Количественная оценка видов реактивного кислорода в нейтрофилах, инфицированных менингитом Escherichia Coli в реальном времени

Резюме

Escherichia coli является основной причиной неонатального грамотрицательных бактериального менингита. Во время бактериальной инфекции, реактивные виды кислорода, производимые нейтрофилов играют важную бактерицидную роль. Здесь мы представляем метод обнаружения реактивных видов кислорода в нейтрофилов в ответ на менингит E. coli.

Аннотация

Escherichia coli (E. coli) является наиболее распространенными грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение бактериемии и проникновение бактерий через геммозеозный барьер являются незаменимыми шагами для развития менингита кишечной палочки. Реактивные виды кислорода (ROS) представляют собой основные бактерицидные механизмы нейтрофилов для уничтожения вторгшихся патогенов. В этом протоколе, зависит от времени внутриклеточного производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с помощью флуоресцентных зондов ROS обнаружены в режиме реального времени флуоресценции микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.

Введение

Неонатальный бактериальный менингит является распространенным детским инфекционным заболеванием. Escherichia coli (E. coli) с капсулой K1 является наиболее распространенным грам-отрицательным патогеном, вызывающим неонатальный бактериальный менингит, на который приходится около 80% от общей^{заболеваемости 1,2,3}. Несмотря на достижения в области антимикробной химиотерапии и поддерживающей помощи, бактериальный менингит по-прежнему является одним из самых разрушительных состояний с высокой заболеваемостью и^{смертностью 4}.

Возникновение неонатального бактериального менингита обычно начинается с бактериемии, вызванной входом патогенных бактерий в периферическую циркуляцию от местных поражений новорожденных, а затем проникновение через геммозео-мозговой барьер (BBB) в мозг, в результате чего воспаление опоясывания⁴. Начало бактериемии зависит от взаимодействия между бактериями и иммунными клетками хозяина, включая нейтрофилы и макрофаги и т.д. Нейтрофилов, на которые приходится 50-70% белых кровяных телец, являются первой линией защиты от^{бактериальных инфекций 5,6.} Во время вторжения бактерий, активированные нейтрофилов набираются в инфекционные сайты и высвобождают реактивные виды кислорода (ROS), включая супероксидный анион, перекись водорода, гидроксиловы радикалы и синглетный^{кислород 7}. ROS проходят редокс реакции с клеточной мембраны, молекулы нуклеиновой кислоты и белки бактерий, в результате чего травмы и смерти вторжения^{бактерий 8}. Митохондрии является основным местом производства ROS в эукариотических клетках, и различные оксидазы (например, никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы комплекс, липоксигеназа системы, белка киназы C и циклоксигеназы системы) посредником производства ROS^9,10. Измерение в режиме реального времени производства ROS, представляющего первичный противомикробный механизм в нейтрофилах, является полезным методом для изучения защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.

В этом протоколе, зависит от времени производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с флуоресцентным зондом ROS DHE, обнаруженный в режиме реального времени флуоресцентной микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в других клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.

протокол

Периферическая кровь добровольцев, применяемых в этом исследовании, была одобрена Институциональным советом по обзору первой больницы Китайского медицинского университета (#2020-2020-237-2).

1. Подготовка реагентов и среды культуры

1. Подготовь буфер лиза красных кровяных телец, добавив 8,29 г NH₄Cl, 1 г KHCO₃, 37,2 мг Na₂EDTA в 1 л двойной дистиллированной воды и настроить рН до 7,2-7,4. Удалите бактерии путем фильтрации с помощью фильтров 0,22 мкм.
2. Подготовьте экспериментальную культурную среду для нейтрофилов, добавив 5% сыворотки крупного рогатого скота в rpMI 1640 средней и хранить при 4 градусах Цельсия. Equilibrate к комнатной температуре перед пользой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте RPMI 1640 среды без фенола красный.
3. Приготовьте солевой фосфатный буфер (PBS), добавив 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO_{4 2H2}O и 0,2 г KH₂PO_{4 в 1} л двойной дистиллированной воды в стеклянной колбе 1 л. Отрегулируйте рН до 7,2-7,4. Автоклав его в течение 15 мин при 121 градусе по Цельсию.
4. Приготовьте раствор рифампицина, растворив 0,5 г порошка рифампицина в 10 мл диметилового сульфоксида (DMSO), чтобы дать раствор 50 мг/мл рифампицина.
5. Приготовьте раствор LB agar, добавив 10 г NaCl, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 15 г агар-порошка в 1 л двойной дистиллированной воды и автоклав смеси. Заполните чашки Петри до половины объема, наливая теплый раствор LB-агара, содержащий 100 мкг/мл рифампицина. Храните охлаждено твердую пластину при 4 градусах Цельсия.
6. Подготовка мозга настой сердца (BHI) бульон подходит для бактериальных штаммов путем растворения 37 г порошка BHI в 1 л двойной дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 7,2 и отрегулируйте его.
7. Растворите флуоресцентный зонд дигидроэтидий (DHE) в растворителя DMSO, чтобы дать 10 мМ запасов раствора. Аккуратно перемешайте перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquot фондового решения сразу же в светоуязаемые флаконы. Срок годности запасного раствора составляет 6 месяцев при -20 градусов по Цельсию.

2. Подготовка штамма бактерий Е44

ПРИМЕЧАНИЕ: E44 является мутант штаммом менингитной кишечной палочки с устойчивостью к рифампицину.

1. Опустите криоконсервированную колонию E44 с помощью стерильного наконечника пипетки, прививите нагрузку E44 на пластину Агара LB, содержащую 100 мкг/мл рифампицина, рисуя линии. Положите пластину вверх дном в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию на ночь.
2. За день до эксперимента выберите одну колонию E44 из пластины со стерильным кончиком пипетки и положите ее в 5 мл бульона BHI, содержащего 100 мкг/мл рифампицина в колбе 50 мл. Инкубировать бактериальную культуру при 37 градусов по Цельсию при 90 об/мин при 17 ч в инкубационный шейкер.

3. Изоляция нейтрофилов от периферической крови человека

1. Нарисуйте 5 мл образца крови у добровольцев внутривенно в вакуумную трубку для сбора крови, содержащую ЭДТА для антикоагуляции.
2. Центрифуга периферических образцов крови на 500 х г в течение 5 мин. Образцы крови делятся на три слоя центрифугации, которые снизу вверх являются слой красных кровяных телец (РБК), белые кровяные клетки (WBC) слой и плазменный слой, последовательно.
3. Аспирировать слой белых кровяных телец с пипетки к новой трубке с 3x РБК лиза буфера. Смешайте смесь тщательно и поместите при комнатной температуре в течение 5 минут.
4. Центрифуга трубки на 500 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью и отказаться.
   1. Повторите процедурулиза с буфером лиза РБК 1-2 раза, пока осадок не побелеет.
5. Вымойте клетки путем повторного перерасхода осадка с 2 мл PBS. Затем центрифуга на 300 х г в течение 5 минут, чтобы клетки оседают на дно трубки.
6. Этикетка нейтрофилов с CD16 микробусов путем повторного перерасхода осадка с 50 йл предварительно перенапись магнитных клеток сортировки буфера. Затем смешайте с 50 МКЛ человеческих микробусов CD16 тщательно. Инкубировать смесь при 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решения должны быть предварительно охлаждены, чтобы предотвратить ограничение антител на поверхности клетки и неспецифической маркировки. Большинство взрослых имеют от 4000 до 10000 белых кровяных телец на микролитер крови, среди которых, нейтрофилов приходится примерно 50-70%. По оценкам, количество белых кровяных телец в 5 мл периферической крови человека, как правило, до 2-5 х 10⁷.
7. Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера сортировки магнитных клеток и центрифуги при 4 градусов по Цельсию, 300 х г в течение 10 мин. Отбросьте супернатант полностью и resuspend осадок с 500 qL буфера сортировки.
8. Соберите магнитную колонку и разделив полку. Перемести сепаратор на полку с помощью магнитной колонки и промыть столбец 3 мл буфера сортировки.
9. Бросьте подвеску клетки в колонку, чтобы нейтрофилов, помеченных магнитными бусинами, прикреплялись к магнитной колонке.
10. Смойте не помеченные ячейки, добавив 3 мл буфера сортировки магнитных клеток 3 раза, убедившись, что резервуар столбца пуст каждый раз.
11. Снимите столбец с магнитного сепаратора и положите его на трубку 15 мл. Добавьте 5 мл буфера сортировки магнитных ячеев в столбец. Выталкивайте магнитные помеченные клетки с помощью поршеня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы улучшить чистоту нейтрофилов, шаги сортировки могут быть повторены с помощью новой колонки.
12. Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант полностью и повторно осадок с 1 мл среды культуры. Определите номер ячейки с помощью счетчика клеток и подготовь клетки к дальнейшим экспериментам.

4. Измерение ROS

1. Центрифуга изолированных нейтрофилов на 300 х г в течение 5 мин, повторного осаждения, и настроить концентрацию клеток до 2 х 10⁶/ мл с культурой среды, содержащей 5 МКМ DHE флуоресценции зонда.
2. Инкубировать нейтрофилов при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы загрузить зонд DHE, а затем выделить подвеску клетки на 96-хорошо черный полистирол микроплюрат с 200 йл на колодец.
3. Включите считыватель микроплатформ и откройте программное обеспечение обнаружения. Выберите непрозрачный формат пластины 96 скважин и определите область чтения.
   1. Установите флуоресценцию (Ex/Em 518/605 нм) в кинетическом режиме каждые 5 минут в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия. Убедитесь в том, чтобы встряхнуть пластину в течение 3 с перед каждым чтением.
4. Вынюйте микроплиты из инкубатора, добавьте культурный E44 (MOI-100) или phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) (100 нг/мл) к каждому хорошо содержащем предварительно загруженные нейтрофили с 3 репликациями. Используйте PMA в качестве положительного контроля.
5. Поместите пластину в считыватель микропластиров и немедленно начните анализ.

Результаты

Используя протокол, изложенный в этой статье, нейтрофили были выделены из периферической крови человека и загружены флуоресцентным зондом DHE для обнаружения изменений уровней ROS в ответ на инфекцию E44. Здесь мы предоставляем репрезентативные данные, демонстрирующие производство ROS, вы?...

Обсуждение

Нейтрофили действуют как наиболее распространенный компонент белых кровяных телец в крови человека. Они являются важными клетками-эффекторами в врожденной иммунной системе человека, которая строит первую линию защиты от вторжения патогенных микроорганизмов¹¹. Поколение...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL polypropylene conical centrifuge tubes	KIRGEN	KG2611
96-well plate	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Autuomated cell counter	Bio-rad	508BR03397
Biological Safety Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion	BD	237500
CD16 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-701
Centrifuge	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Fetal bovine serum	Cellmax	SA211.02
Incubator	Heraeus	Hera Cell
MACS separation buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Thermostatic shaker	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Yeast extract	OXOID	LP0021