Сбор и дезагрегирование: упущенный шаг в исследовании методов биопленки

Резюме

В настоящем документе подробно описываются методы, демонстрирующие три распространенных метода сбора и дезагрегирования биопленки на двух типах поверхностей, испытания на прочность метода сбора урожая и минимальную информацию, которую следует учитывать при выборе и оптимизации методов сбора и дезагрегирования для повышения воспроизводимости.

Аннотация

Методы биопленки состоят из четырех различных этапов: выращивание биопленки в соответствующей модели, обработка зрелой биопленки, сбор биопленки с поверхности и дезагрегирование сгустков, а также анализ образца. Из четырех этапов сбор урожая и дезагрегирование являются наименее изученными, но, тем не менее, критическими при рассмотрении возможности систематической проверки. В этой статье демонстрируются широко используемые методы сбора и дезагрегирования биопленки, выращенной на трех разных поверхностях. Три метода сбора и дезагрегирования биопленки, почерпнутые из обширного обзора литературы, включают вихри и обработку ультразвуком, скребок и гомогенизацию, а также соскоб, вихрь и обработку ультразвуком. Рассматриваются два типа поверхностей: твердые непористые (поликарбонатное и боросиликатное стекло) и пористые (силиконовое). Кроме того, мы предоставляем рекомендации по минимальной информации, которая должна быть включена при сообщении о применяемой технике сбора урожая, и сопутствующем методе проверки на предвзятость.

Введение

Определение биопленки эволюционировало за последние несколько десятилетий и охватывает микробную ассоциацию с различными биологическими и/или небиологическими поверхностями, включая неклеточные ^{компоненты1}, которые демонстрируют различный рост и генетическую экспрессию2 в матрице. Биопленка обеспечивает защиту от экологических стрессов, таких как сушка, и может сделать действие химических дезинфицирующих средств менее эффективным, что приводит к выживанию микробов. Выжившие в биопленке потенциально могут стать источником патогенных микроорганизмов, которые являются проблемой общественного ^{здравоохранения3}.

Методы биопленки состоят из четырех этапов: рост, обработка, отбор проб (сбор и дезагрегирование) и анализ. Рост, первый шаг, где пользователь определяет условия роста организма, температуру, среды и т.д., является наиболее рассмотренным и описанным в литературе по биопленке4,5,6,7. На этапе обработки оценивают противомикробные препараты (например, дезинфицирующие средства) для определения их эффективности либо против зрелой биопленки3,8,9^, либо противомикробное средство может быть включено в поверхность для определения способности продукта предотвращать или уменьшать рост биопленки10. Третий этап, отбор проб, включает этапы сбора биопленки с поверхности, на которой она росла, и дезагрегирования удаленных комков3,8,11. Четвертый этап, анализ, может включать в себя количество жизнеспособных клеток, микроскопию, измерения флуоресценции, молекулярные результаты и/или оценку компонента ^{матрицы8,9}. Оценка данных дает информацию о результатах эксперимента. Из четырех отбор проб часто является наиболее упускаемым из виду шагом, поскольку он предполагает, что выбранный метод сбора и/или дезагрегирования биопленки эффективен на 100%, часто без ^{проверки11}.

Планктонные суспензии бактерий, часто считающиеся однородными, требуют простого вихря перед анализом. Биопленки, однако, представляют собой сложные сообщества, состоящие из микроорганизмов (прокариотических и/или эукариотических), экзополисахаридов, белков, липидов, внеклеточной ДНК и клеток-хозяев12. Необходимы шаги, выходящие за рамки традиционных планктонных микробиологических методов культивирования, чтобы адекватно собирать биопленку с поверхности, а затем дезагрегировать ее в однородную одноклеточную суспензию. Обширный обзор литературы (информация, не включенная в эту публикацию) показал, что выбор метода удаления и дезагрегирования зависит от ряда факторов, включая виды, присутствующие в биопленке, поверхность, к которой прикреплена биопленка (непористая или пористая), доступность к поверхностям роста (легко снимаемый купон или физическое разрушение аппарата, в котором растет биопленка), геометрия поверхности (площадь и форма), плотность биопленки на поверхностях роста и имеющееся лабораторное оборудование.

Когда биопленка собирается с поверхности, полученная клеточная суспензия является гетерогенной. Для того чтобы эта неравномерная подвеска была точно перечислена, она должна быть дезагрегирована на отдельные ячейки. Количество жизнеспособных пластин предполагает, что колониеобразующая единица происходит от одной бактерии. Если на питательную среду поместить агрегаты биопленки, невозможно различить отдельные клетки, что может привести к неточным оценкам. Например, во время тестирования эффективности дезинфицирующих средств, если обработка очень эффективно удаляет биопленку с поверхности по сравнению с контролем, уменьшение бревна может показаться искусственно большим по сравнению с контролем. С другой стороны, химическое дезинфицирующее средство, которое фиксирует биопленку на поверхности по сравнению с контролем, будет иметь более низкое сокращение ^log11. Такой сценарий может привести к предвзятой интерпретации экспериментальных данных.

В ходе подготовки к публикации обзор литературы определил, что общие подходы к сбору и дезагрегированию биопленки включают соскоб, мазок, обработку ультразвуком, вихрь или их комбинацию. Соскоб определяется как физическое удаление биопленки с поверхностей стерильной палочкой, шпателем или другим инструментом. Тампонирование относится к удалению биопленки с поверхностей с помощью палочки с хлопковым наконечником или другого неподвижного абсорбирующего материала. Обработка ультразвуком относится к разрушению биопленки с поверхностей с помощью ультразвуковых волн, распространяемых через воду. Вихрь относится к использованию смесителя для достижения жидкого вихря образца внутри трубки. Гомогенизация использует вращающиеся лопасти для сдвига собранных сгустков биопленки в одну клеточную суспензию. В этой статье мы представляем три метода сбора и дезагрегирования для двух различных типов поверхностей: твердых/непористых и пористых.

Приведен перечень рекомендуемой минимальной информации, которую исследователи должны включать в разделы методов публикаций. Мы надеемся, что включение этой информации позволит другим исследователям воспроизвести свою работу. Идеального метода сбора и дезагрегирования не существует, поэтому также даются рекомендации по проверке техники.

В этой статье демонстрируются три распространенных метода сбора и дезагрегирования биопленки из общих поверхностей роста. Эта информация позволит исследователям лучше понять общую точность и предвзятость метода тестирования биопленки. Описаны следующие способы: (1) Биопленка Pseudomonas aeruginosa , выращенная на поликарбонатных купонах (твердая непористая поверхность) под высоким сдвигом жидкости в реакторе биопленки CDC, собирается и дезагрегируется после пятиступенчатой комбинации вихрей и обработки ультразвуком для достижения сбора и дезагрегирования биопленки (2) A P. aeruginosa биопленка, выращенная на купонах боросиликатного стекла (твердая непористая поверхность) в реакторе капельного потока при низком сдвиге жидкости, собирается и дезагрегируется с использованием соскоба и гомогенизации (3) Биопленка Escherichia coli , выращенная в силиконовых трубках (пористая поверхность), собирается и дезагрегируется с использованием соскоба, с последующим ультразвуком и вихрем.

протокол

1. Вихрь и обработка ультразвуком

1. Вырастите зрелую биопленку P. aeruginosa ATCC 15442, выращенную в соответствии со стандартом ASTM E25622.
2. В конце 48-часового периода роста подготовьтесь к обработке биопленки и пробных купонов в соответствии со стандартом ASTM E28718
3. Асептически вставьте автоклавные брызговики в стерильные конические трубки объемом 50 мл с помощью пламенно-стерилизованных щипцов. Повторить для всех трубок, которые будут получать лечение. Трубки для управления купонами не нуждаются в брызговике.
4. Асептически извлеките случайно выбранный стержень из биопленочного реактора CDC. Промойте купоны, чтобы удалить слабо прикрепленные ячейки, осторожно окунув стержень в 30 мл стерильной буферной воды.
5. Держите стержень параллельно столешнице, над пустой, стерильной конической трубкой объемом 50 мл и, используя огненно стерилизованный гаечный ключ Allen, ослабьте установленный винт, чтобы бросить купон с биопленочным покрытием в трубку. Повторите для нужного количества купонов. Снимите брызговики и поместите в отдельный контейнер для стерилизации.
6. Используя серологическую пипетку 5 мл, медленно пипетку 4 мл обработки или контроля в трубки, чтобы жидкость стекала по внутренней части стенки трубки.
7. Осторожно постучите по дну трубки так, чтобы любые пузырьки воздуха под купоном были смещены. Позвольте 30 - 60 с между каждым добавлением.
8. В конце указанного времени контакта пипетка 36 мл нейтрализатора попадает в пробирки в том же порядке, в котором применялась обработка (или контроль).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем комбинированной обработки и нейтрализатора важен для точного определения плотности бревна биопленки.
9. Вихрь каждой трубки на самом высоком уровне в течение 30 ± 5 с. Убедитесь, что достигнут полный вихрь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при вихре тяжелых купонов, таких как нержавеющая сталь, в стеклянных флаконах, где может произойти поломка.
10. Определите оптимальное количество пробирок на ванну и размещение в стойке для пробирок до обработки фактических образцов. При обработке нескольких образцов подтвердите, что температура воды в ванне с ультразвуком составляет 21 ± 2 ^oC.
11. Поместите трубки в трубчатую стойку, подвешенную в дегазированном ультразвуковом аппарате таким образом, чтобы уровень воды в ванне был равен уровню жидкости в трубках. Ультразвук при 45 кГц, 100% мощности и нормальной функции в течение 30 ± 5 с. Повторите циклы вихря и обработки ультразвуком, а затем закончите последним вихрем (всего 5 циклов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пробирки с собранной и дезагрегированной биопленкой представляют собой ¹⁰⁰ или 0 разбавления.
12. Последовательно разбавляйте образец в буферной воде. Пластина на агаре R2A с использованием соответствующего метода покрытия. Инкубировать при 36 ± 2 ^oC в течение 24 ч. Подсчитывайте колонии в соответствии с используемым методом покрытия и записывайте данные.

2. Выскабливание и гомогенизация

1. Вырастите зрелую биопленку P. aeruginosa ATCC 15442 в соответствии со стандартом ASTM E264713.
2. Настройте станцию отбора проб, чтобы включить в нее плату для отбора проб, 95% этанол в стакане, спиртовую горелку, гемостаты, инструмент для удаления купонов, стаканы со стерильной разбавленной водой и разбавляющие трубки для промывки купонов.
3. Выключите насос. Снимите крышку канала и используйте стерильный инструмент для удаления купона и гемостаты, чтобы удалить купон, стараясь не потревожить биопленку.
4. Промойте купон, осторожно погружая движением жидкости в 45 мл стерильной разбавляющей воды (содержащейся в 50 мл центрифужной трубки). Немедленно отмените движение, чтобы удалить купон.
5. Поместите купон в стакан, содержащий 45 мл стерильной разбавляющей воды. Соскоблите покрытую биопленкой поверхность купона в направлении вниз в течение примерно 15 с, используя стерильный шпатель или скребок. Промойте шпатель или скребок, перемешав его в стакане. Повторите процесс выскабливания и промывки 3-4 раза, обеспечив полное покрытие поверхности купона.
6. Промойте купон, удерживая его под углом 60° над стерильным стаканом и пипеткой 1 мл стерильной разбавляющей воды над поверхностью купона. Повторите в общей сложности 5 полосканий. Конечный объем в стакане составляет 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем комбинированной обработки и нейтрализатора важен для точного определения плотности бревна биопленки.
7. Замените каждую крышку канала по мере удаления купонов.
8. Работая в шкафу биобезопасности, гомогенизируйте соскобленный образец биопленки. Прикрепите к гомогенизатору стерильный гомогенизатор, поместите наконечник зонда в жидкость, включите гомогенизатор и увеличьте до 20 500 оборотов в минуту.
9. Гомогенизируйте образец в течение 30 с. Выключите обороты и выключите гомогенизатор.
10. Дезинфицируйте зонд между образцами биопленки путем гомогенизации 9 мл стерильной заготовки для разбавления при 20 500 об/мин в течение 30 с, как описано выше. Гомогенизируйте 9 мл пробирки 70% этанола в течение 30 с, отсоедините зонд и оставьте в этанольной трубке в течение 1 мин. Гомогенизируйте две дополнительные заготовки для разбавления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца может использоваться одноразовый гомогенизаторный зонд.
11. Последовательно разбавляйте образцы в буферной воде. Пластина на агар R2A с использованием соответствующего метода покрытия. Инкубируйте пластины при 36 ± ^2oC в течение 24 ч, подсчитывайте колонии в соответствии с используемым методом покрытия и записывайте данные.

3. Выскабливание, вихрь и обработка ультразвуком

1. Вырастите зрелую биопленку Escherichia coli ATCC 53498 в силиконовой катетерной ^{трубке10}.
2. Подготовьте образцы материалов: промывные трубки, стерильную центрифужную трубку, пустую стерильную чашку Петри, гемостат и ножницы из нержавеющей стали, таймер и линейку.
3. Когда насос приостановлен, используйте 70% этанола для очистки внешней стороны трубки. Измерьте 2 см от конца, избегая области, прикрепленной к разъему, и отметьте трубку, чтобы определить места резки.
4. Стерилизованными ножницами нарежьте трубку на отметке 2 см и поместите сегмент в пустую стерильную чашку Петри. Протрите трубку 70% этанолом и снова подключите дистальный конец к отработанной трубке.
5. Промыть сегмент трубки для удаления планктонных клеток. С помощью пламенных стерилизованных щипцов аккуратно погрузить сегмент трубки в 20 мл стерильной разбавленной воды, а затем немедленно удалить. Поместите сегмент в 10 мл нейтрализатора.
6. С помощью пламенных стерилизованных щипцов удерживайте сегмент трубки и соскребайте стерильной деревянной палочкой аппликатора до тех пор, пока все внутренние участки трубки не будут соскоблены. Время от времени промывайте палочку в 10 мл нейтрализатора и поместите сегмент обратно в пробирку. Сегмент скребковых труб представляет собой разбавление ¹⁰⁰ или 0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем комбинированной обработки и нейтрализатора важен для точного определения плотности бревна биопленки.
7. Вихрь каждой трубки на самом высоком уровне в течение 30 ± 5 с. Поместите трубку в трубчатую стойку, подвешенную в ультразвуковом аппарате, так, чтобы уровень воды в ванне был равен уровню жидкости в трубках. Обработка ультразвуком на частоте 45 кГц, 100% мощность и нормальная функция в течение 30 ± 5 секунд. Повторите циклы вихря и обработки ультразвуком, а затем закончите последним вихрем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта трубка с собранной и дезагрегированной биопленкой представляет собой ¹⁰⁰ разбавление.
8. Последовательно разбавляйте образцы в буферной воде. Тарелка на триптическом соевом агаре используется с использованием соответствующего метода покрытия.
9. Инкубировать пластины при 36 ± 2 ^oC в течение 24 ч. Подсчитывайте колонии в соответствии с используемым методом покрытия, записывайте данные и вычисляйте среднее арифметическое.

Результаты

Валидация/подтверждение метода сбора урожая
В нескольких исследованиях, которые были проведены в нашей лаборатории, изучалась способность вихрей и обработки ультразвуком эффективно собирать биопленку, выращенную в реакторе биопленки (ASTM E2562)² с использованием ...

Обсуждение

Минимальная информация для методов сбора урожая и дезагрегирования
Для создания воспроизводимых данных биопленки в научном сообществе крайне важно, чтобы авторы включили как можно больше деталей относительно каждого из этапов роста, обработки, отбора проб и анализа метода...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506