JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

R-петли представляют собой преобладающий класс транскрипционно-управляемых структур ДНК, отличных от B, которые встречаются во всех геномах в зависимости как от последовательности ДНК, так и от топологической благоприятности. В последние годы R-петли были вовлечены в различные адаптивные и дезадаптивные роли и были связаны с геномной нестабильностью в контексте человеческих заболеваний. Как следствие, точное картирование этих структур в геномах представляет большой интерес для многих исследователей. Здесь описывается DRIP-seq (иммунопреципитация ДНК:РНК с последующим высокопроизводительным секвенированием). Это надежный и воспроизводимый метод, который позволяет точно и полуколичественно картировать R-петли. Также описана недавняя итерация метода, в которой фрагментация осуществляется с помощью ультразвуковой обработки (sDRIP-seq), которая позволяет картировать R-петли с высоким разрешением, специфичным для нитей и высоким разрешением. Таким образом, sDRIP-seq устраняет некоторые общие ограничения метода DRIP-seq с точки зрения разрешения и многожилости, что делает его предпочтительным методом для отображения R-контуров.

Аннотация

R-петли представляют собой преобладающий класс транскрипционно-управляемых структур ДНК, отличных от B, которые встречаются во всех геномах в зависимости как от последовательности ДНК, так и от топологической благоприятности. В последние годы R-петли были вовлечены в различные адаптивные и дезадаптивные роли и были связаны с геномной нестабильностью в контексте человеческих заболеваний. Как следствие, точное картирование этих структур в геномах представляет большой интерес для многих исследователей. Здесь описывается DRIP-seq (иммунопреципитация ДНК:РНК с последующим высокопроизводительным секвенированием). Это надежный и воспроизводимый метод, который позволяет точно и полуколичественно картировать R-петли. Также описана недавняя итерация метода, в которой фрагментация осуществляется с помощью ультразвуковой обработки (sDRIP-seq), которая позволяет картировать R-петли с высоким разрешением, специфичным для нитей и высоким разрешением. Таким образом, sDRIP-seq устраняет некоторые общие ограничения метода DRIP-seq с точки зрения разрешения и многожилости, что делает его предпочтительным методом для отображения R-контуров.

Введение

R-петли представляют собой трехцепочечные структуры нуклеиновых кислот, которые образуются в основном во время транскрипции при гибридизации зарождающегося транскрипта РНК с матричной цепью ДНК. Это приводит к образованию гибрида РНК:ДНК и вызывает смещение нематричной цепи ДНК в одноцепочечное закольцованное состояние. Биохимическое восстановление 1,2,3,4 и математическое моделирование5 в сочетании с другими биофизическими измерениями 6,7 установили, что R-петли с большей вероятностью возникают над областями, которые проявляют определенные благоприятные характеристики. Например, области, которые демонстрируют асимметрию цепей в распределении гуанинов (G) и цитозинов (C) таким образом, что РНК богата G, свойство, называемое положительным GC-асимметрией, предпочтительны для формирования R-петель при транскрибировании из-за более высокой термодинамической стабильности гибрида ДНК:РНК по сравнению с дуплексом ДНК8. Области, в которых развился положительный асимметрия GC, такие как ранние участки многих эукариотических генов 4,9,10,11, склонны к образованию R-петель in vitro и in vivo 3,4,12. Отрицательное суперспиральное напряжение ДНК также в значительной степени способствует формированию структуры13,14, поскольку R-петли эффективно поглощают такие топологические напряжения и возвращают окружающее волокно ДНК в благоприятное расслабленное состояние 5,15.

Исторически сложилось так, что считалось, что структуры R-петли являются результатом редких, спонтанных переплетений РНК с ДНК во время транскрипции. Тем не менее, развитие иммунопреципитации ДНК:РНК (DRIP) в сочетании с высокопроизводительным секвенированием ДНК (DRIP-seq) позволило провести первое полногеномное картирование R-петель и показало, что эти структуры гораздо более распространены, чем ожидалось, в клетках человека 4,16. R-петли возникают на десятках тысяч консервативных, транскрибируемых, генных горячих точек в геномах млекопитающих, с преклонностью к GC-искаженным островкам CpG, перекрывающим первый интрон генов и концевые области многочисленныхгенов. В целом, R-петли в совокупности занимают 3-5% генома в клетках человека, что согласуется с измерениями в других организмах, включая дрожжи, растения, мух и мышей 18,19,20,21,22.

Анализ горячих точек, образующих R-петлю в клетках человека, показал, что такие области связаны со специфическими сигнатурамихроматина23. R-петли, как правило, обнаруживаются в областях с более низкой занятостью нуклеосом и более высокой плотностью РНК-полимеразы. У промоторов R-петли связаны с повышенным привлечением двух котранскрипционно осажденных модификаций гистонов, H3K4me1 и H3K36me317. На концах генов R-петли связываются с близко расположенными генами, которые подвергаются эффективному прекращению транскрипции17, что согласуется с предыдущими наблюдениями24. Также было показано, что R-петли участвуют в инициации репликации ДНК в источниках репликации геномов бактериофага, плазмиды, митохондрий и дрожжей 25,26,27,28,29,30,31. Кроме того, 76% склонных к R-петлям промоторов CpG-островков человека функционируют как ранние, конститутивные истоки репликации 32,33,34,35, что еще больше усиливает связи между R-петлями и истоками репликации. В совокупности эти исследования показывают, что R-петли представляют собой новый тип биологического сигнала, который может запускать специфические биологические выходы в зависимости от контекста23.

Ранее было показано, что R-петли формируются в последовательностях переключения классов в процессе рекомбинации переключателей класса иммуноглобулинов 3,36,37. Считается, что такие запрограммированные R-петли инициируют рекомбинацию переключателей классов путем введения двухцепочечных разрывов ДНК38. С тех пор вредное образование R-петли, обычно понимаемое как результат чрезмерного образования R-петли, было связано с геномной нестабильностью и такими процессами, как гиперрекомбинация, коллизии транскрипции и репликации, репликация и транскрипционный стресс (см. обзор 39,40,41,42,43). Как следствие, улучшенное картирование структур R-петли представляет собой захватывающую и важную задачу для лучшего расшифровки распределения и функции этих структур в норме и при заболеваниях.

Иммунопреципитация ДНК:РНК (DRIP) основана на высоком сродстве моноклонального антитела S9.6 к гибридам ДНК:РНК44. DRIP-seq обеспечивает надежное полногеномное профилирование формирования R-петли 4,45. Несмотря на свою полезность, этот метод страдает от ограниченного разрешения из-за того, что для достижения мягкой фрагментации ДНК используются ферменты рестрикции. Кроме того, DRIP-seq не предоставляет информации о направленности образования R-петли. В этой статье мы описываем вариант DRIP-seq, который позволяет картировать R-петли с высоким разрешением специфичным для цепи способом. Этот метод основан на ультразвуковой обработке для фрагментации генома перед иммунопреципитацией, и поэтому этот метод называется sDRIP-seq (ультразвуковая ДНК:РНК иммунопреципитация в сочетании с высокопроизводительным секвенированием) (Рисунок 1). Использование ультразвуковой обработки позволяет повысить разрешение и ограничить смещения ферментной фрагментации, наблюдаемые в подходах DRIP-seq46. sDRIP-seq создает карты R-петли, которые находятся в сильном согласии с результатами как DRIP-seq, так и ранее описанного метода DRIPc-seq с высоким разрешением, в котором библиотеки секвенирования строятся из нитей РНК иммунопреципитированных структур R-петли45.

Столкнувшись с множеством методов на выбор, пользователи могут задаться вопросом, какой именно подход на основе DRIP предпочтительнее для их нужд. Мы предлагаем следующие советы. DRIP-seq, несмотря на свои ограничения, технически прост и является самым надежным (с наибольшим выходом) из всех трех методов, рассмотренных здесь; Таким образом, он остается широко полезным. Было опубликовано множество наборов данных DRIP-seq, которые обеспечивают полезную точку сравнения для новых наборов данных. Наконец, конвейер биоинформатического анализа проще, поскольку данные не являются сложными. Новым пользователям рекомендуется начинать оттачивать свои навыки картирования R-петли с помощью DRIP с последующей количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и DRIP-seq. sDRIP-seq представляет собой несколько более высокую степень технической сложности: выходы немного снижены из-за ультразвуковой обработки (обсуждается ниже), а процесс секвенирования библиотеки немного сложнее. Тем не менее, выигрыш в многожильности и более высоком разрешении неоценим. Отмечается, что sDRIP-seq будет захватывать как двухцепочечные гибриды РНК:ДНК, так и трехцепочечные R-петли. Из-за этапов создания библиотеки DRIP-seq не будет захватывать двухцепочечные гибриды РНК:ДНК. DRIPc-seq является наиболее технически сложным и требует большего количества исходных материалов. В свою очередь, он предлагает высочайшее разрешение и многожильность. Поскольку библиотеки секвенирования строятся из фрагментов РНК R-петель или гибридов, DRIPc-seq может страдать от возможного загрязнения РНК, особенно потому, что S9.6 обладает остаточным сродством к дцРНК 19,47,48. sDRIP-seq позволяет картировать цепи с высоким разрешением, не беспокоясь о загрязнении РНК, поскольку библиотеки секвенирования получают из нитей ДНК. В целом, эти три метода остаются полезными и имеют разную степень сложности и немного отличающиеся предостережения. Все три источника, однако, позволяют получить высококонгруэнтные наборы данных48 и обладают высокой чувствительностью к предварительной обработке РНКазой H, которая представляет собой необходимый контроль для обеспечения специфичности сигнала45,49. Следует отметить, что с учетом отбора размеров, налагаемых на библиотеки секвенирования, малые гибриды (по оценкам <75.н.), такие как те, которые формируются временно вокруг сайтов прайминга репликации ДНК отстающей цепи (праймеры Оказаки), будут исключены. Аналогичным образом, поскольку все методы DRIP включают фрагментацию ДНК, нестабильные R-петли, требующие отрицательной суперспирали ДНК для их стабильности, будут потеряны. Таким образом, подходы DRIP могут недооценивать нагрузки R-петли, особенно для коротких, нестабильных R-петель, которые могут быть лучше всего зафиксированы с использованием подходов in vivo 45,48. Отмечено, что R-петли также могут быть профилированы независимым от S9.6 образом при глубоком покрытии, с высоким разрешением и специфическим для нити образом на отдельных молекулах ДНК после обработки бисульфитом натрия12. Кроме того, стратегии с использованием каталитически неактивного фермента РНКазы H1 были использованы для картирования нативных R-петель in vivo, выделяя короткие, нестабильные R-петли, которые формируются в основном на паузированных промоторах 50,51,52.

протокол

Приведенный ниже протокол оптимизирован для клеточной линии Ntera-2 человека, выращенной в культуре, но он был успешно адаптирован без модификации к ряду других клеточных линий человека (HEK293, K562, HeLa, U2OS), первичных клеток (фибробласты, В-клетки), а также у других организмов с небольшими модификациями (мыши, мухи).

1. Забор и лизис клеток

  1. Культивируйте клетки Ntera-2 до 75%-85% конфлюенции. Убедитесь, что оптимальное количество клеток составляет от 5 до 6 миллионов клеток с жизнеспособным количеством >90% для начала любой процедуры DRIP.
  2. Промойте клетки один раз 1x PBS, добавьте 1,5 мл Trypsin-EDTA 1x, а затем инкубируйте в течение 2 минут при 37 °C, пока клетки не диссоциируют с чашкой.
  3. Добавьте 5 мл теплой среды и хорошо пипеткуйте, чтобы ресуспендировать клетки в одноклеточную суспензию. Переложите содержимое в новую пробирку объемом 15 мл и аккуратно гранулируйте клетки в дозе 300 x g в течение 3 минут.
  4. Промойте клетки один раз 5 мл 1x PBS и аккуратно гранулируйте клетки в дозе 300 x g в течение 3 минут.
  5. Полностью ресуспендируйте клетки в 1,6 мл TE буфера (10 мМ Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Добавьте 5 μL протеиназы K (20 мг/мл стокового раствора) и 50 μL SDS (20% стоковый раствор) и аккуратно переверните пробирки пять раз, пока раствор не станет вязким. Не пытайтесь пипетировать раствор, только перемешивайте методом инверсии.
  6. Инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре 37 °C.

2. Экстракция ДНК

  1. Налейте лизат ДНК в предварительно свернутую пробирку с фазовым замком высокой плотности объемом 15 мл и добавьте 1 объем (1,6 мл) фенол/хлороформ изоамилового спирта (25:24:1). Аккуратно переверните пять раз и вращайте при давлении 1 500 x g в течение 5 минут.
  2. Добавьте 1/10 объема 3 М ацетата натрия (NaOAc) (pH 5,2) и 2,5 объема 100% этанола в новую пробирку объемом 15 мл. Влейте верхнюю водную фазу из пробирки с фазовым замком геля и аккуратно инвертируйте до полного осаждения ДНК (до 10 мин).
  3. Намотайте нити ДНК с помощью наконечника с широким отверстием объемом 1 000 мкл и переложите в чистую пробирку объемом 2 мл, стараясь не перенести остаточную надосадочную жидкость.
  4. Промойте ДНК, добавив 1,5 мл 80% этанола, и аккуратно переверните пробирку пять раз. Выдерживать в течение 10 минут.
  5. Повторите предыдущий шаг дважды. Не центрифугируйте во время промывки. Осторожно удалите как можно больше этанола с помощью пипетирования после последней промывки, стараясь при этом не нарушить ДНК.
  6. Дайте ДНК полностью высохнуть на воздухе, переворачивая трубку. Этот этап может занять от 30 минут до 1 часа в зависимости от количества ДНК.
  7. Добавьте 125 мкл TE-буфера непосредственно на гранулу ДНК, чтобы фрагментировать ДНК с помощью фермента рестрикции, или 100 μл TE-буфера, чтобы разрезать ДНК с помощью ультразвука. Держите на льду в течение 1 часа и аккуратно ресуспендируйте ДНК путем нескольких раз пипетирования с широким отверстием 200 μл. Оставьте на льду на 1 час перед началом этапа фрагментации.

3. Фрагментация ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для DRIP-seq на основе фермента рестрикции выполните шаг 3.1. Для DRIP-seq на основе ультразвука перейдите к шагу 3.2.

  1. Фрагментация фермента рестрикции (РЭ)
    1. Расщепите ресуспендированную геномную ДНК (очень вязкую) с помощью коктейля из РЖ в соответствии с инструкциями поставщика.
      1. Добавьте 0,1 мМ спермидина в конечную реакцию. Используйте коктейль из 4-5 ферментов с 30 Ед каждого фермента в общем объеме 150 μл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный коктейль для DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 был разработан для получения фрагмента средней длиной 5 килооснований. Избегайте любых вмешательств в метилирование CpG и сохраняйте богатые GC участки генома. Возможны и другие коктейли16). Эти коктейли подходят как для генома человека, так и для генома мыши, но могут быть скорректированы по мере необходимости.
      2. Инкубируйте реакционную смесь в течение ночи при 37 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь ДНК после расщепления больше не должна быть вязкой. Любая остаточная вязкость на этом этапе указывает на неполное разложение.
      3. Если вы наблюдаете, добавьте еще 10 ЕД каждого фермента и инкубируйте еще 2-4 часа при 37 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут не переварить всю гранулу, если они собрали больше клеток, чем рекомендовано здесь.
    2. Аккуратно пипетируйте расщепленную за ночь ДНК (150 μл) в предварительно свернутую световую трубку с фазовой блокировкой объемом 2 мл. Добавьте 100 μL воды и один объем (250 μL) фенола/хлороформа изоамилового спирта (25:24:1). Аккуратно переверните пять раз и вращайте при 16 000 x g в течение 10 минут.
    3. Добавьте 1,5 мкл гликогена, 1/10 объема 3 М NaOAc (pH 5,2) и 2,5 объема 100% этанола в новую пробирку объемом 1,5 мл. Пипеткой извлеките ДНК из пробирки с фазовой блокировкой и перемешайте, перевернув пять раз. Выдерживать в течение 1 ч при температуре -20 °C.
    4. Вращайте при 16 000 x g в течение 35 минут при температуре 4 °C. Промойте ДНК 200 μл 80% этанола и отжимайте при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    5. Высушите гранулу на воздухе и добавьте в гранулу 50 μл буфера TE. Оставьте пробирку на льду на 30 минут и аккуратно восстановите ДНК.
    6. Измерьте концентрацию (OD260) фрагментированной ДНК с помощью спектрофотометра.
    7. Необязательно, но рекомендуется: загрузите 1 г расщепленной ДНК в 0,8% агарозный гель вместе с маркером размера, чтобы убедиться, что переваривание завершено. Запустите гель в течение часа при 100 В.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если продукт неполный, можно добавить дополнительный фермент. Неполное пищеварение может привести к потере рассасываемости после иммунопреципитации.
    8. После этого этапа обрабатывают 10 г расщепленной ДНК 4 мкл рибонуклеазы H (РНКазы H) в течение 1-2 ч при 37 °C, чтобы убедиться, что сигнал, полученный при иммунопреципитации, получен от гибридов ДНК:РНК. Затем приступают к иммунопреципитации S9.6 (шаг 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепленные ДНК можно хранить в замороженном виде при температуре -80 °C в течение одного месяца без существенной потери урожая.
  2. Ультразвуковая обработка
    1. Ультразвуком обеспечьте всю или часть извлеченной ДНК в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл общим объемом 100 мкл. Выполните 15-20 циклов по 30 с ВКЛ / 30 с ВЫКЛ на ультразвуковике (отжим после 5, 10 и 15 циклов для обеспечения однородной ультразвука).
    2. Измерьте концентрацию (OD260) ультразвуковой ДНК на спектрофотометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе вязкость ДНК должна была исчезнуть.
    3. Запустите агарозный гель, чтобы подтвердить распределение по размерам обработанной ультразвуком ДНК (300-500.н.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное ультразвуковое исследование ДНК может привести к значительному снижению выхода в результате разрыва и диссоциации структур R-петли.
    4. После этого этапа обработайте 10 г ультразвуковой ДНК 4 мкл РНКазы H в течение 1-2 ч при 37 °C, чтобы убедиться, что сигнал, полученный при иммунопреципитации, получен от гибридов ДНК:РНК. Затем приступают к иммунопреципитации S9.6 (шаг 4).

4. Иммунопреципитация S9.6

Этапы иммунопреципитации одинаковы независимо от того, была ли ДНК фрагментирована с помощью РЗЭ или ультразвука.

  1. Приготовьте три пробирки и добавьте 4,4 мкг фрагментированной ДНК в конечный объем 500 мкл TE-буфера на пробирку. Сохраните 50 μL (1/10 объема) из каждой пробирки, чтобы использовать позже в качестве входной ДНК.
  2. Добавьте 50 мкл 10-кратного связывающего буфера (100 мМ NaPO4 pH 7, 1,4 М NaCl, 0,5% Triton X-100) и 10 мкл антитела S9,6 (1 мг/мл) к 450 мкл разбавленной ДНК.
  3. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C на вращателе мини-трубок со скоростью 7-10 об/мин.
  4. Для каждой пробирки промойте 50 μL суспензии из агарозных гранул Protein A/G с 700 μL 1x связывающего буфера, перевернув пробирки на мини-ротаторе при 7-10 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут. Поворачивайте бусины при давлении 1 100 x g в течение 1 минуты и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг один раз.
  5. Добавьте ДНК из шага 4.3 к 50 мкл гранул и инкубируйте в течение 2 ч при 4 °C при инвертировании со скоростью 7-10 об/мин на мини-ротаторе.
  6. Крутите бусины в течение 1 минуты при 1 100 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Промойте шарики 750 мкл 1x связующего буфера, инвертируя со скоростью 7-10 об/мин на мини-ротаторе в течение 15 минут. Вращайте вниз в течение 1 минуты при 1 100 x g и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг один раз.
  8. Добавьте 250 мкл элюирующего буфера (50 мМ Tris-Cl pH 8, 10 мМ ЭДТА pH 8, 0,5% SDS) и 7 мкл протеиназы К (запас 20 мг/мл) и инкубируйте с вращением при 55 °C (12 об/мин) в течение 45 мин.
  9. Крутите бусины вниз в течение 1 минуты при плотности 1 100 x g. Перенесите надосадочную жидкость в предварительно свернутую световую трубку с фазовой блокировкой объемом 2 мл и добавьте один объем (250 мкл) фенола/хлороформа изоамилового спирта (25:24:1). Переверните трубки пять раз и вращайте в течение 10 минут при температуре 16 000 x g при комнатной температуре.
  10. Добавьте 1,5 мкл гликогена, 1/10 объема 3M NaOAc (pH 5,2) и 2,5 объема 100% этанола в новую пробирку объемом 1,5 мл. Пипеткой извлеките ДНК из пробирки с фазовой блокировкой и перемешайте, перевернув пять раз. Выдерживать в течение 1 ч при температуре -20 °C.
  11. Вращайте при 16 000 x g в течение 35 минут при температуре 4 °C. Промойте ДНК 200 μл 80% этанола и отжимайте при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  12. Высушите гранулы на воздухе и добавьте 15 мкл 10 мМ Tris-Cl (pH 8) в каждую пробирку. Оставьте трубки на льду на 20 минут и аккуратно восстановите. Соедините содержимое трех пробирок в одну пробирку (45 μл).
  13. Проверьте эффективность DRIP с помощью количественной ПЦР с использованием 5 мкл из 45 мкл ресуспендированной ДНК (см. Репрезентативные результаты). Разведите 5 μL в 10 μL воды и используйте 2 μL на реакцию.

5. Этап предварительной библиотеки только для ультразвуковой ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковая обработка приводит к разрыву смещенной нити одноцепочечной ДНК R-петель. Таким образом, трехцепочечные R-петлевые структуры превращаются в двухцепочечные гибриды ДНК:РНК при ультразвуковой обработке. В результате, эти гибриды ДНК:РНК должны быть преобразованы обратно в двухцепочечную ДНК до создания библиотеки. Здесь используется второй этап синтеза цепи. Альтернативный подход, который был успешно использован, заключается в том, чтобы вместо этого провести одноцепочечное лигирование ДНК с последующим синтезом второй цепи53.

  1. К 40 мкл DRIP-обработанной ДНК из стадии 4.12 добавьте 20 мкл 5-кратного второго цепочечного буфера (200 мМ Tris pH 7, 22 мМ MgCl2, 425 мМ KCl), 10 мМ смеси dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTT или dUTP, если пользователь планирует достичь специфического для нити DRIP-секвенирования), 1 мкл 16 мМ NAD, и 32 мкл воды. Хорошо перемешать и выдерживать 5 минут на льду.
  2. Добавьте 1 мкл ДНК-полимеразы I (10 единиц), 0,3 μЛ РНКазы H (1,6 единицы) и 0,5 μЛ ДНК-лигазы E. coli . Перемешайте и выдержите при температуре 16 °C в течение 30 минут.
  3. Немедленно очистите реакцию с помощью парамагнитных шариков с соотношением 1,6х. Элюируйте ДНК в 40 мкл 10 мМ Tris-Cl (pH 8).

6. Этап предбиблиотечной ультразвуковой обработки только для ДНК RE

ПРИМЕЧАНИЕ: Капельная обработка приводит к восстановлению фрагментов РЗ, которые часто имеют длину килобазы и поэтому не подходят для непосредственного создания библиотеки.

  1. Чтобы уменьшить размер материала для построения библиотеки, произведите ультразвуковую обработку иммунопреципитированной ДНК в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл. Выполните 12 циклов по 15 с ВКЛ / 60 с ВЫКЛ на ультразвуковике (отжим после шести циклов для обеспечения однородной ультразвука). Перейдите к шагу 7.
    Примечание: Иммунопреципитированный материал по-прежнему несет трехцепочечные R-петли, которые реагируют на ультразвук иначе, чем фланкирующая двухцепочечная ДНК.
  2. Дополнительный шаг: Чтобы выровнять профили DRIP, обработайте иммунопреципитированный материал 1 мкл РНКазы H в буфере 1x РНКазы H в течение 1 ч при 37 °C перед ультразвуковой обработкой.

7. Строительство библиотеки

  1. Выполните репарацию конца, добавив к 40 мкл на этапе 4.12 (фрагментация РЗ) или стадии 5.3 (сдвиг ультразвуком) 5 мкл 10-кратного буфера модуля репарации концов, 2,5 мкл 10 мМ АТФ и 2,5 мкл фермента модуля репарации конца (всего 50 мкл). Хорошо перемешать и выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Включите 1 г RE-digested and sonicated (DRIP) или sonated (sDRIP) входной ДНК для создания библиотек контрольного секвенирования, соответствующих входной ДНК.
  2. Очистите реакцию с помощью парамагнитных шариков (соотношение 1,6x) и выведите в 34 мкл 10 мМ Tris-Cl (pH 8).
  3. Выполните A-tailing, добавив 5 мкл буфера 2, 10 мкл 1 мМ dATP и 1 мкл экзо- Klenow (всего 50 мкл). Хорошо перемешайте и выдержите смесь в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  4. Очистите реакцию с помощью парамагнитных шариков (соотношение 1,6x) и выведите в 12 мкл 10 мМ Tris-Cl (pH 8).
  5. Лигатные адаптеры путем добавления 15 мкл 2x буфера для быстрого лигирования, 1 мкл 15 мкМ адаптеров и 2 мкл быстрой лигазы (всего 30 мкл). Хорошо перемешать и выдерживать 20 минут при комнатной температуре.
  6. Очистите реакцию с помощью парамагнитных шариков (соотношение 1x) и выведите в 20 мкл 10 мМ Tris-Cl (pH 8).
  7. Если проводили ультразвуковое сканирование и использовали dUTP на этапе 5.1, добавьте 1,5 мкл (1,5 ЕД) урацил N-гликозилазы и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C для получения специфического для нити DRIP.
  8. ПЦР амплигируют 10 мкл библиотеки с шага 6.6 или 6.7. Добавьте 1 мкл праймера для ПЦР 1.0 P5 (см. Таблицу материалов), 1 мкл праймера для ПЦР 2.0 P7 (см. Таблицу материалов), 15 мкл мастер-смеси и 3 мкл воды. Хорошо перемешайте.
  9. В термоамплификаторе запустите программу, как показано в таблице 1.
  10. Приступаем к двухэтапной очистке библиотеки с помощью парамагнитных бусин. Сначала используйте соотношение 0,65x для удаления фрагментов более 500.о. Держите надосадочную жидкость. Приступайте к соотношению 1х на надосадочную жидкость, чтобы удалить фрагменты ниже 200.о. Разбавьте в 12 мкл 10 мМ Tris-HCl (pH 8).

8. Контроль качества

  1. Для проверки обогащения R-петли с помощью qPCR на двух отрицательных и трех положительных локусах методом Pfaffl используйте 1 мкл библиотеки очистки из шага 6.10. Разведите 1 мкл библиотеки в 10 мкл воды и используйте 2 мкл на локус.
  2. Проверьте распределение по размерам очищенной библиотеки из шага 6.10 с помощью высокочувствительного набора ДНК.

Результаты

DRIP, а также sDRIP могут быть проанализированы с помощью количественной ПЦР (рисунок 2A) и/или секвенирования (рисунок 2B). После этапа иммунопреципитации качество эксперимента должно быть предварительно подтверждено с помощью количественн...

Обсуждение

Здесь описаны два протокола для картирования структур R-петли в потенциально любом организме, использующем антитело S9.6. DRIP-seq представляет собой первый разработанный метод полногеномного картирования R-петли. Это простой, надежный и воспроизводимый метод, который поз...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа в лаборатории Чедина поддерживается грантом Национального института здравоохранения (R01 GM120607).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

Ссылки

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716 (2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781 (2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358 (2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446 (2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282 (2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319 (2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394 (2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079 (2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113 (2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84 (2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793 (2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

RDRIP seqSDRIP seqB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены