JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол маркировки небольших внеклеточных везикул, полученных из макрофагов, красителями PKH и наблюдаем их поглощение in vitro и в спинном мозге после интратекальной доставки.

Аннотация

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой везикулы 50-150 нм, секретируемые всеми клетками и присутствующие в жидкостях организма. sEV переносят биомолекулы, такие как РНК, белки и липиды, от донорских к акцепторным клеткам, что делает их ключевыми сигнальными медиаторами между клетками. В центральной нервной системе (ЦНС) sEV могут опосредовать межклеточную сигнализацию, включая нейроиммунные взаимодействия. Функции sEV могут быть изучены путем отслеживания поглощения меченых sEV в клетках-реципиентах как in vitro, так и in vivo. В данной работе описывается маркировка sEV из кондиционированных сред клеток макрофагов RAW 264.7 с использованием мембранного красителя PKH. Он показывает поглощение различных концентраций меченых sEV в несколько временных точек клетками Neuro-2a и первичными астроцитами in vitro. Также показано поглощение sEV, доставляемых интратекально в нейроны спинного мозга мыши, астроциты и микроглию, визуализированные конфокальной микроскопией. Репрезентативные результаты демонстрируют зависящие от времени вариации в поглощении sEV различными клетками, что может помочь подтвердить успешную доставку sEV в спинной мозг.

Введение

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные, мембранные везикулы с диапазоном размеров 50-150 нм. Они происходят из многовезикулярных тел (MVB) и высвобождаются из клеток при слиянии MVB с плазматической мембраной. sEV содержат миРНК, мРНК, белки и биологически активные липиды, и эти молекулы переносятся между клетками в форме межклеточной связи. sEV могут быть интернализованы клетками-реципиентами различными эндоцитарными путями, и этот захват sEV клетками-реципиентами опосредован распознаванием поверхностных молекул как на EV, так и на клетках-мишенях1.

sEV приобрели интерес из-за их способности вызывать молекулярные и фенотипические изменения в акцепторных клетках, их полезности в качестве терапевтического агента и их потенциала в качестве носителей для грузовых молекул или фармакологических агентов. Из-за их небольшого размера визуализация и отслеживание sEV могут быть сложными, особенно для исследований in vivo и клинических условий. Поэтому было разработано много методов для маркировки и изображения sEV, чтобы помочь их биораспределению и отслеживанию in vitro и in vivo2.

Наиболее распространенный метод изучения биораспределения sEV и взаимодействия клеток-мишеней включает их маркировку флуоресцентными молекулами красителя3,4,5,6,7. Электромобили были первоначально помечены красителями клеточной мембраны, которые обычно использовались для изображения клеток. Эти флуоресцентные красители обычно окрашивают липидный бислой или белки, представляющие интерес на sEV. Несколько липофильных красителей демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль, включая DiR (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид), DiL (1, 1'-диоктадецил-3, 3,3', 3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат) и DiD (1, 1'-диоктадецил-3, 3', 3'-тетраметилиндокарбоцианин 4-хлорбензолсульфонатная соль)8,9,10,11.

Другие липофильные красители, такие как PKH67 и PKH26, имеют высокофлуоресцентную полярную головную группу и длинный алифатический углеводородный хвост, который легко интеркалируется в любую липидную структуру и приводит к долгосрочному удержанию красителя и стабильной флуоресценции12. Красители PKH также могут маркировать EV, что позволяет изучать свойства EV in vivo13. Многие другие красители были использованы для наблюдения экзосом с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, включая липидные красители14 и клеточно-проницаемые красители, такие как карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFDA-SE)15,16 и кальцеин ацетоксиметил (AM) эфир17.

Исследования sEV-опосредованных перекрестных помех между различными клетками в ЦНС дали важную информацию о патогенезе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний18. Например, sEV из нейронов могут распространять бета-амилоидные пептиды и фосфорилированные тау-белки и помогать в патогенезе болезни Альцгеймера19. Кроме того, EV, полученные из эритроцитов, содержат большое количество альфа-синуклеина и могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать патологии Паркинсона20. Способность sEV пересекать физиологические барьеры21 и переносить свои биомолекулы в клетки-мишени делает их удобными инструментами для доставки терапевтических препаратов в ЦНС22.

Визуализация поглощения сЭВ мириадами клеток ЦНС в спинном мозге позволит как механистические исследования, так и оценить терапевтические преимущества экзогенно вводимых sEV из различных клеточных источников. В данной работе описана методология маркировки sEV, полученных из макрофагов, и изображения их поглощения in vitro и in vivo в поясничном спинном мозге нейронами, микроглией и астроцитами для качественного подтверждения доставки sEV путем визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Дрекселя. Беременных мышей CD-1 использовали для астроцитарной культуры, а все дамы получали через 15 дней после оплодотворения. Десятидвустинедельные мыши C57BL/6 использовались для экспериментов по поглощению in vivo.

1. Выделение sEV из клеток макрофагов RAW 264.7

  1. Культивируем RAW 264,7 клеток в колбахпо 75 см2 в среде, обедненной экзосомами DMEM, содержащей 10% истощенной экзосомой фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (pen-strep) в течение 24-48 ч.
  2. Собирают 300 мл кондиционированной среды и центрифуги при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Собирают супернатант и центрифугу при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  4. Переложите супернатант в центрифужные трубки, центрифугу в течение 35 мин при 12 000 × г при 4 °C.
  5. Соберите супернатант и отфильтруйте через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
  6. Переложить в ультрацентрифужные трубки и центрифугу в течение 80 мин при 110 000 × г при 4 °C.
  7. Хранят надосадочный (экзосомно-обедненную среду), повторно суспендируют гранулу в 2 мл 1x фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) и центрифугу в течение 1 ч при 110 000 × г при 4 °C.
  8. Повторное суспендирование гранулы в 100 мкл PBS для дальнейшей характеристики с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM) или в буфере радиоиммунопреципитации (RIPA) для западного блоттинга.

2. Характеристика sEV

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Распределение по размерам и количество частиц/концентрация очищенных sEV из raw 264.7 клеток измеряли с помощью NTA.
    1. Разбавьте sEV в отфильтроованных PBS, чтобы получить 20-60 везикул на поле зрения для оптимального отслеживания.
    2. Введите разбавленный образец в проточную ячейку с помощью шприцевого насоса с постоянным расходом.
    3. Возьмите 3-5 видео по 30 с каждое. Установите выдержку и коэффициент усиления, а также вручную сфокусировать настройки камеры, чтобы максимальное количество везикул было видно и можно было отслеживать и анализировать.
    4. Переместите образцы между каждой записью, чтобы выполнить повторные измерения. Оптимизируйте настройки NTA после сбора и сохраняйте постоянные настройки между образцами.
    5. Проанализируйте каждое видео с помощью программного обеспечения NTA, чтобы получить средний размер и концентрацию везикул.
    6. Выполняйте все измерения NTA с одинаковыми настройками системы для согласованности.
  2. Вестерн блот
    1. Количественно оцените общее количество белка в sEV, клеточных лизатах и средах, обедненных экзосомами, используя набор для анализа белка в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Для приготовления клеточного лизата культивируют RAW 264,7 клетки в колбы 75см2 до 80-90% слияния. Отсоедините клетки с 0,25% трипсином в течение 10-15 мин, нейтрализуйте трипсин культуральной средой и гранулируйте клетки, вращаясь при 400 × г в течение 5 мин. Повторное суспендирует клетки в свежей питательной среде.
    3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и перенесите 1 × 106 клеток в другую трубку. Промыть клетки PBS дважды, используя те же условия центрифугирования, что и выше, и добавить 50 мкл буфера лизиса (буфер RIPA с добавлением коктейля ингибитора протеазы) в гранулу клетки из конечного отжима.
    4. Вихрьте клетки и держите их на льду в течение 20 минут. Подвергают смесь центрифугированию при 10 000 × г в течение 30 мин при 4°С, собирают надотворный (т.е. лизат) в свежих микроцентрифужных пробирках и держат при температуре −80°С до использования.
    5. Сконцентрируйте 2 мл истощенной экзосомой среды до 100 мкл с помощью центробежных фильтров 3 кДа перед количественной оценкой количества белка. Смешайте sEV с буфером лизиса в соотношении 1:1, вихрем в течение 30 с и инкубируйте на льду в течение 15 минут, чтобы количественно оценить количество белка.
    6. Смешайте равное количество белка (2 мкг) sEV, RAW 264,7 клеточного лизата и экзосомной среды с уменьшающим буфером образца.
    7. Денектюры образцов при 95 °C в течение 5 мин, держите их на льду в течение 5 мин и вращайте в течение 2 мин при 10 000 × г. Загрузите образцы на 12% протеиновый гель Tris-glycine и запустите гель при 125 В в течение 45 минут.
    8. Перенос белка на мембрану поливинилидендифторида (PVDF) при 25 В в течение 2 ч.
    9. После переноса блокируют PVDF мембраны блокирующим буфером (см. Таблицу материалов)на 1 ч при комнатной температуре.
    10. Инкубируют пятно с первичными антителами на шейкере в течение ночи при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичными антителами были анти-CD81 (1:1000), анти-альфа-1,3/1,6-маннозилтрансфераза (ALG-2)-взаимодействующий белок X (Alix) (1:1,000), анти-Calnexin (1:1,000) и антиглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) (1:1,000).
    11. Промывайте пятна 3 х 15 мин 1x Tris-буферным физиологическим раствором, 0,1% Tween 20 (TBST), и инкубировать при комнатной температуре с козьей антимышей IgG-пероксидазой хрена (HRP) или ослиными анти-кроликами IgG-HRP-конъюгированных вторичными антителами (1:10,000) в течение 1 ч на шейкере.
    12. Промывайте пятна 3 x 15 мин с 1x TBST и обнаруживайте белки с помощью субстрата HRP.
    13. Анализируйте пятна путем усиления хемилюминесценции с помощью западного блот-томообразователь.
  3. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ)
    1. Фиксируют sEV путем повторного их повторного усыновливки в 2% параформальдегиде (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ); вихрь для 2 х 15 с.
    2. Поместите каплю 10 мкл суспензии sEV на чистую парапленку. Поставьте сетку с углеродным покрытием на каплю с покрытой стороной, обращенной к подвеске. Дайте мембранам впитаться в течение 20 минут в сухой среде.
    3. Поместите сетки (мембранную стороной вниз) на каплю ПБ для мытья в течение 3 х 2 мин.
    4. Переложить сетки до 50 мкл 1% глутарового альдегида в течение 5 мин.
    5. Промыть сетки 100 мкл дистиллированной воды в течение 8 х 2 мин.
    6. Сравните образец, поместив сетки на каплю 1% уранилацетата в течение 2 мин.
    7. Вставить образец с 50 мкл 0,2% уранилацетата с 2% раствором метилцеллюлозы в течение 10 мин на покрытую парапленкой ледяную посуду.
    8. Используйте петли из нержавеющей стали для удержания сеток и удаления лишней жидкости с помощью фильтровальной бумаги.
    9. Высушите сетку на воздухе в течение 10 минут, находясь на петле.
    10. Наблюдают под просвечиванием электронного микроскопа при 80 кВ.

3. Маркировка sEV

  1. Разбавить 20 мкг sEV в 1 мл буфера разбавителяющего средства или такой же объем PBS в 1 мл буфера разбавителяющего средства для контроля красителя.
  2. Разбавить 3 мкл красителя PKH67 или PKH26 в 1 мл буфера разбавителяющего растворителя и перемешать путем пипетирования.
  3. Добавьте разбавленный краситель PKH к разбавленным sEV и перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Для контроля красителя смешайте разбавленный краситель с разбавленным PBS из шага 3.1.
  4. Добавьте 2 мл 1% бытового сывороточного альбумина (BSA) в PBS в пробирку с красителем и смесью sEV и в контрольную трубку красителя для поглощения избытка красителя.
  5. Центрифуга в течение 1 ч при 110 000 × г при 4 °C. Откажитесь от супернатанта, повторно суспендировать гранулу в 2 мл PBS и центрифугу в течение 1 ч при 110 000 × г при 4 °C. Повторите стирку с PBS и повторно суспендируйте помеченные sEV или регулятор красителя в равном объеме PBS.
  6. Количественно оценить количество общего белка по методу Брэдфорда.

4. Поглощение sEV клетками Neuro-2a

  1. Поместите 18-миллиметровые крышки в 12-скважинную пластину и пластину 10 × 104 клеток Neuro-2a в каждой скважине в общей сложности 1 мл полной среды DMEM, содержащей 10% FBS и 1% стрептококка.
  2. Изменение среды на среду, обедненную экзосомами DMEM, когда слияние клеток составляет 80-90%. Добавьте 1, 5 или 10 мкг меченых sEV в каждую скважину в течение 1, 4 и 24 ч для дозо- и временного поглощения или добавьте равный объем контроля красителя.

5. Первичные астроцитарные культуры

  1. Обезболить 4 послеродового щенка через 4 дня после рождения, вызывая гипотермию.
  2. Соберите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяной сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), дополненный 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислотой (HEPES).
  3. Рассекните обе корковые доли и удалите орешетки. Измерзь тканей стерилизованным лезвием.
  4. Переложить ткани в коническую трубку 15 мл, содержащую буфер диссоциации папаин/дезоксирибонуклеазу I, и инкубировать в течение 20 мин при 37 °C. Закручивать каждые 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 4 коры мышей 9 мл 7,5 Ед/мл папаина в HBSS активируют при 37 °C в течение не менее 30 мин, фильтруют через шприцевой фильтр 0,22 мкм и смешивают с дезоксирибонуклеазой I до конечной концентрации 0,1 мг/мл.
  5. Аспирировать супернатант и добавить 5 мл полного DMEM для инактивации активности фермента. Тщательно тритурировать, чтобы диссоциировать ткани, с помощью 5 мл стеклянной серологической пипетки и огнеполированной пипетки Пастера.
  6. Пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм и центрифугируют клетки при 250 × г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать среду и засеять клетки в 10 мл полного DMEM в колбу 75см2. Замените надводную среду 15 мл свежей среды DMEM через 4 ч после нанесения покрытия.
  7. Через 14 дней in vitroпереведите колбу на орбитальный шейкер для отсоединения микроглии и олигодендроцитов при 320 об/мин в течение 6 ч.
  8. Трипсинизируют оставшиеся астроциты с помощью 5 мл фермента диссоциации клеток(Таблица материалов)в течение 10 мин при 37 °C. Добавляют 5 мл полного DMEM для инактивации ферментативного действия и гранулируют клетки при 250 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  9. Повторное суспендирование клеток в полном DMEM. Семена 5 × 104 ячейки на 12 мм #1,5 крышки в 24-скважинной пластине.

6. Поглощение sEV астроцитами

  1. Когда астроциты достигнут 80-90% слияния, измените среду на ДМЭМ-обедненную экзосомную среду.
  2. Добавьте к ячейкам 1 мкг немаркированных, меченых sEV, равный объем элемента управления красителем или PBS. Используйте клетки для окрашивания через 1 ч и 24 ч после лечения сВВ.

7. Иммунофлуоресценция

  1. Промыть ячейки PBS 3x и зафиксировать их 4% PFA в ПБ в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть неподвижные ячейки 3 х 5 мин пБ и проместить их с помощью 0,1% Тритона Х-100 в ПБ в течение 10-15 мин и промыть ПБ 3 х 5 мин.
  3. Блокируют клетки с 5% нормальной козьей сывороткой (NGS) в ПБ в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Инкубировать клетки с первичными антителами: микротрубоче-ассоциированным белком 2 (MAP2A, 1:500) для клеток Neuro-2a или глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP, 1:500) для первичных астроцитов в свежих 5% NGS/PB на ночь при 4 °C с мягким встряхиванием.
  5. Промыть 3 х 10 мин ПБ и добавить флуорофорно-конъюгированные вторичные антитела (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; или Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) в 5% NGS и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на коромысле.
  6. Промыть 3 х 10 мин пБ и инкубировать с 1 мкг/мл ядерного пятна 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 10 мин при комнатной температуре. Снова промыть ячейки 3x с ПБ.
  7. Установите крышки на слайды No1 с помощью антизатухающего монтажного носителя. Дайте им высохнуть ночью в темноте и храните подготовленные стеклянные слайды при 4 °C до визуализации на конфокальном микроскопе.

8. Поглощение sEV in vivo

  1. Выполняют интратекальную инъекцию 5 мкг немаркированных или меченых sEV, повторно суспендированных в 10 мкл PBS, или равного объема (10 мкл) контрольного красителя (как приготовлено в разделе 3) мышам C57BL/6.
  2. Через 6 и 18 ч после инъекции sEV глубоко обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 100 мг/кг массы тела кетамина и 10 мг/кг массы тела ксилазина.
  3. Выполняйте внутрисердечную перфузию мышей с 0,9% физиологического раствора для вымывания крови, а затем свежеприготовленную ледяную 4% PFA / PB.
  4. Рассектать спинной мозг и зафиксировать в 4% PFA/PB при 4 °C в течение 24 ч. Криозащита тканей в 30% сахарозе в ПБ при 4 °C в течение 24 ч или до тех пор, пока ткани не опустятся. Хранить ткани при 4 °C до иммуногистохимии.

9. Иммуногистохимия

  1. Встраивание L4-L5 спинного мозга в соединение O.C.T. Заморозить на сухом льду до полного затвердеть.
  2. Разделите ткани на 30 мкм (поперечное сечение для спинного мозга) с помощью криостата и соберите срезы в 24-скважинную пластину, содержащую ПБ. Промыть секции 3 х 5 мин с 0,3% тритона в ПБ.
  3. Блокируют неспецифические сайты связывания с 5% NGS в 0,3% Тритона/ПБ в течение 2 ч при комнатной температуре.
  4. Разбавляют первичные антитела: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1000), Iba1 для микроглии (1:2000) с 5% NGS в 0,3% Тритона/ПБ и инкубируют срезы в течение ночи при 4 °C на шейкере.
  5. Промыть секции 3 х 5 мин 0,3% тритона/ПБ и добавить вторичные антитела (Ослик Против Кролика IgG Alexa Fluor 488, 1:500 или Козий Анти-Мышиный IgG Alexa Fluor 488, 1:500) в 5% NGS/PB в течение 2 ч при комнатной температуре.
  6. Промыть 3 х 5 мин с ПБ и инкубировать секции в 1 мкг/мл DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть секции 3 х 5 мин ПБ.
  7. Установите секции на чистый клейкий слайд(Таблица материалов)тонкой кистью под световым микроскопом.
  8. Смочите крышку монтажной средой. Вылечить на ночь в темноте при комнатной температуре.
  9. Изображение под конфокальным микроскопом с соответствующими лазерами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После выделения sEV из кондиционированных сред RAW 264.7 с помощью центрифугирования NTA использовали для определения концентрации и распределения по размерам очищенных sEV. Средний размер RAW 264.7-производных sEV составлял 140 нм, а пиковый размер частиц составлял 121,8 нм, подтверждая, что большинст...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе мы показали маркировку sEV красителями PKH и визуализацию их поглощения в спинном мозге. Липофильные флуоресцентные красители PKH широко используются для маркировки клеток с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии3,5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами NIH NINDS R01NS102836 и Департаментом здравоохранения Пенсильвании Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE), присужденными Сиене К. Аджит. Мы благодарим доктора Брэдли Нэша за критическое прочтение рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filtersMilliporeSigmaZ677094
Anti-Alix AntibodyAbcamab1864291:1000
Anti-Calnexin AntibodyAbcamAb102861:1000
Anti-CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)Cell Signaling Technology21181:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AntibodySigma-AldrichMAB3601:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 AntibodyWako019-197411:2000
Anti-MAP2A AntibodySigma-AldrichMAB3781:500
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332
Cell Strainer, 40 μmVWR15-1040-1
Centrifuge TubesThermo Scientific3118-005012,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5Electron Microscopy Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µg/mL
DC Protein AssayBio-Rad500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Abcamab162841:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Double Frosted Microscope Slides, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS without Calcium and MagnesiumCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine SerumGibcoA27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M imaging systemProteinSimple
FV3000 Confocal MicroscopeOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)Abcamab67891:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-211251:500
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
HRP SubstrateThermo Scientific34094
Intercept blocking buffer, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 systemMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
O.C.T CompoundSakura Finetek4583
PapainWorthington Biochemical CorporationNC9597281
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific1862209
PVDF Transfer MembraneMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell LineATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sodium ChlorideAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48adhesive slides
T-75 FlasksCorning431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron MicroscopeFEI Company
TEM GridsElectron Microscopy SciencesFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE ExpressGibco12605028cell dissociation enzyme
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsin, 0.25%Corning25-053-CL
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Ultracentrifuge TubesBeckman344058110,000 x g

Ссылки

  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81(2021).
  5. Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108(2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171PKH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены