить конфигурацию системы с замкнутой на открытую конфигурацию.
2. Пусть большая часть воды течет из моечного контейнера в контейнер для отходов со скоростью 100 оборотов в минуту. Прежде чем он будет полностью перенесен, нажмите стоп на перистальтическом насосе и закройте зажимы трубки до входного отверстия и после выхода сонной модели.
3. Используя соответствующие фильтры, захватывайте изображения модели в интересуемой области, чтобы показать осаждение и адгезию частиц к клеткам. Отсоедините модель сонной артерии. Осторожно и медленно добавьте 4 мл PBS со шприцем 10 мл через вход модели.
4. Подключите «фиктивную модель» (которая также является силиконовой резиновой 3D-моделью сонной артерии, используемой только для стирки, без культивируемых клеток) вместо модели сонной артерии и промойте систему. Добавьте еще 1 л воды и снова вымойте систему, пока вся вода не будет перенесена из емкости для мойки в отходы. Выключите перистальтический насос.

6. Сбор и анализ данных

1. Получите цифровой фильм осаждения частиц в интересующей области с изображениями, сделанными во время эксперимента, используя настраиваемый программный код (см. Таблицу материалов).
2. Для отображения осаждения частиц вдоль модели нанесите несколько изображений на плитку, чтобы покрыть исследуемую область, представляющий интерес(рисунок 4A,B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки количества прилипших частиц на интересуемом участке может быть написан индивидуальный программный код (образец файла был предоставлен в качестве дополнительной информации)17.

Результаты

В этой статье представлен новый протокол для отображения осаждения частиц внутри реальных 3D-моделей артерий человека, который может обеспечить новую платформу для исследований доставки лекарств. С помощью техники 3D-печати была изготовлена модель сонная бифуркационная артерия челове...

Обсуждение

Современные подходы к изучению сосудистого нацеливания частиц не воспроизводят физиологические условия, присутствующие в организме человека. Здесь представлен протокол для изготовления 3D-реконструированных моделей артерий человека для изучения нацеливания частиц на ЭК, выстилающи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID