Скрининговый анализ на лекарственные препараты и лучевую терапию со средней пропускной способностью с использованием органоидов, полученных от пациента

Резюме

Мы подробно описываем протоколы использования органоидов, полученных от пациентов, для скрининга чувствительности терапии со средней пропускной способностью. Тестируемые методы лечения включают химиотерапию, лучевую терапию и химиолучевую терапию. Уровни аденозинтрифосфата используются в качестве функционального считывания.

Аннотация

Модели органоидов, полученных от пациента (PDO), обеспечивают долгосрочную экспансию и поддержание первичных эпителиальных клеток, выращенных в трех измерениях и близком к нативному состоянии. При получении из резецированной или биопсированной опухолевой ткани органоиды тесно повторяют морфологию опухоли in vivo и могут быть использованы для изучения ответа на терапию in vitro. Биобанки опухолевых органоидов отражают огромное разнообразие клинических опухолей и пациентов и, следовательно, имеют большие перспективы для доклинического и клинического применения. В данной работе представлен метод скрининга лекарственных средств со средней пропускной способностью с использованием органоидов плоскоклеточного рака головы и шеи и колоректальной аденокарциномы. Этот подход может быть легко принят для использования с любой моделью органоида, полученного из ткани, как нормальной, так и больной. Описаны методы воздействия на органоиды in vitro в результате химио- и лучевой терапии (либо в виде монотерапии, либо в комбинации). Выживаемость клеток после 5 дней воздействия препарата оценивается путем измерения уровня аденозинтрифосфата (АТФ). Чувствительность к лекарственным препаратам измеряется показателями полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀), площади под кривой (AUC) и темпа роста (GR). Эти параметры могут дать представление о том, считается ли органоидная культура чувствительной или устойчивой к определенному лечению.

Введение

Модели органоидов, созданные из взрослых стволовых клеток и выращенные в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) и специфическом коктейле факторов роста (также известном как органоиды HUB), набирают обороты в качестве платформ для доклинического онкологического скрининга. Культура органоидов, полученных от пациента (PDO), может быть получена из биопсии нормальной и больной ткани в течение 1-2 недель и может быть расширена как минимум на 1-2 месяца до неограниченных промежутков времени. Криоконсервация позволяет в течение длительного времени использовать хорошо охарактеризованные культуры. В отличие от традиционных двумерных моделей клеточных линий, полученных клонально, модели PDO точно повторяют исходную опухолевую ткань, как фенотипически, так и генетически, и сохраняют гетерогенность опухоли. Среднепроизводительный скрининг лекарств на PDO, тестирующий широкий спектр методов лечения, обеспечивает уникальную платформу для персонализированной медицины.

В предыдущих исследованиях было описано использование моделей органоидов для скрининга терапии, в частности, лекарств и лучевой терапии, в моделях, полученных из различных типов опухолей, и показана прогностическая способность органоидов для принятия клинических решений 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . В данной работе описаны методы скрининга онкологической терапии с использованием PDO в средней пропускной способности (рис. 1A). Этот протокол настроен в формате 384-луночных планшетов с полуавтоматизацией, что позволяет проводить терапевтические испытания до восьми моделей органоидов, 16 соединений и до восьми 384-луночных планшетов. Помимо скрининга сложных лекарственных средств, в этой статье также описываются методы анализа чувствительности и сенсибилизации лучевой терапии. Кроме того, обсуждается использование высокопроизводительной робототехники для масштабирования скрининга лекарств до полной автоматизации. Важно отметить, что органоиды из разных тканей могут требовать разных сред и разного обращения.

Здесь описывается общий протокол скринингового анализа на наркотики, который может нуждаться в адаптации в зависимости от исследуемого органоида. В обсуждение включены отправные точки и предложения по оптимизации, а также общие рекомендации по экспериментальной установке и практике использования органоидов. Примеры приведены с использованием органоидов плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC), которые обычно имеют плотную морфологию, и органоидов колоректального рака (CRC), которые могут иметь либо кистозную, либо плотную морфологию. Обратите внимание, что методы создания и культивирования первичных органоидов не охватываются данным протоколом; Для основных методов работы с органоидами читатель должен обратиться к другим протоколам (например, ¹²). Этот визуальный протокол позволит получить представление о процессе скрининга лекарств со средней пропускной способностью с использованием органоидных моделей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием этого протокола, пожалуйста, убедитесь, что вы соблюдаете рекомендации комитета по этике исследований на людях учреждения. Сбор тканей пациента и данных, описанных в этом протоколе, был выполнен в соответствии с рекомендациями EUREC и в соответствии с европейским, национальным и местным законодательством. Все органоиды были получены от пациентов, давших согласие, и согласие может быть отозвано в любое время.

1. Перед скринингом

1. Подтвердите идентичность вновь созданных моделей (например, с помощью гистологии и/или секвенирования ДНК 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11) для исключения возможности нормального избыточного роста клеток и обеспечения проведения скрининга лекарственных препаратов на культурах опухолевых органоидов (см. пример в Рисунок 2D).
2. Спроектируйте экспериментальную настройку пластины, используя общие рекомендации, приведенные в разделе обсуждения (см. пример на дополнительном рисунке S1).
3. Рассчитайте необходимое количество органоидов и подготовьте достаточное количество органоидов, готовых к разделению в день 0 (используйте таблицу 1 в качестве ориентира).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа и модели органоида требуется примерно 1-2 полных 6-луночных планшета для каждого полного 384-луночного просеивающего планшета. Как правило, одна полная лунка 6-луночного планшета содержит ±20 000 кистозных органоидов или до 50 000 плотных/виноградоподобных органоидов.
4. Проверьте, откалиброван ли дозатор клеток с помощью репортерного красителя, и при необходимости выполните калибровку в соответствии с протоколом производителя.

2. Подготовка реагентов

1. Подготовьте базовую среду: продвинутый DMEM/F12+++ (aDF+++). Добавьте по 5 мл 1x заменителя L-глутамина (v/v), 1 M 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазина этанесульфоновой кислоты (HEPES) и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина во флакон 500 мл усовершенствованного DMEM/F12. Храните aDF+++ при температуре 4 °C до 1 месяца.
2. Приготовьте соответствующую среду для расширения органоида (т.е. роста) для используемого типа органоида ^9,10.
3. Подготовьте просеивающую среду, которая может отличаться от расширительной среды в зависимости от экспериментальной установки. Чтобы ускорить восстановление после дозирования органоидов, добавьте 5 мкМ ингибитора рокиназы (ROCK) (Y-27632) в среду для скрининга.
4. Приготовьте раствор Dispase II в концентрации 100 мг/мл в aDF+++.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 100-кратный раствор диспазы стабилен при -20 °C в течение 2 месяцев.

3. День 0: Подготовка органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные ниже объемы начинаются с полной хорошо выращенной 6-луночной пластины органоидов, что эквивалентно 1200 μL органоидов/ECM (200 μL органоидов/ECM на лунку).

1. Осмотрите органоиды с помощью светлопольного микроскопа на предмет возможного инфицирования, плотности и общего внешнего вида; Сделайте снимки всех моделей для справки перед передачей.
2. Пропустите органоиды и семена в соответствии со следующими шагами. Выполняйте эти действия при комнатной температуре, чтобы уменьшить колебания температуры органоидов. При работе с органоидными суспензиями используйте наконечники с низким удерживающим фактором или предварительно смоченные пипетки и пластмассы, чтобы предотвратить потерю органоидов.
   1. При использовании больших объемов ВКМ/органоидов (>1200 мкл ВКМ) рассмотрите возможность расщепления ВКМ с распределением следующим образом, чтобы способствовать удалению органоидов из ВКМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диспаза разрушает ЭКМ, но не влияет на органоиды.
      1. Дополнительно: Добавьте 1 мг/мл раствора в каждую лунку и инкубируйте органоиды в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут перед прохождением, как обычно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку диспаза не инактивируется средними компонентами, смойте ее (используя aDF+++) с добавлением как минимум в 20 раз большего объема диспазы.
   2. Соберите органоиды в три пробирки по 15 мл (до 400 мкл ЭКМ на пробирку). Долейте до 12 мл aDF+++ и центрифугируйте в течение 5 минут при RT при 85 × г. При правильном гранулировании аспирируйте надосадочную жидкость. Если органоиды не имеют четкого гранулирования, центрифугируйте на более высоких оборотах (до 450 × г; в зависимости от типа и размера органоида) в течение дополнительных 5 мин. Снова суспензируйте гранулу и повторите стирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стекловидный слой над гранулой указывает на наличие ЭХМ. Убедитесь, что в ЭКМ нет органоидов, с помощью светлопольного микроскопа (небольшое количество захваченных органоидов может быть приемлемым), и осторожно удалите оставшийся ВКМ с помощью пипетки p1000. Если в ECM присутствует (слишком) много органоидов, повторите этап диссоциации или промойте гранулу и отжмите на более высокой скорости (максимум 450 × g).
   3. Для каждой пробирки объемом 15 мл ресуспендируйте органоидную гранулу в 1 мл aDF+++ и осторожно диссоциируйте органоиды до тех пор, пока они не достигнут нужного размера. Используйте метод диссоциации, который используется для регулярного расщепления, в зависимости от типа/морфологии (табл. 1).
      1. В случае кистозных и виноградоподобных органоидов механически разрушайте их, разрезая на мелкие фрагменты (<100 мкм) путем пипетирования вверх и вниз с помощью p1000 с p2-наконечником сверху, или с помощью предварительно смачиваемой стеклянной закупоренной пипеткой Пастера, кончик которой был сужен в пламени.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите разрушение органоидов с помощью светлопольного микроскопа после пипетирования вверх и вниз каждые 5 раз, стремясь к тому, чтобы органоиды были меньше или в пределах диапазона размеров экрана (Таблица 1).
      2. Для плотных органоидов добавьте 1 мл 50% v/v раствора TrypLE в aDF+++ для ресуспендирования клеточной гранулы и инкубируйте не менее 2 минут при 37 °C. После этого энергично встряхните пробирку вверх и вниз и проверьте под светлопольным микроскопом. Используя тот же подход, что и выше, механически разрушайте органоиды с помощью пипетки, постоянно проверяя под микроскопом на протяжении всего процесса. Органоиды HNSCC инкубировать в 100% растворе TrypLE в течение 5 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа культуры, стремитесь к получению небольших групп клеток (например, органоидов CRC, >20 мкм) или одиночных клеток (например, органоидов HNSCC). Следите за тем, чтобы продолжительность протеолитической инкубации не превышала 15 минут, так как это может повлиять на жизнеспособность органоидов.
   4. Промойте органоиды 10 мл aDF+++. Вращайте органоиды при 85 × г в течение 5 минут; Аспирируйте надосадочную жидкость, если правильно гранулировать. В качестве альтернативы, если органоиды трудно гранулировать, центрифугируйте до 450 × г в течение 5 минут.
   5. Затравочные органоиды с высокой плотностью в среде расширения 50% / 50% ECM (что позволяет легко удалить их из ECM в разделе 4). Стремитесь к примерно двукратной плотности по сравнению с обычным разбиением, что часто приводит к разбиению 1:1 (см. примеры на рисунке 1). Затравите органоиды в каплях объемом 10 мкл (всего 200 мкл на лунку) предварительно подогретого 6-луночного планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите предварительно нагретые пластины в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи или в духовке при температуре 60 °C не менее 1 часа, чтобы обеспечить быстрое затвердевание ECM, предотвращая распространение ECM и, таким образом, обеспечивая правильное формирование полусферического купола.
   6. Переверните планшет и верните его в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут, чтобы дать
   ЭБУ для установки. Через 30-60 мин аккуратно добавьте в лунки расширительную среду (комнатной температуры).

4. День 2 (диапазон: дни 1 - 3): Дозирование органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от органоидного GR, это также может произойти на 1-й или 3-й день. На протяжении всего скрининга препарата органоиды находятся во взвешенном состоянии. Для этого их дозируют в низкой концентрации ВКМ (5-10%), при которой рост органоидов сохраняется, но при этом не происходит затвердевания ВКМ. Это позволяет автоматизировать диспенсирование, оптимальное взаимодействие органоидов и соединений и воспроизводимый лизис клеток, но также ограничивает возможность смены среды.

1. Рассчитайте концентрацию и количество органоидной суспензии, необходимые для скрининга лекарственных средств.
   1. В зависимости от используемого дозатора ячеек учитывайте мертвый объем при расчете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При дозировании 40 мкл органоидной суспензии на лунку, на одну 384-пластину требуется общий объем 15,4 мл. В среднем, каждая пробирка для дозирования ячеек Multidrop имеет мертвый объем ~1 мл, что приводит к 8 мл мертвого объема при использовании всех форсунок. В результате получается в общей сложности 23,4 мл на каждую модель органоида для всего 384-луночного планшета. Таким образом, приготовление 25 мл органоидной суспензии обеспечивает достаточное количество органоидов для диспенсирования плюс для необязательного последующего анализа (однонуклеотидный полиморфизм, SNP) (см. 4.4.7).
2. Подготовка к сбору органоидов
   1. Чтобы приготовить буфер для промывки, добавьте ингибитор ROCK (Y-27632) в aDF+++ до конечной концентрации 10 мкМ. (±100 мл требуется для каждой органоидной культуры, которая будет подвергаться скринингу).
   2. Осмотрите органоиды во всех лунках с помощью светлопольного микроскопа, чтобы оценить восстановление органоидов после пассирования и исключить потенциальные инфекции. Проверьте, имеют ли органоиды правильный размер, сделав микроскопическое изображение и измерив органоиды с помощью цифровой весовой линейки (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если органоиды не имеют правильного размера (слишком большие или слишком маленькие), они будут потеряны в процессе фильтрации, и материала может не хватить для проведения скрининга на наркотики. В этом случае рекомендуется отложить скрининг препарата.
   3. Добавьте 1 мг/мл раствора в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе в течение 30-60 минут (максимум до 120 минут) для переваривания ВКМ. Проверьте ход диссоциации ЭКМ под микроскопом, чтобы увидеть, плавают ли капли ВКМ. Если нет, нанесите содержимое лунки на капли ВКМ, которые должны легко отойти, когда пищеварение будет завершено.
3. Подготовьте органоиды для дозирования в 384-луночный планшет в соответствии со следующими шагами. Выполняйте эти действия при комнатной температуре (включая центрифугирование), чтобы уменьшить колебания температуры органоидов.
   1. Соберите органоидную суспензию из культурального планшета с помощью пипетки p1000.
   2. В зависимости от требуемых этапов фильтрации (в зависимости от типа органоида, см. Таблицу 1) выполните соответствующий шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное смачивание фильтров с промывочным буфером необходимо для предотвращения прилипания органоидов к фильтру.
      1. При включении всех мелких фрагментов и отдельных клеток проводят одиночную фильтрацию, например, для опухолевых органоидов HNSCC, фильтр для органоидов < 70 мкм. Соберите собранные органоиды в пробирку объемом 15 мл и дважды промойте ее 12 мл буфера для промывки. Отфильтруйте органоиды через предварительно увлажненный фильтр 70 мкм в пробирку объемом 50 мл, промойте фильтр 3 x 4 мл aDF+++ и переложите их в пробирку объемом 15 мл. Если объем слишком велик, вращайте при 85 × г в течение 5 минут и переложите гранулу в 12 мл aDF+++ в пробирку объемом 15 мл; Перейдите к пункту 4.3.3.
      2. Проведите двойную фильтрацию для удаления мусора и крупных органоидов, например, для органоидов опухолей CRC, отфильтруйте органоиды >100 мкм и <20 мкм. Немедленно отфильтруйте собранные органоиды через предварительно смоченный фильтр 100/70/40 мкм (Таблица 1) в пробирку объемом 50 мл и промойте фильтр 2 x 10 мл промывочного буфера. Используйте один предварительно увлажненный фильтр 20 мкм на три лунки из 6-луночной пластины органоидов. Отфильтруйте органоиды размером <100 мкм на фильтрах 20 мкм и промойте фильтр 2 x 10 мл промывочного буфера. Извлеките органоиды из фильтра, перевернув его поверх чистой пробирки объемом 50 мл и промойте 3 x 4 мл aDF+++. Перенесите органоидную суспензию в пробирку объемом 15 мл; Если объем составляет >15 мл (так как может потребоваться дополнительная промывка фильтра), отжмите при 85 × г в течение 5 минут и переложите гранулу в 12 мл aDF+++ в пробирку объемом 15 мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды, попавшие в фильтр, могут быть восстановлены для последующего использования (пропуск); На следующем этапе используются органоиды < 100 мкм. Клетки и мусор, прошедшие через фильтр, будут отброшены, органоиды, попавшие в фильтр (>20 мкм, <100 мкм) используются для просеивания.
   3. Центрифугируйте при 450 × г в течение 3 мин и тщательно отсасывайте надосадочную жидкость. Осторожно суспендируйте гранулу в 1 мл просеивающей среды, долейте еще 1-9 мл среды (в зависимости от размера гранулы; стремитесь к ~75-150 органоидов/10 мкл) и повторно суспендируйте путем пипетирования вверх и вниз с помощью предварительно смоченной серологической пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять 5 мкМ ингибитора ROCK в просеивающую среду.
   4. Тщательно перемешайте органоидную суспензию путем пипетирования вверх и вниз с помощью предварительно смоченной серологической пипетки 5x, и подсчитайте количество органоидов в 10 μл суспензии путем пипетирования линии в чашке Петри и подсчета их под микроскопом. Для органоидов меньшего размера (<70 мкм) добавьте 10 мкл органоидной суспензии в 10-камерное предметное стекло с сеткой гемоцитометра и подсчитайте количество органоидов. Рассчитайте количество органоидов/мл в соответствии с инструкциями производителя.
   5. Приготовьте необходимое количество диспенсирующей среды, добавив 5% (v/v) ECM в ледяную просеивающую среду (например, для 25 мл диспенсирующей среды добавьте 1,25 мл ECM к 23,75 мл ледяной просеивающей среды). Добавляйте ECM только в ледяную среду, чтобы предотвратить затвердевание ECM. При скрининге нескольких моделей органоидов подготавливайте диспенсирующую среду в больших количествах, чтобы обеспечить постоянство % ECM для всех моделей.
   6. Добавьте необходимое количество органоидов (см. Таблицу 1 для рекомендаций и обсуждение для примечаний) в новую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 450 × г в течение 3 минут. Осторожно отсадите, не повреждая гранулу, и тщательно повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл просеивающей среды с помощью пипетки p200. Убедитесь, что гранула однородна и полностью ресуспендирована без каких-либо органоидных комков. Затем долейте в суспензию необходимое количество ледяной диспенсирующей среды и в дальнейшем держите органоидную суспензию на льду.
4. Распределите органоиды по 384-луночным планшетам с помощью клеточного дозатора (например, Multidrop).
   1. Настройте дозатор ячеек на дозирование 40 мкл клеточной суспензии на лунку.
      1. Главное меню | Выбор типа пластины | ОК | 384 стандарт | ХОРОШО
      2. Кассетный тип Стандартная ламповая кассета (правая сторона) | выберите объем с помощью стрелок вверх и вниз (40 μл).
      3. Выберите Полная пластина или Столбцы в зависимости от компоновки пластины.
   2. Промойте трубку 70% этанолом (EtOH), а затем стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS); используйте >15 мл на стирку. Дайте немного воздуха между каждой жидкостью, чтобы визуализировать начало и окончание каждой стирки. Проверьте, все ли дозирующие головки дозируют «прямо», и промойте еще раз, когда это не так.
   3. В меню «Настройки » выберите «Предварительное дозирование» и установите значение 60 μL для предварительного дозирования органоидной суспензии после заправки и перед дозированием.
   4. Загрунтуйте диспенсер органоидной суспензией, удерживая суспензию на льду. Ресуспендирование путем непрерывного пипетирования с помощью пипетки p1000. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха в растворе. После того, как пластина будет заполнена и установлена на место, распределите органоиды, нажав кнопку Start.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг легче выполнить, когда два человека выполняют респензию, а другой управляет диспенсером.
   5. При необходимости для каждой модели органоида, включенной в сит, диспонируйте еще не менее 5 лунок в дополнительной просеивающей тарелке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит получить показания T=0 позже в этот день (см. раздел 7 и обсуждение). При желании это дозирование также может быть выполнено вручную.
   6. Немедленно установите на место крышку на плите, чтобы избежать загрязнения лунок. Подтвердите под микроскопом, что все лунки были заполнены правильно, и равномерно ли органоиды распределены по всей пластине.
   7. При необходимости, как только покрытие будет завершено, извлеките органоидную суспензию из трубки (нажмите на «Пусто») и раскрутите оставшиеся органоиды. Переложите в пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте для последующего анализа SNP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если воздух попал в трубку во время дозирования, и некоторые лунки не были заполнены правильно, заполните лунки вручную, добавив 40 μл на лунку.
   8. Если дозировано несколько органоидных моделей, промойте трубку с помощью PBS, EtOH и PBS и повторите шаги 4.4.4-4.4.8 для каждой модели.
   9. Перенесите планшеты в атмосферу с содержанием_CO2 5% в инкубаторе при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к дозированию препарата. Чтобы устранить различия в воздухообмене между разными планшетами, избегайте штабелирования планшетов в инкубаторе.
   10. Как можно скорее очистите трубку с помощью PBS, а затем EtOH. Обязательно полностью высушите трубку, пропустив воздух через систему.

5. День 2 (диапазон: дни 1 - 3): Выдача лекарств с помощью дозатора лекарств (например , D300e)

ЗАМЕТКА:. В зависимости от исследовательского вопроса, печать лекарств также может быть выполнена через один день после посева.

1. Настройка дозатора лекарств
   1. Запустите программное обеспечение диспенсера и выберите нужный формат пластины, используемый для экрана, выделив пластину 1 и выбрав инструмент карандаша , чтобы вызвать редактор пластин.
   2. Выберите тип пластины и установите дополнительный объем каждой лунки (объем жидкости (органоидной суспензии) уже в пластине). Для формата на 384 лунки используйте концентрацию 40 μл/лунка.
   3. На левой панели используйте символ + , чтобы добавить каждый раствор лекарства, который будет использоваться на экране.
   4. Отредактируйте каждую жидкость, выбрав инструмент «Карандаш ». Отредактируйте название препарата, класс препарата (например, на основе ДМСО или водный (например, вода, PBS)) и исходную концентрацию препарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 10 мМ исходной концентрации каждого препарата. В идеале максимальная концентрация растворителя должна составлять 0,8% для ДМСО и 3% для PBS/0,3% моющего средства (например, Tween) (см. нормализацию ниже и обсуждение).
   5. После того, как все лекарства добавлены в программу, выберите лунки для добавления лекарств, выделив лунку на схеме планшета и перетащив ее поперек. Щелкните правой кнопкой мыши по выбранным лункам, и добавьте концентрацию.
      1. Установите значение для определения желаемой концентрации каждого препарата (μM).
      2. Для титрования определите желаемую максимальную и самую низкую концентрацию каждого лекарственного препарата (μM), распределение (логарифмическое или линейное), количество повторений на уровень (например, 3) и характер титрования.
      3. Для таргетного титрования определите самую высокую и самую низкую концентрацию каждого препарата, распределение (логарифмическое или линейное), целевую концентрацию (мкМ), целевую область (уровни), целевую область (уровни), целевую дальность (логарифм), репликации на уровень (например, 3) и схему титрования.
   6. Нормализуйте все лекарственные лунки до соответствующего растворителя (например, ДМСО или водный + Tween-20). Для лекарственных препаратов, растворенных в водных растворах, добавьте Tween-20 (конечная концентрация 0,3% в запасе лекарственного средства) для обеспечения соответствующего поверхностного натяжения раствора лекарственного средства для дозирования с помощью D300e (см. 5.2.6). Выберите все скважины, в том числе без лекарств (отрицательный контроль), щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Нормализация», затем «Нормализовать». Выберите подходящий растворитель и выберите Нормализовать до максимального класса объема , чтобы нормализовать до максимальной концентрации выбранного лекарства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Черные треугольники теперь появляются в нижнем левом углу каждой скважины для подтверждения нормализации. Стремитесь иметь не менее 6 (в идеале >9) отрицательных контрольных лунок для каждого используемого растворителя препарата.
   7. Выберите минимум 3 лунки (в идеале >6) для использования известных цитотоксических реагентов, таких как ставроспорин, в качестве положительного контроля (1-5 мкМ) в зависимости от культур. Если цитотоксическая концентрация положительного контроля неизвестна, выбирайте высокую концентрацию, чтобы убить все органоиды в положительных контрольных лунках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, Навитоклакс (20 мкМ) может быть использован для обеспечения гибели органоидов во время скрининга лекарственных препаратов.
   8. После того, как раскладка пластин будет завершена, выберите «Выполнить » (если машина включена) в верхнем левом углу. Сохраните протокол для продолжения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время программа рассчитала необходимый объем каждого препарата для выдачи. Поскольку это включает в себя ошибку пипетирования, это точное количество препарата, необходимое для всего протокола. Необязательно: При выборе Simulate будет смоделирован весь протокол (без добавления лекарств), чтобы наблюдать, как будет работать протокол. В режимах «Прогон » и «Симуляция » создается отчет, в котором будет задокументировано время, порядок и объемы лекарств, добавленных в каждую скважину. Это может быть полезно для того, чтобы убедиться в правильности протокола и определить точный объем и количество кассет, которые потребуются перед началом эксперимента.
2. Готовим и печатаем лекарства
   1. Добавьте 0,3% (v/v) Tween-20 в водные (например, воду или PBS) лекарственные средства, чтобы обеспечить соответствующее поверхностное натяжение раствора лекарственного средства для дозирования с помощью D300e. Убедитесь, что концентрация Tween-20 не превышает 3% PBS/0,3% Tween-20 (v/v), и поддерживайте конечную концентрацию Tween-20 ниже 0,01%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте Tween-20 в запасы лекарств только непосредственно перед добавлением его в кассету для принтера для лекарств, так как высокая концентрация Tween-20 в запасе потенциально инактивирует (белковые) препараты (например, препараты на основе антител). Этот шаг не требуется для препаратов, растворенных в ДМСО; однако следите за тем, чтобы конечный процент ДМСО в каждой скважине не превышал 0,8-1%.
   2. Подготовьте кассеты D8+ для малого объема и D4+ для большого объема. Установите флажок Использовать кассеты большого объема в программе при использовании больших объемов нормализующей жидкости.
   3. Запустите протокол, чтобы начать выдачу лекарств.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа будет выполнять протокол поэтапно и указывать, когда и сколько каждого соединения необходимо добавить. Используйте фильтрующие наконечники для работы с препаратами с высокой концентрацией. Будьте осторожны при утилизации химических отходов и использованных советов, соблюдая правила биобезопасности.
   4. После завершения протокола используйте адгезивные воздухо- и водопроницаемые пломбы (например, полиуретановые медицинские пломбы; Таблица материалов) чтобы накрыть пластины, и верните пластины до 37 °C, 5%_CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этих уплотнений предотвращает испарение «краевого эффекта» (см. обсуждение). Если пломбы не используются, убедитесь, что внешние края пластины не используются при скрининге препарата. Не ставьте тарелки друг на друга и убедитесь, что пластины расположены ближе к задней части инкубатора, или используйте инкубатор, который не открывается (часто), чтобы избежать колебаний температуры.
   5. Если лучевая терапия сочетается с печатными препаратами, перейдите к разделу 6. Если нет, оставьте пластины в инкубаторе на 5 дней.
      Примечание: В зависимости от типа органоида и типа препарата, некоторые эксперименты могут занять более 5 дней. Для экспериментов продолжительностью >7 дней следует осторожно менять среду и соединения в середине экспериментальной процедуры (например, путем замены 50% среды свежей средой для скрининга), чтобы избежать обширной гибели клеток в отрицательных контрольных лунках.

6. День 2 (диапазон: дни 2 - 4): Лечение органоидов с помощью излучения фотонных пучков

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают облучение органоидов. Для оценки радиосенсибилизирующего действия лекарственных соединений облучение проводят через 24 ч после того, как органоиды подверглись химиотерапии. Тот же протокол используется для оценки эффектов только облучения, при котором органоиды засеваются и облучаются через 24 ч после посева. Это может потребовать некоторой оптимизации в зависимости от гипотезы и органоидных культур. Следующие шаги описывают процесс, используемый для облучения органоидов с использованием специально сгенерированных пучков фотонов мощностью 6 МВ (Таблица материалов). Эта машина оптимизирована для клинического применения и, следовательно, отражает реальную клиническую практику. Для разных машин может потребоваться разная настройка, а также может потребоваться оптимизация дозирования, поскольку эффективная доза может отличаться от выбранной.

1. Извлеките пластины из инкубатора при температуре 37 °С, и верните крышки на каждую пластину поверх уплотнителей; Не снимайте пломбы. Возьмите с собой пластину 0 Гр в этом процессе, чтобы убедиться, что контрольная пластина подвергалась одинаковым условиям.
2. Транспортируйте органоиды к облучателю. Установите облучатель, наполнив пластиковый ящик теплой водой из-под крана, и закрепите в держателе пластины, чтобы пластина не всплывала.
3. Погрузите тарелку в воду так, чтобы вода была на уровне верхней поверхности тарелки. Зафиксируйте пластину на месте с помощью приспособления, которое не позволяет пластине плавать (как показано на видео). Выйдите из комнаты и облучайте планшеты в возрастающих дозах (например, 1, 2, 4, 6, 8 и 10 Гр). Облучайте только одну пластину за раз, так как стопка пластин не позволяет обеспечить равномерное рассеивание излучения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбраны соответствующие дозы облучения для достижения кривой «доза-реакция».
4. Тщательно просушите пластины после облучения салфетками, и установите на место жесткую крышку. Транспортируйте тарелки обратно в комнату для культуры. Снимите жесткую крышку и протрите внешнюю сторону каждой пластины слегка распыленными салфетками EtOH. Не снимайте дышащие уплотнители.
5. Поместите пластины в заднюю часть инкубатора, чтобы избежать колебаний температуры из-за открытия дверцы; Не складывайте тарелки друг на друга.

7. День 2. Опция: Измерительная пластина CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay (CTG) T=0 (требуется для анализа GR)

1. Если вы хотите рассчитать метрики GR (см. пункт 11.3.5 и обсуждение), измерьте значения CTG в табличке T=0, выполнив шаги 9.1-10.4.

8. За сутки до скрининга лекарственных средств: подготовка

1. Рассчитайте общий необходимый объем CTG. Для 384-луночного планшета используйте 40 μл CTG на лунку (добавьте CTG 1:1 в соответствии с рекомендацией производителя). Учитывайте мертвый объем для многокаплеевого дозирования (1 мл на пробирку). Разморозьте CTG в течение ночи при температуре 4 °C, в защищенном от света месте.
2. Проверьте, требуется ли калибровка дозатора.

9. День 7 (диапазон: дни 7 - 14): Показания скрининга на наркотики: анализ КТГ

1. Дайте КТГ нагреться до комнатной температуры. Перед считыванием визуально осмотрите все лунки 384-луночного планшета, запишите, не произошли ли какие-либо инфекции.
2. Визуализируйте соответствующие лунки под светлопольным микроскопом. Включайте положительный контроль (ставроспорин), отрицательный контроль (нормализующие лунки) и наивысшую концентрацию каждого препарата.
3. Вымойте и загрунтуйте многокапельную машину в соответствии с инструкциями, описанными в разделе 4.4. Нанесите 40 μL CTG в каждую лунку в соответствии с настройкой планшета. Встряхивайте с помощью встряхивателя диспенсера Multidrop (Shake) в течение 5 минут и инкубируйте при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 25 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция CTG является ферментативной реакцией и, таким образом, зависит от температуры и времени инкубации. Сигнал предположительно стабилен в течение 30-60 минут; однако использование одинакового времени инкубации для всех планшетов, особенно при расчете метрик GR, повышает точность.

10. Измерения биолюминесценции КТГ

1. Включите считыватель биолюминесцентных пластин емкостью 384 лунки и компьютер. Здесь был использован считыватель искровых пластин.
2. Откройте программу для редактора методов Spark (см. Таблицу материалов). Выберите формат пластины: COS384fb-Corning 384 плоский черный | без крышки | без кассеты с влажностью; Выберите скважины, которые необходимо измерить.
3. В левом нижнем меню выберите Обнаружение | Люминесценция, и перетащите под пластину. Тип: затухание, второе меню: нет. Установите время интеграции [мс]: 500.
4. Поместите пластину, выберите ее и запустите метод, нажав на кнопку «Пуск». Сохраните экспортированную таблицу.

11. Анализ данных

1. Рассчитайте Z-фактор (Z') для оценки качества экрана.
   1. Рассчитайте среднее значение (Av) и стандартное отклонение (SD) как отрицательного (Ctrl^neg, например, DMSO), так и положительного (Ctrl^pos, например, Staurosporine) контроля.
   2. Вычислите Z-фактор = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      Примечание: Z' выражает изменение в пределах положительного и отрицательного контроля и ратиометрическое пространство между положительным и отрицательным контролем и, следовательно, является мерой динамического диапазона пробы¹³. Исключить результаты скрининга лекарственных препаратов с коэффициентом Z ниже 0,3; рекомендуется использовать данные с Z' > 0,5. Среднее значение Z' обычно колеблется от 0,5 до 0,7 (в зависимости от используемых моделей органоидов). Для того, чтобы Z' был информативным, все органоиды в положительных контрольных лунках должны были погибнуть.
2. Рассчитайте относительную жизнеспособность органоидов для каждой скважины, установив Ctrl^neg на 100% и Ctrl^pos на 0% жизнеспособности.
   1. Используйте эту формулу для расчета жизнеспособности органоидов.
      Жизнеспособность органоида = 100% × (значение экспериментальной лунки - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Для облученных органоидов рассчитайте процентное значение.
         Процент жизнеспособности органоидов = 100% × (значение экспериментальной лунки x ГР) / (Av Ctrl^{отрицательное} значение лунки 0 ГР)
   2. Визуализируйте данные в программном обеспечении для анализа данных, скопировав данные о жизнеспособности в таблицу xy, выбрав соответствующее количество повторяющихся значений для каждой концентрации.
   3. Для логарифмических концентраций лекарств преобразуйте концентрации лекарств и скопируйте эти значения в первый столбец таблицы.
   4. Чтобы отформатировать график, выберите тип графика (XY), выберите стандартную ошибку среднего значения (SEM) и установите начало координат в левом нижнем углу.
3. Определите относительный IC₅₀, площадь под кривой (AUC) и метрики GR.
   1. Для нелинейной регрессии на вкладке Анализ выберите Аппроксимировать кривую с помощью нелинейной регрессии. Выберите опцию log (ингибитор) vs. нормализованный отклик - переменный наклон для создания кривой убийства.
   2. Перейдите на вкладку «Результаты », чтобы отобразить относительный IC₅₀ для каждого препарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это концентрация препарата, которая дает ответ на полпути между нижней и верхней частью кривой. Нижняя и верхняя части представляют собой плато в единицах измерения оси y.
   3. Для площади под кривой (AUC) на вкладке Анализ выберите Площадь под кривой, используйте предопределенные настройки и нажмите кнопку ОК.
   4. Нажмите на вкладку «Результаты », чтобы отобразить AUC (общую площадь) для каждого препарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AUC — это интегрированное измерение измеряемого эффекта, которое используется в качестве кумулятивного измерения эффекта лекарства. Для некоторых молекул, таких как антитела, кривая «доза-ответ» не имеет сигмоидальной формы, и значения IC₅₀ трудно интерпретировать. В такой ситуации значения AUC могут предоставить больше информации в качестве метрики для сравнения различий между органоидными линиями.
   5. В качестве альтернативы, если измерения CTG проводятся на 2-й день (необязательные шаги 4.4.5 и раздел 7), рассчитайте метрики GR. Анализируйте метрики ГР с помощью онлайн-калькулятора ГР¹⁴, принимая во внимание различия в скорости распространения между моделями органоидов по всему скринингу лекарственных препаратов, чтобы обеспечить более воспроизводимые и чувствительные измерения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Целью данного эксперимента было изучение чувствительности органоидов HNSCC к химиотерапии и лучевой терапии в качестве отдельных агентов. Мы также проверили воспроизводимость результатов, выполнив эксперимент несколько раз с интервалом в неделю, в результате чего бы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье и видео описывается, как проводить скрининг лекарств со средней пропускной способностью с использованием PDO. Этот протокол, при оптимизации, может быть принят для скрининга органоидов, полученных из различных типов тканей, описанных здесь. Определение и?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel