Генерация и культивация лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослой мыши

Резюме

В протоколе представлен метод культивирования и обработки лингвальных органоидов, полученных из вкусовых стволовых клеток, выделенных из заднего вкусового сосочка взрослых мышей.

Аннотация

Чувство вкуса опосредовано вкусовыми рецепторами на языке, которые состоят из быстро обновляющихся вкусовых рецепторных клеток (TTC). Этот непрерывный оборот питается местными клетками-прародителем и делает вкусовую функцию склонной к нарушению множеством медицинских процедур, что, в свою очередь, серьезно влияет на качество жизни. Таким образом, изучение этого процесса в контексте медикаментозного лечения имеет жизненно важное значение для понимания того, влияют ли и как влияют функции прародителя вкуса и производство КИП. Учитывая этические проблемы и ограниченную доступность человеческой вкусовой ткани, обычно используются мышиные модели, которые имеют вкусовую систему, похожую на человеческую. По сравнению с методами in vivo, которые являются трудоемкими, дорогостоящими и не поддаются исследованиям с высокой пропускной способностью, мышиные лингвальные органоиды могут позволить быстро проводить эксперименты со многими репликами и меньшим количеством мышей. Здесь были адаптированы ранее опубликованные протоколы и представлен стандартизированный метод генерации вкусовых органоидов из клеток-прародителя вкуса, выделенных из циркумваллятного сосочки (CVP) взрослых мышей. Вкусовые клетки-прародителя в CVP экспрессируют LGR5 и могут быть выделены с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки EGFP (FACS) у мышей, несущих аллель Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2.} Отсортированные клетки накладываются на систему 3D-культур на основе матричного геля и культивируются в течение 12 дней. Органоиды расширяются в течение первых 6 дней периода культивирования путем пролиферации, а затем вступают в фазу дифференцировки, в течение которой они генерируют все три типа вкусовых клеток вместе с невкусными эпителиальными клетками. Органоиды могут быть извлечены после созревания на 12-й день или в любое время в процессе роста для экспрессии РНК и иммуногистохимического анализа. Стандартизация методов культивирования для производства лингвальных органоидов из взрослых стволовых клеток улучшит воспроизводимость и продвинет лингвальные органоиды в качестве мощного инструмента скрининга лекарств в борьбе, чтобы помочь пациентам, испытывающим вкусовую дисфункцию.

Введение

У грызунов лингвальные вкусовые рецепторы размещены в грибовидных сосочках, распределенных спереди, двусторонних листовых сосочков спереди, а также в один циркумваллятный сосочек (CVP) на заднеродоральной средней линии языка^1. Каждая вкусовая рецепторная клетка состоит из 50-100 короткоживущих, быстро обновляющихся вкусовых рецепторных клеток (TTC), которые включают глиально-подобные поддерживающие клетки типа I, клетки типа II, которые обнаруживают сладкие, горькие и умами, и клетки типа III, которые обнаруживают кислые^2,3,4. В CVP мышиные^{стволовые} клетки LGR5 + вдоль базальной пластинки продуцируют все типы TRC, а также невкусные эпителиальные клетки^5. При обновлении вкусовой линии дочерние клетки LGR5 сначала указываются как постмитотические вкусовые клетки-предшественники (клетки IV типа), которые входят в вкусовую рецептор и способны дифференцироваться в любой из трех типов TRC^6. Быстрый оборот TLC делает вкусовую систему восприимчивой к нарушениям в результате медицинских процедур, включая лучевую и некоторые лекарственные^{препараты 7,8,9,10,11,12,13.} Таким образом, изучение вкусовой системы в контексте регуляции вкусовых стволовых клеток и дифференцировки TRC имеет жизненно важное значение для понимания того, как смягчить или предотвратить вкусовую дисфункцию.

Мыши являются традиционной моделью для исследований in vivo в науке о вкусе, поскольку у них есть вкусовая система, организованная аналогично людям^14,15,16. Тем не менее, мыши не идеальны для исследований с высокой пропускной способностью, так как они дороги в обслуживании и отнимают много времени для работы. Чтобы преодолеть это, в последние годы были разработаны методы культурирования органоидов in vitro. Вкусовые органоиды могут быть получены из нативной ткани CVP, процесса, в котором органоиды отталкиваются от изолированного эпителия CVP мыши, культивируемого ex vivo^17. Эти органоиды демонстрируют многослойный эпителий, соответствующий вкусовой системе in vivo. Более эффективный способ генерации органоидов, не требующий культуры ex vivo CVP, был разработан Ren etal. в 2014 году¹⁸. Адаптируя методы и культуральные среды, впервые разработанные для выращивания кишечных органоидов, они выделили одиночные lgr5-GFP⁺ клетки-прародителя из cvP мыши и покрыли их матричным^{гелем 19.} Эти одиночные клетки генерируют лингвальные органоиды, которые размножаются в течение первых 6 дней культуры, начинают дифференцироваться примерно на 8-й день, а к концу периода культивации содержат невкусные эпителиальные клетки и все три типа TRC^18,20. На сегодняшний день опубликовано несколько исследований с использованием лингвальной органоидной модельной системы^{17,18,20,21,22;} однако методы и условия культивирования, используемые для получения этих органоидов, варьируются в зависимости от публикации(Дополнительная таблица 1). Таким образом, эти методы были скорректированы и оптимизированы здесь, чтобы представить подробный стандартизированный протокол для культуры лингвальных органоидов, полученных из LGR5⁺ прародителей CVP взрослой мыши.

Лингвальные органоиды обеспечивают уникальную модель для изучения клеточных биологических процессов, стимулирующих развитие и обновление вкусовых клеток. Поскольку применение лингвальных органоидов расширяется, и все больше лабораторий движутся к использованию моделей органоидов in vitro, важно, чтобы область стремилась разработать и принять стандартизированные протоколы для улучшения воспроизводимости. Создание лингвальных органоидов в качестве стандартного инструмента в науке о вкусе позволит проводить исследования с высокой пропускной способностью, которые разбирают, как отдельные стволовые клетки генерируют дифференцированные клетки взрослой вкусовой системы. Кроме того, лингвальные органоиды могут быть использованы для быстрого скрининга лекарств на потенциальное воздействие на вкусовой гомеостаз, который затем может быть более тщательно исследован на животных моделях. Этот подход в конечном итоге активирует усилия по разработке методов лечения, которые улучшают качество жизни будущих получателей лекарств.

протокол

Все процедуры для животных были выполнены в аккредитованном AAALAC учреждении в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, Законом о благополучии животных и Политикой службы общественного здравоохранения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском кампусе Университета Колорадо Аншутц. Мыши Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2,} используемые в этом протоколе, из Лаборатории Джексона, сток No 008875.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы следует выполнить следующие шаги, чтобы обеспечить плавное и своевременное продвижение протокола: установить водяную баню на 37 °C, установить центрифугу на 4 °C, сделать инъекции и диссоциационные ферментные растворы из 10 мг / мл растворов диспазы, коллагеназы и эластазы (см. Таблицу материалов),удалить матричный гель из морозильной камеры -20 ° C (~ 750 мкл, необходимых для 48-луночного листа) и оттаять, погружая флакон в лед для at не менее 3-4 ч, предварительно покрывая микроцентрифугные трубки в неразбавленном FBS путем мягкого раскачивания при комнатной температуре в течение не менее 30 мин (две трубки 2 мл для сбора тканей, две трубки 1,5 мл для диссоциированных клеток и одна трубка 1,5 мл для сбора одиночных клеток из клеточного сортировщика; удалите избыток FBS перед использованием).

1. Выделение эпителия CVP

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество ячеек LGR5⁺ для полной 48-скважинной пластины, соберите три LGR5-EGFP CVP в одну трубу и обрабатывайте одновременно. Важно отметить, что заготавливайте и обрабатывайте CVP по меньшей мере одного дикого типа littermate параллельно в отдельной трубе и используйте его в качестве элемента управления решеткой для установки параметров FACS (см. Репрезентативные результаты).

1. Усыпляйте мышей с удушьем_CO2 в соответствии с правилами IACUC, с последующим одобренным вторичным методом, таким как двусторонняя торакотомия, вывих шейки матки, обезглавливание или экссангинация.
2. Используйте большие стерильные ножницы для рассечения, чтобы разрезать щеки и сломать челюсть. Поднимите язык и отрежьте язычную уздечку, чтобы отделить язык от дна ротовой полости. Вырежьте язык и соберите его в стерильный ледяной фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (dPBS) с Ca²⁺ и Mg^2+.
3. Удалите и отбросьте передний язык, разрезав только переднюю часть межмолярной возместия лезвием бритвы(рисунок 1А,пунктирная линия). Используйте деликатную салфетку для удаления волос и лишней жидкости с заднего языка.
4. Заполните шприц 1 мл 200-300 мкл инъекционного ферментного раствора (конечная концентрация: 2 мг/мл коллагеназы I типа и 5 мг/мл диспазы II в Ca²⁺/Mg^{2+-содержащих}dPBS, разбавленных из стоковых растворов 10 мг/мл) и вставьте иглу 30 G x 1/2 чуть выше межмолярного возвышения(рисунок 1B,черная стрелка)до переднего ряда CVP(рисунок 1B, черный ящик). Вводят раствор фермента под и по боковым краям CVP между эпителием и подлежащими тканями (lamina propria, мышцы). Медленно и непрерывно вынимайте шприц из языка во время инъекции.
5. Инкубируют язык в стерильном Ca²⁺/ Mg²⁺-свободном dPBS при комнатной температуре в течение ровно 33 мин.
6. Сделайте небольшие надрезы в эпителии двусторонне и просто перед CVP, используя дополнительные тонкие ножницы для рассечения, и аккуратно очистите эпителий, подняв его тонкими щипцами. Как только траншейный эпителий освободится от подлежащей соединительной ткани, поместите его в пустую микроцентрифужную трубку 2 мл, предварительно покрытую FBS. Делают эпителиальную обрезку до или после отсоединения эпителия CVP(рисунок 1C,D).

2. Диссоциация эпителия CVP

ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация эпителия CVP и покрытие графически представлены на рисунке 2.

1. Добавьте коктейль ферментов диссоциации (конечная концентрация: 2 мг/мл коллагеназы типа I, 2 мг/мл эластазы и 5 мг/мл диспазы II в Ca^{2+/Mg2+-содержащих}dPBS, разбавленные из стоковых растворов 10 мг/мл) в пробирки, содержащие очищенный эпителий CVP (200 мкл на CVP). Инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 45 мин. Вихрь ненадолго каждые 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: До новотепления 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане при 37 °C в течение последних 15 минут инкубации ферментного коктейля.
2. После инкубации вихрь (три импульса) затем тритурируют стеклянной пипеткой Пастера в течение 1 мин. После того, как кусочки ткани оседают, пипетку супернатанта, содержащего первую коллекцию диссоциированных клеток, в новые микроцентрифужные трубки с покрытием FBS 1,5 мл, соответствующие генотипу. Обработайте оставшиеся кусочки ткани дополнительно, как описано на этапе 2.3. ниже.
   1. Раскрутите супернатант в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до гранулированных клеток.
   2. Удалите полученный супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в буфере флуоресцентной активации сортировки клеток (FACS) (1 мМ ЭДТА, 25 мМ HEPES (рН 7,0) и 1% FBS в Ca²⁺/ Mg²⁺-свободный PBS (50 мкл на CVP)). Хранить на льду.
3. При выполнении этапов 2.2.1 и 2.2.2 диссоциируют оставшиеся кусочки ткани со ступени 2.2 путем добавления предварительно нагретого 0,25% трипсина-ЭДТА (200 мкл на CVP) к исходным микроцентрифужным трубкам 2 мл и инкубируют на водяной бане с 37 °C в течение 30 мин. Вихрь ненадолго каждые 10 мин.
4. После инкубации вихрь трубки, содержащей кусочки ткани (три импульса), затем тритурируют стеклянной пипеткой Пастера в течение 1 мин. После того, как кусочки ткани осядет, пипетка супернатанта в микроцентрифужные трубки 1,5 мл, содержащие клетки из этапа 2.2.2. Выбросьте трубки, содержащие оставшиеся кусочки ткани.
   1. Раскрутите трубки с диссоциированными клетками в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до гранулированных клеток.
   2. Удалите супернатант и повторно суспендированные гранулы клеток в буфере FACS (100 мкл на CVP). Хранить на льду.
5. Пропустите ячейки через 30-мкм нейлоновый сетчатый фильтр и добавьте DAPI_{(λ излучение} = 450 нм) в смеси ячеек перед FACS. Изолируют Lgr5-GFP+ клетки через FACS с помощью зеленого флуоресцентного белкового канала (λ_{возбуждение} = 488 нм; λ _{излучение} = 530 нм). Отсортируйте ячейки с помощью 100-мкм-сопла в свежую микроцентрифужную трубку с покрытием FBS объемом 1,5 мл, содержащую 300 мкл свободного dPBS Ca^{2 +}/ Mg^{2 +.} Поместите ячейки на лед до нанесения покрытия.

3. Покрытие ячеек Lgr5-EGFP

1. Определите объем^LGR5+ клеточной суспензии, полученной от протоочного цитометра.
2. Исходя из количества ячеек, полученных от сортировщика, рассчитайте количество ячеек на мкл. Затем определите объем, необходимый для получения желаемого количества ячеек для покрытия (мы используем 200 ячеек на скважину 48-скважинной пластины) и перенесите этот общий объем взвешенных клеток в новую микроцентрифужную трубку.
3. Вращайте трубку в течение 5 мин при 370 х г и 4 °C до грануляционных ячеек (гранулы могут быть не видны). Удалите супернатант и поместите трубку на лед.
4. Осторожно повторно суспендируют ячейку гранулы в соответствующем количестве матричного геля (15 мкл на скважину на 48-ю пластины); пипетку вверх и вниз аккуратно распределить клетками в матричном геле. Поместите 15 мкл матричного геля/клеточной смеси в центр каждой скважины. Держите трубку микроцентрифуги на льду в конической трубке 50 мл во время покрытия, чтобы предотвратить гелеобразование матричного геля. Продолжайте смешивать матричную смесь геля и ячеек на протяжении всего покрытия путем пипетки вверх и вниз каждые три скважины, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по скважинам.
5. Поместите пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO_{2, ~95%}влажности) на 10 мин, чтобы обеспечить гелеобразие матричного геля. Затем добавляют 300 мкл среды WENRAS + Y27632 комнатной температуры в каждую скважину и возвращают пластину в инкубатор.

4. Органоидное поддержание

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды выращивают в обычных органоидных средах (WENR), содержащих рекомбинантные EGF и 50% кондиционированные среды, содержащие Wnt3a, Noggin и R-спондин^23. Препараты A8301 и SB202190 добавляют в течение первых 6 дней периода культивации для оптимизации роста (среда WENRAS)(рисунок 5),затем удаляют для содействия дифференциации (weNR media)^20. Y27632 добавляется в течение первых 2 дней культуры, чтобы способствовать выживанию. Условия среды относительно временной шкалы культуры представлены на рисунке 4.

1. Через два дня после нанесения покрытия удалите жи WENRAS + Y27632 из каждой скважины с помощью пипетки 1 мл, обеспечивая отсутствие перекрестного загрязнения. Добавьте 300 мкл среды WENRAS вниз по боковой стороне скважины, чтобы не нарушить матричный гель. Верните тарелку в инкубатор.
2. Меняйте носитель каждые 2 дня, используя соответствующие носители для стадии культуры(рисунок 4). Поддерживайте органоиды до 12-го дня, когда органоиды будут готовы к сбору.

5. Обработка РНК

1. Извлечение органоидов для РНК
   1. Поместите 48-скважинную пластину на лед на 30 мин для деполимеризации матричного геля.
   2. Используя пипетку 1 мл, подтяните органоидную жиму; затем, когда среда возвращается в колодец, используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать и еще больше разбить матричный гель. Перенесите содержимое в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, объединив содержимое трех скважин в одну трубу. Центрифугировать пробирки в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
   3. Удалить как можно больше супернатанта среды без удаления каких-либо органоидов; затем снова открутите трубки в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
   4. Удалить оставшуюся мудрую музию и повторно суспендировали органоиды в буфере лизиса 350 мкл + β-меркаптоэтанола (βME) (10 мкл βME на 1 мл лизисного буфера). Поместите образцы на лед для немедленного извлечения РНК или храните при -80 °C.
2. Количественный анализ ОТ-ПЦР
   1. Измерьте количество РНК с помощью спектрофотометра. Реверс-транскрибировать РНК с помощью набора синтеза кДНК.
   2. Смешайте кДНК, эквивалентную 5 нг РНК, с предварительно проверенными 200 нМ прямой и обратной праймерами(таблица 1)и флуоресцентной ПЦР Master Mix. Запустите реакцию qRT-PCR в течение 40 циклов при: 95 °C в течение 15 с, затем 60 °C в течение 60 с.

6. Иммуногистохимия

1. Извлечение и фиксация органоидов
   1. Поместите 48-щетинную пластину на лед на 30 мин, чтобы ослабить матричный гель.
   2. Удалите органоидную мудрую муля и добавьте 400 мкл ледяного PBS в каждую скважину. Затем удалите PBS и добавьте 400 мкл ледяного раствора для восстановления клеток в каждую скважину. Качать осторожно при 4 °C в течение 30 мин.
   3. Покрыть наконечник пипетки объемом 1 мл 1% BSA в PBS и аккуратно пипетировать содержимое скважины вверх и вниз, чтобы разбить матричный гель. Перенесите органоиды в микроцентрифужную трубку размером 1,5 мл, помещенную на лед.
   4. Промыть каждую скважину 300 мкл PBS + 1% BSA и перенести все оставшиеся органоиды в соответствующие трубки. Удалите раствор для восстановления клеток / PBS + BSA из каждой трубки. Добавьте 400 мкл ледяного PBS, затем повторите с другим ледяным ОПОЛАСКИВАТЕЛЬ PBS.
   5. Удалить PBS и зафиксировать органоиды с 300 мкл ледяного 4% PFA (в 0,1 М PB) в течение 20 мин, инкубируя при комнатной температуре. Удалите PFA и промойте органоиды с 400 мкл ледяного PBS.
   6. Удалить PBS; затем добавьте 400 мкл PBS + 1% BSA. Хранить при 4 °C.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Промыть органоиды в 500 мкл PBS + 1% BSA. Затем инкубируют органоиды в блокирующем растворе (5% нормальная козья или ослиная сыворотка, 1% бычий сывороточный альбумин, 0,3% Тритон Х 100 в 1x PBS pH 7,3) в течение 2 ч, мягко раскачиваясь при комнатной температуре.
   2. Добавляют раствор первичного антитела (первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе) и осторожно качают в течение 3 ночей при 4 °C.
   3. Органоиды промыть 4x в течение 1 ч с 500 мкл PBS + 0,2% тритона, мягко раскачивая при комнатной температуре. Добавляют раствор вторичных антител (вторичные антитела, разведенные в блокирующем растворе) и органоиды горных пород на ночь, защищенные от света, при 4 °C.
   4. Органоиды промыть 3х в течение 1 ч с 500 мкл PBS + 0,2% тритона, защищенные от света и мягко раскачивающиеся при комнатной температуре. Инкубировать с DAPI разбавляют 1:10 000 в 0,1 М ПБ в течение 20 мин, раскачивая и накрывая комнатной температурой.
   5. Органоиды промыть 3x в течение 20 мин с 0,1 М ПБ, осторожно раскачивая и накрывая комнатной температурой.
3. Скользящее крепление органоидов для инвертированной конфокальной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговые изображения процесса монтажа слайдов показаны на рисунке 7.
   1. Создайте ~1 мм толщиной 22 x 22 мм квадратного периметра нетоксичного моделя из глины на слайде микроскопа.
   2. Извлеките 0,1 М ПБ из микроцентрифужной трубки и осторожно повторно суспендируйте органоиды в монтажной среде 100 мкл по выбору; затем перенесите в центр глиняного квадрата.
   3. Заполните глиняный квадрат до тех пор, пока монтажная среда не будет почти доверху. Затем поместите квадратную крышку 22 x 22 мм поверх глины и плотно прижмите по бокам крышки, чтобы запечатать. Дайте отверждаться согласно инструкции производителя (здесь комнатная температура в течение 1-2 дней) и хранить при 4 °C.

Результаты

Мыши имеют один CVP, расположенный с задней стороны на языке, из которого можно выделить LGR5+ стволовые клетки(Рисунок 1А,черный ящик). Инъекция раствора фермента под и вокруг CVP(Рисунок 1B)приводит к незначительному отеку эпителия и переварива...

Обсуждение

Здесь представлен эффективный и легко воспроизводимый метод культивирования, поддержания и обработки лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослых мышей. Было установлено, что использование трех CSP от 8 до 20-недельных мышей Lgr5-EGFP достаточно для получения ~1...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm