JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой сравнение двух различных протоколов индукции для дифференциации стволовых клеток пульпы зубов человека (hDPSC) к линиям поджелудочной железы in vitro:интегративный протокол и неинтегративный протокол. Интегративный протокол генерирует больше инсулин-продуцирующих клеток (IPC).

Аннотация

По состоянию на 2000 год успех трансплантации островков поджелудочной железы с использованием протокола Эдмонтона для лечения сахарного диабета I типа все еще сталкивался с некоторыми препятствиями. К ним относятся ограниченное число трупных доноров поджелудочной железы и долгосрочное использование иммунодепрессантов. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) считаются потенциальным кандидатом в качестве альтернативного источника генерации островковых клеток. Наши предыдущие доклады успешно проиллюстрировали создание индукционных протоколов для дифференциации стволовых клеток пульпы зубов человека (hDPSC) к инсулин-продуцирующие клетки (IPC). Однако эффективность индукции сильно варьировалась. В этой статье мы демонстрируем сравнение эффективности индукции поджелудочной железы hDPSC с помощью интегративных (микроэкологические и генетические манипуляции) и неинтегративных (микроэкологические манипуляции) протоколов индукции для доставки IPC, полученных из hDPSC (hDPSC-IPCs). Результаты показывают различную эффективность индукции для обоих подходов индукции с точки зрения 3-мерной колониальной структуры, выхода, маркеров мРНК поджелудочной железы и функционального свойства при многодозовом вызове глюкозы. Эти результаты будут поддерживать будущее создание клинически применимой платформы для производства IPC и линии поджелудочной железы.

Введение

Сахарный диабет является постоянной глобальной проблемой. В докладе Международной федерации диабета (IDF) подсчитано, что глобальная распространенность диабета увеличится со 151 миллиона в 2000 году до 415 миллионов в 2015году 1,2. Последнее эпидемиологическое исследование предсказало, что предполагаемая распространенность диабета во всем мире увеличится с 451 миллиона в 2017 году до 693 миллионов в 2045году1. Успех трансплантации островков поджелудочной железы с использованием протокола Эдмонтона был впервые продемонстрирован в 2000 году, когда было показано, что он поддерживает эндогенную выработку инсулина и стабилизирует нормогликемическое состояние у пациентов с диабетом I типа3. Тем не менее, применение протокола Эдмонтона по-прежнему сталкивается с проблемой узкого места. Ограниченное количество трупных доноров поджелудочной железы является основной проблемой, поскольку каждому пациенту с диабетом I типа требуется не менее 2-4 островковых доноров. Кроме того, длительное применение иммунодепрессантов может вызвать опасные для жизни побочные эффекты4,5. Чтобы решить эту проблему, разработка потенциальной терапии диабета в последнее десятилетие в основном была сосредоточена на генерации эффективных инсулин-продуцирующих клеток (IPC) из различных источников стволовых клеток6.

Стволовые клетки стали альтернативным методом лечения многих заболеваний, в том числе диабета I типа, который вызван потерей бета-клеток. Трансплантация МПК является новым перспективным методом контроля уровня глюкозы в крови у таких пациентов7. В данной статье представлены два подхода к генерации IPC, интегративные и неинтегтивные индукционные протоколы. Протокол индукции имитировал естественный процесс развития поджелудочной железы, чтобы получить зрелые и функциональные IPC8,9.

Для этого исследования hDPSC были охарактеризованы проточной цитометрией для обнаружения поверхностных маркеров MSC, многолинейным дифференцированным потенциалом и RT-qPCR для определения экспрессии свойства стволовости и пролиферативных маркеров генов (данные не показаны)8,9,10. hDPSC были индуцированы к окончательным эндодерме, эндодерме поджелудочной железы, эндокринным и панкреатическим бета-клеткам или IPC(рисунок 1),соответственно7. Чтобы индуцировать клетки, в качестве основного протокола использовался трехступенчатый индукционный подход. Этот протокол получил название неи интегративного протокола. В случае интегративного протокола существенный фактор транскрипции поджелудочной железы, PDX1,был переэкспрессирован в hDPSC с последующей индукцией сверхэкспрессированного PDX1 в hDPSC с использованием трехступенчатого протокола дифференциации. Разница между неимте интегративным и интегративным протоколом заключается в сверхэкспрессии PDX1 в интегративном протоколе, а не в неите интегративном протоколе. Дифференциация поджелудочной железы сравнивалась между интегративными и неигративными протоколами в этом исследовании.

протокол

Эта работа была выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрена Комитетом по этике исследований человека, факультет стоматологии Университета Чулалонгкорн. Человеческие DPSC (hDPSC) были выделены из тканей пульпы зубов человека, извлеченных как из премоляров, так и из моляров из-за проблем с зубами мудрости. Информированное согласие было получено от пациентов по утвержденному протоколу (HREC-DCU 2018/054).

1. Интегративный индукционный протокол

  1. Получение лентивирусного вектора, несущего PDX1
    1. Используйте человеческие эмбриональные почки (HEK) 293FT клетки для вирусной упаковки. Культивировать и поддерживать эти клетки в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 1% L-глутамином и 1% антибиотиком-антимикотиком.
    2. Генерация PDX1-лентивирусныхвекторов путем совместной трансфекции 10 мкг каждой из плазмид упаковки и оболочки и 20 мкг целевой плазмиды гена в клетки HEK293FT с использованием системы трансфекции фосфата кальция, например, psPAX2, pMD2. G, и человеческий pWPT-PDX111. Убедитесь, что клетки на 80%-90% сливаются во время инфекции.
    3. Собирают среду, содержащую лентивирусные частицы, через 48 и 72 ч после трансфекции.
    4. Фильтровать собранную среду через фильтр 0,45 мкм; концентрировать вирусы центробежным фильтром при номинальном отсечке молекулярной массы 100 кДа (НМЗКО).
  2. Сверхэкспрессия PDX1
    1. Используйте проход 3-5 hDPSC, которые на 70-80% сливаются. Трипсинируйте и подсчитывайте ячейки с помощью счетчика ячеек. Посейте 1 x 106 hDPSC на 60 мм тканевую культуру посуды и инкубируют в течение ночи.
    2. Через 24 ч добавляют свежие вирусные частицы, полученные на стадии 1.1.4, для трансдукции предварительно обработанных полибренов клеток (4 мкг/мл полибрена, 30 мин при 37°С и 5% CO2)при желаемой кратности инфекции (MOI). Например, в данном случае используется МВД 20. Выдерживают клетки в инкубаторе клеточных культур в течение 24 ч при 37 °C с 5% CO2.
    3. После 24-х ч периода заражения выбросьте среду, содержащую вирусные частицы. Добавьте свежие культуральная среда и продолжайте выращивать клетки в течение 48 ч. Все культуры поддерживаются при 37 °C и 5% CO2.
    4. Проверьте агрегированную морфологию трансфекционных клеток, прежде чем перейти к этапу индукции. Трансдукция PDX1 подтверждается анализом экспрессии генов(Дополнительный рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте морфологию клеток под микроскопом, прежде чем переходить к следующим шагам.
    5. Соберите и перейдите к трехступенчатой индукционной протоколе (этап 1.3) в качестве подхода к микроэкологии.
  3. Трехступенчатый индукционный протокол
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трехступенчатый протокол индукции привел к серии дифференцировки поджелудочной железы hDPSC к окончательной эндодерме, эндодерме поджелудочной железы / эндокринным и бета-клеткам / IPC поджелудочной железы с использованием безывороточной среды (SFM)-A, SFM-B и SFM-C, соответственно.
    1. Выбрасывают питательную среду, а затем промывают трансдуцированные hDPSC 1x фосфат-буферным раствором (PBS).
    2. Добавляют к клеткам 0,25% раствор трипсина-ЭДТА и инкубируют в течение 1 мин при 37 °C, 5% CO2.
    3. Добавьте культурную среду, чтобы остановить активность трипсина, и осторожно промыть клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте клетки и аликвот 1 х 106 клеток в каждую собирающей трубку.
    4. Центрифугируют клеточную суспензию при 468 х г (относительная центробежная сила: RCF), 4 °C, в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и сохраните ячейку гранулы.
    5. Повторно суспендируют гранулу в 3 мл первой индукционной среды поджелудочной железы, т.е. безсыворочной среды (SFM)-A. Засеять клетки на культурную пластину с низким прикреплением (60 мм). Поддерживайте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Понаблюдайте за морфологией клеток под инвертным микроскопом, прежде чем перейти к следующему шагу.
    6. Удалите SFM-A и добавьте 3 мл второй индукционной среды, т.е. SFM-B. Выдерживая клетки в течение следующих 2 дней при 37 °C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Понаблюдайте за морфологией клеток под инвертным микроскопом, прежде чем перейти к следующему шагу.
    7. Удалите SFM-B и добавьте 3 мл третьей индукционной среды, т.е. SFM-C. Поддерживайте клетки в течение следующих 5 дней в инкубаторе клеточных культур, поддерживаемом при 37 °C с 5% CO2. Меняйте среду каждые 48 ч. Наблюдать их морфологию через 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая индукционная среда дополняется различными реагентами, как описано; SFM-A: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS), 4 нМ активина А, 1 нМ бутирата натрия и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS и 0,3 мМ таурина; и SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 мМ таурина, 100 нМ глюкагоноподобных пептидов (GLP)-1, 1 мМ никотинамида и 1x ненезаменимых аминокислот (NEAA).
    8. Обязательно проверяйте морфологию клеток под инвертным микроскопом после каждого шага. Клетки станут более агрегированными и будут плавать как колонии.
    9. Соберите колонии клеток для дальнейшего анализа. Проверьте морфологию и размер колонии. Выполнение анализа экспрессии генных маркеров поджелудочной железы и функционального анализа (анализ секреции С-пептида, стимулируемого глюкозой).

2. Неинте интегративный индукционный протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Неинтегративный протокол является магистральный протокол для доставки IPC с трехступенчатым процессом индукции в качестве подхода микроэкологии индукции8,9.

  1. Используют пассаж 3-5 hDPSC при 70%-80% конфлюции.
  2. Выбросьте питательную среду и промыть hDPSC 1x PBS.
  3. Добавьте 0,25% раствор трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать в течение 1 мин при 37 °C, 5% CO2.
  4. Добавьте культурную среду, чтобы остановить активность трипсина, и осторожно пипетку клеток, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте ячейки и аликвоты 1 х 106 клеток в каждую коллекционную трубку.
    1. Центрифугировать клеточную суспензию при 468 х г (RCF), 4 °C, 5 мин. Выбросьте супернатант.
    2. Повторно суспендируют гранулы в SFM-A и высевываем на культурную пластину с низким креплением (60 мм). Культивькуйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 дней. Проверьте морфологию клеток под инвертным микроскопом.
    3. Удалите SFM-A, добавьте SFM-B (день 3), а затем поддерживайте клетки в течение следующих 2 дней при 37 °C, 5% CO2.
    4. Удалите SFM-B, добавьте SFM-C (день 5), а затем поддерживайте клетки в течение следующих 5 дней при 37 °C, 5% CO2. SFM-C меняется каждые 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая индукционная среда дополняется различными реагентами, как описано; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 нМ активина А, 1 нМ бутирата натрия и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS и 0,3 мМ таурина; и SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 мМ таурина, 100 нМ GLP-1, 1 мМ никотинамида и 1x NEAA.
    5. Обязательно проверяйте морфологию клеток под инвертным микроскопом после каждого шага и на 10-й день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки станут более агрегированными и будут плавать как колонии.
    6. Соберите колонии клеток для дальнейшего анализа. Проверьте морфологию и размер колонии. Выполнение анализа экспрессии генных маркеров поджелудочной железы и функционального анализа (анализ секреции С-пептида, стимулируемого глюкозой).

Результаты

В этой статье сравнивались результаты обоих протоколов индукции. Диаграммы обоих протоколов индукции проиллюстрированы на рисунке 2A,C. В обоих протоколах оценка проводилась под световым микроскопом, а изображения анализировались с помощью ImageJ. hDPSC смогли сфор...

Обсуждение

Достижение более высокого производства IPC из МСК играет важную роль в терапии диабета. Критические этапы интегративного протокола зависят от качества клеток, которые будут использоваться для трансдукции, и качества трансдуцированных клеток. Некоторые клеточные требования, которые до...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

SK, WR и QDL были поддержаны Отделом исследований ветеринарных стволовых клеток и биоинженерии, Фондом пожертвований Ratchadaphiseksomphot, Университетом Чулалонгкорн. TO и PP были поддержаны Chulalongkorn Academic Advancement в егопроекте 2-го века. CS был поддержан грантом, поддерживающий исследования факультета ветеринарных наук, академического продвижения Chulalongkorn в его проекте2-го века, Ветеринарного исследовательского подразделения стволовых клеток и биоинженерии, Фонда пожертвований Ratchadaphiseksomphot, Университета Чулалонгкорн и Государственного исследовательского фонда.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific Corporation, USA15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture DishCorning®430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific Corporation12800017
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Corporation10270106
GlutaMAX™Thermo Fisher Scientific Corporation35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4Sigma-AldrichP3813-10PAKOne pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific Corporation25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal FilterMerck Millipore, USAUFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmidAddgene12256Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µmMerck MilliporeSLHV033RB
pMD2.G plasmidAddgene12259Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerck MilliporeTR-1003-G
psPAX2 plasmidAddgene12260Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human ProteinMerck MilliporeGF300
Beta-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific Corporation21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)Sigma-AldrichA6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1Sigma-AldrichG3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Invitrogen41400-045
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)Thermo Fisher Scientific Corporation11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mmEppendorf30701011
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
TaurineSigma-AldrichT0625

Ссылки

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
  3. Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
  4. Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
  5. Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
  6. Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
  7. Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
  8. Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
  9. Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
  10. Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
  11. Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
  12. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
  13. Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
  14. Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
  15. Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
  16. Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
  17. Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
  18. Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
  19. Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
  20. Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
  21. Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
  22. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  23. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  24. Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
  25. Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
  26. Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
  27. Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
  28. Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
  29. Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
  30. Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
  31. Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
  32. Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175IPChDPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены