Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов

Резюме

Здесь мы описываем метод визуализации синаптогенеза гранулярных нейронов в мозжечке мыши в течение периода постнатального развития мозга, когда эти клетки уточняют свои синаптические структуры и образуют синапсы, чтобы интегрироваться в общую цепь мозга.

Аннотация

Нейроны претерпевают динамические изменения в своей структуре и функционируют во время развития мозга, образуя соответствующие связи с другими клетками. Мозжечок грызунов является идеальной системой для отслеживания развития и морфогенеза одного типа клеток, мозжечкового гранулярного нейрона (CGN), во времени. Здесь in vivo была использована электропорация предшественников гранулярных нейронов в развивающемся мозжечке мыши для редкой маркировки клеток для последующего морфологического анализа. Эффективность этого метода продемонстрирована в его способности демонстрировать ключевые стадии развития созревания CGN с особым акцентом на формирование дендритных когтей, которые представляют собой специализированные структуры, в которых эти клетки получают большую часть своих синаптических входов. В дополнение к предоставлению снимков синаптических структур CGN на протяжении всего развития мозжечка, этот метод может быть адаптирован для генетического манипулирования гранулярными нейронами клеточно-автономным образом для изучения роли любого интересующего гена и его влияния на морфологию CGN, развитие когтей и синаптогенез.

Введение

Развитие мозга - это длительный процесс, который простирается от эмбриогенеза до постнатальной жизни. В течение этого времени мозг интегрирует комбинацию внутренних и внешних стимулов, которые формируют проводку синапсов между дендритами и аксонами, чтобы в конечном итоге направлять поведение. Мозжечок грызунов является идеальной модельной системой для изучения того, как развиваются синапсы, потому что развитие одного типа нейронов, мозжечкового гранулярного нейрона (CGN), можно отслеживать, когда он переходит от клетки-предшественника к зрелому нейрону. Отчасти это связано с тем, что большая часть коры мозжечка развивается постнатально, что позволяет легко проводить генетические манипуляции и маркировку клеток после рождения¹.

У млекопитающих дифференцировка CGN начинается в конце эмбрионального развития, когда подмножество пролиферативных клеток в заднем мозге мигрирует через ромбическую губу, образуя вторичную зародышевую зону на поверхности мозжечка ^2,3,4. Несмотря на то, что они полностью привержены идентичности предшественника гранулярных нейронов (GNP), эти клетки продолжают пролиферировать во внешней части внешнего слоя гранул (EGL) до 14-го дня после рождения (P14). Пролиферация этого слоя приводит к массивному расширению мозжечка, поскольку эти клетки дают начало исключительно CGN⁵. Как только новорожденные CGN выходят из клеточного цикла в EGL, они мигрируют внутрь к внутреннему слою гранул (IGL), оставляя после себя аксон, который раздваивается и перемещается в молекулярном слое мозжечка, образуя параллельные волокна, которые синапсы на клетках Пуркинье⁶. Положение этих волокон в молекулярном слое зависит от времени выхода из клеточного цикла.

CGN, которые дифференцируются первыми, оставляют свои параллельные волокна к нижней части молекулярного слоя, тогда как аксоны CGN, которые дифференцируются позже, группируются в верхней^{части 7,8}. Как только клеточные тела CGN достигают IGL, они начинают развивать дендриты и образовывать синапсы с близлежащими тормозными и возбуждающими нейронами. Зрелое дендритное дерево CGN демонстрирует стереотипную архитектуру с четырьмя основными процессами. В ходе созревания CGN структуры на концах этих дендритов образуют коготь, который обогащается постсинаптическими белками ^9,10. Эти специализированные структуры, называемые дендритными когтями, содержат большинство синапсов на гранулярных нейронах и важны для получения как возбуждающих входов от иннерваций мшистых волокон, происходящих из моста, так и ингибирующих входов от местных клеток Гольджи. После полной настройки синаптические связи CGN позволяют этим клеткам передавать входные сигналы от предмозжечковых ядер к клеткам Пуркинье, которые проецируются из коры мозжечка в глубокие ядра мозжечка.

Постнатальная электропорация GNP in vivo является преимуществом по сравнению с другими методами, основанными на маркировке, такими как вирусная инфекция и генерация трансгенных линий мышей, поскольку экспрессия желаемых конструкций может быть достигнута в короткие сроки, и метод нацелен на небольшую популяцию клеток, что полезно для изучения клеточно-автономных эффектов. Этот метод использовался в предыдущих исследованиях для изучения морфологического развития CGN; Однако эти исследования были сосредоточены либо на одном моменте времени, либо на коротком промежутке времени 9,10,11,12,13. Этот метод маркировки был сопряжен с анализом изображений для документирования изменений в морфологии CGN, которые происходят на протяжении всего периода дифференцировки CGN в течение первых трех недель постнатальной жизни. Эти данные раскрывают динамику развития дендритов CGN, лежащих в основе построения мозжечковых контуров.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Дьюка.

1. Подготовка ДНК для электропорации in vivo или IVE (за 1 день до операции)

1. Соберите следующие материалы: очищенную ДНК (0,5-25 мкг на животное), 3 М ацетат натрия, этанол, краситель Fast Green, сверхчистую дистиллированную воду, фосфатный буферный раствор (PBS) (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ДНК конструкция, экспрессирующая зеленый флуоресцентный белок (GFP) под человеческим промотором убиквитина, была получена из Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/). Любая конструкция, экспрессирующая GFP или другой флуоресцентный белок под контролем вездесущего промотора, должна работать. CGN-специфическая маркировка с помощью этого метода зависит не от конструкции, а скорее от электропорации.
2. Подготовьте ДНК к электропорации, смешав желаемое количество ДНК, 10% по объему 3 М ацетата натрия и 250% по объему 100% ледяного этанола. Обратите внимание, что ДНК немедленно выпадет в осадок из раствора.
3. Продолжайте осаждать смесь ДНК в течение ночи при -20 ° C или в течение часа при -80 ° C.
4. Гранулы осаждают ДНК в настольной центрифуге в концентрации >16 000 × г и дважды промывают 70% этанолом.
5. Дайте гранулам ДНК полностью высохнуть и восстановите их в 1x PBS + 0,02% растворе Fast Green.

Рисунок 1: Ограничение глубины впрыска до 1,5 мм с помощью прокладки. (A) Сегмент диаметром 11,2 мм отрезается от загрузочной пипетки с помощью бритвенного лезвия. (B) Прокладка устанавливается на наконечник шприца Hamilton (общая длина составляет 1,27 см или 0,5 дюйма) и закрепляется либо клеем, либо парапленкой. Открытый наконечник должен быть 1,5 мм в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Электропорация предшественников гранулярных нейронов in vivo у семидневных постнатальных мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции по электропорации проводились в стерильном хирургическом отделении с высокой вентиляцией, и весь персонал носил полные средства индивидуальной защиты, включая перчатки, маску для лица, чепчик для волос, халат и бахилы. Кроме того, операции могут проводиться в вентилируемом и стерильном капюшоне.

1. Соберите следующие материалы: ДНК для электропорации, небольшие хирургические ножницы, небольшие хирургические пинцеты, индивидуальный шприц Hamilton, аппликатор с ватным наконечником, грелка, бетадин, 70% этанол, 1x PBS, парапленка, тканевый клей (цианоакрилат н-бутилового эфира), изофлуран, электропоратор и электроды пинцетного типа (см. Таблицу материалов).
2. Отрежьте прокладку от стерилизованного загрузочного наконечника, чтобы она поместилась над шприцем Hamilton, чтобы ограничить глубину впрыска до 1.5 мм (рис. 1A, B). Закрепите прокладку клеем или парапленкой.
3. Анестезируют щенка P7 в изофлурановой камере со скоростью доставки 0,8 л/мин. Подтвердите полную анестезию, наблюдая за животным на предмет снижения дыхания и отсутствия реакции на ущипывание пальца ноги или хвоста (рис. 2A).
4. После того, как животное будет полностью обезболено, поместите щенков на пьедестал, оснащенный носовым конусом, доставляя постоянный 4% изофлуран со скоростью доставки 0,8 л / мин. Очистите верхнюю часть головы щенка 3 раза стерильным тампоном бетадина, затем 70% этанола, чередуя их, чтобы подготовить место. Дайте раствору высохнуть, прежде чем продолжить.
5. Используя стерилизованные ножницы, сделайте небольшой разрез с одним разрезом, который охватывает расстояние от верхней части до основания ушей, чтобы открыть задний мозг (рис. 2B).
6. Найдите мозжечок (рис. 2C), вставьте открытый наконечник шприца Гамильтона через череп, перпендикулярно мозгу, и введите 1,5 мкл смеси ДНК в паренхиму мозжечка, медленно нажимая на задний поршень шприца. После доставки смеси ДНК медленно потяните иглу назад, чтобы предотвратить обратный разлив, и дайте раствору ДНК диффундировать в течение 30 с.
7. Выключите изофлуран и поместите щенка на грелку с температурой 37 °C. Подготовьте электрод пинцетного типа к электропорации, погрузив оба конца в стерильный 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивание электрода пинцетного типа предотвратит контактные ожоги кожи щенка во время введения электрических импульсов.
8. Направьте пинцет-электрод над местом инъекции плюсовым концом вниз, а отрицательным — над головой животного (рис. 2D). Подайте пять электрических импульсов от электропоратора со следующими настройками: межимпульсный интервал 50 мс, 130 В и 950 мс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости выполните пробную инъекцию, чтобы убедиться, что место инъекции расположено на червях мозжечка (рис. 2E).
9. Зажмите разрез и запечатайте рану нетоксичным тканевым клеем на основе цианоакрилата н-бутилового эфира. Очистите рану 70% этанолом, так как любое следовое количество крови увеличивает вероятность родительского детоубийства и каннибализма.
10. Дайте животному восстановиться на грелке с температурой 37 °C, прежде чем возвращать щенка на плотину. Наблюдайте за щенком каждые 30 минут в течение не менее 2 часов после операции, чтобы обеспечить полное выздоровление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Детоубийство одним из родителей является довольно распространенным явлением. Чтобы предотвратить каннибализм, поместите отца в другую клетку перед началом электропорации и всегда возвращайте очищенных и восстановленных щенков (т. е . без пятен крови, полностью подвижных) в исходную клетку на оригинальной подстилке. Щенков также можно протирать пометом из оригинальной клетки, чтобы свести к минимуму запах крови. Использование суррогатной плотины может быть необходимо, если первоначальная плотина продолжает пожирать своих детенышей.

Рисунок 2: Электропорация мозжечка in vivo предшественников гранулярных нейронов у детенышей мышей дикого типа P7. (A) Детенышей анестезируют 4% изофлураном, доставляемым со скоростью 0,8 л / мин, чтобы обеспечить анестезию на протяжении всей инъекции раствора ДНК. Изофлуран доставляется со скоростью 0,8 л/мин. (B) После 3-кратной стерилизации мыши бетадином и 70% этанолом делается разрез, который охватывает расстояние до ушей, обнажая задний мозг. (C) Увеличенное изображение белого разграничения на черепе, ориентира для места инъекции. Конструкцию ДНК следует вводить в пределах 1 мм выше отметки; Пунктирными линиями обозначена демаркация, а черной стрелкой обозначено место инъекции. Гребни червя мозжечка могут быть видны и могут быть полезны для поиска места инъекции. (D) Ориентация электрода пинцетного типа для эффективной электропорации. Плюс (+) конец должен быть ориентирован вниз, чтобы втянуть отрицательно заряженную ДНК в паренхиму мозжечка перед введением электрических импульсов. (E) Тестовая инъекция 1 мкл 0,02% красителя Fast Green показывает, что инъекция локализуется в середине червя мозжечка между дольками 5-7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Иммуногистохимия электропорированных ХГН

1. Соберите следующие материалы: изофлуран, 1x PBS, 4% параформальдегид (PFA), 30% сахарозы, нормальная козья сыворотка, неионогенное моющее средство, предметные стекла, стеклянные покровные стекла, лак для ногтей, монтажные материалы, ядерный краситель Hoechst и соответствующие первичные и вторичные антитела (см. Таблицу материалов).
2. Обезболите подопытное животное изофлураном и подтвердите полную анестезию защемлением пальца ноги и хвоста.
3. Выполните транскардиальную перфузию, медленно вводя 1x PBS и 4% PFA в левый желудочек сердца животного. Дайте крови стечь животному, разрезав полую вену.
4. Зафиксируйте мозг на ночь, погрузив его в 4% PFA при 4 ° C. На следующий день быстро промойте мозг 1x PBS и переведите мозг в 30% сахарозу в 1x PBS для криозащиты в течение не менее 24 часов.
5. При необходимости разрежьте мозг пополам вдоль рострально-каудальной оси и подтвердите экспрессию трансфицированной репортерной конструкции с помощью вертикального флуоресцентного препарирующего микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мозг погруженным в 1x PBS в небольшой посуде, чтобы предотвратить его высыхание.
6. Установите мозг на замораживающий микротом, нарежьте сагиттальные срезы размером 25 мкм и дайте срезам развернуться в смеси 1: 1 из 1x PBS и глицерина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы можно хранить в этом растворе криопротектора при температуре -20 °C для длительного хранения.
7. Промойте срезы три раза в 1x PBS в течение 10 мин каждый, чтобы удалить криопротектор, и заблокируйте ткань в 1x PBS + 10% нормальной козьей сыворотки + 0,2% неионогенного моющего средства на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. Приготовьте первичный раствор антител: 1x PBS, 10% нормальная козья сыворотка, 0,2% неионогенное моющее средство и антитело против GFP и центрифугируйте раствор в течение 5 минут при >16 000 × г. Инкубируют срезы в растворе антител при 4 °С на орбитальном шейкере в течение 48 ч.
9. Смойте раствор первичных антител в течение 15 мин пять раз 1x PBS + 0,2% неионогенным моющим средством.
10. Приготовьте раствор вторичных антител: 1x PBS, 10% нормальная козья сыворотка, 0,2% неионогенное детергент и соответствующее вторичное антитело для обнаружения GFP; центрифугируют раствор при >16 000 × г. Инкубируют срезы в растворе антител на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Защищайте срезы от воздействия света, чтобы предотвратить обесцвечивание.
11. Смойте раствор вторичных антител три раза 1x PBS + 0,2% неионогенным моющим средством в течение 15 мин каждый раз. Инкубируйте срезы в 1x PBS + Hoechst в течение 5 минут, чтобы окрасить ядра.
12. Смойте раствор Hoechst 1x неионогенным моющим средством PBS + 0,2% и установите на предметные стекла. Накройте секции монтажным материалом, закройте слайды и запечатайте слайд лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение.

4. Морфологический анализ CGN - трехмерная (3D) реконструкция и площадь поверхности и клеточный объем

1. Изображение одиночных электропорированных CGN на конфокальном микроскопе с 63-кратным объективом с 2-кратным увеличением, получение изображений z-стека со скоростью 0,5 мкм на стек. Изображение по одной ячейке в окне изображения, чтобы упростить анализ и реконструкцию изображения.
2. Установите подключаемый модуль Simple Neurite Tracer для FIJI, используя следующую ссылку (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), чтобы легко и эффективно отслеживать структуру электропорированных CGN в трехмерном (3D) пространстве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует обновленная версия плагина (https://imagej.net/SNT).
3. Анализируйте длину нейритов и образование дендритных когтей вслепую с помощью Simple Neurite Tracer. Загрузите одноканальные z-stack изображения электропорированных CGN на FIJI и нажмите « Плагины» | Сегментация | Простой индикатор нейритов (рис. 3D).
4. Откройте выпадающее меню и выберите Create New 3D Viewer (рисунок 3D).
5. Прокрутите до основания дендрита, где он соединяется с клеточной сомой и начните путь, нажав на соединение. Вручную проведите трассировку пути, щелкнув участки, где сигнал заполнения ячейки наиболее яркий, нажав [y], чтобы сохранить трассировку. Проследите до конца дендрита, если он не содержит когтя, или до основания когтя и подтвердите путь, нажав [f] (рис. 4D).
6. Затем проследите коготь, начав путь у основания конструкции и проследив до конца самого длинного нейрита. Для трассировки вторичных и третичных ветвей нажмите на путь, удерживая нажатой клавишу [ctrl] в Windows или [alt] в Mac OS. Подтвердите путь, нажав [f].
7. Обратите внимание, что измерения следов видны на отдельном окне; Сложите все измерения ветвей когтей (первичные, вторичные, третичные), чтобы получить общую длину каждого когтя.
8. Для анализа площади поверхности и ячеистого объема электропорированных CGN загрузите программное обеспечение для анализа клеток Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
   ПРИМЕЧАНИЕ: FIJI также можно использовать для реконструкции ячеек в 3D из изображений z-stack с использованием легкодоступных и бесплатных плагинов. Кроме того, в Simple Neurite Tracer есть функция объемного рендеринга, но Imaris использовался по причинам, изложенным ниже.
9. Загрузите z-stack изображение электропорированного CGN на Imaris. Чтобы получить доступ к набору инструментов 3D-реконструкции, нажмите Surpass.
10. Чтобы восстановить CGN, нажмите клавишу «Поверхности» и выберите интересующую область, охватывающую всю ячейку в окне изображения. Когда закончите, нажмите синюю стрелку вперед в правом нижнем углу в разделе «Создать».
11. Если изображение содержит несколько каналов для разных сигналов, выберите канал, содержащий электропорированную CGN, и нажмите синюю стрелку вперед.
12. С помощью ползунка установите нужный порог, который наиболее точно соответствует сигналу электропорированной ячейки. Увеличьте масштаб ближе к поверхности ячейки, чтобы точно определить порог. После завершения нажмите двойную зеленую стрелку, чтобы реконструировать ячейку и получить площадь поверхности и размер тома из метаданных.

Рисунок 3: Иммуногистохимический анализ и трехмерная реконструкция электропорированных гранулярных нейронов. Мышей P7 CD-1 подвергали электропорации конструкцией, экспрессирующей GFP. Мозг был собран и подвергнут иммуногистохимии, конфокальной микроскопии и 3D-реконструкции для морфологического анализа. (A) Временная шкала от электропорации до обработки изображений мыши с разрешением 10 точек на дюйм. (B) Максимальное проекционное изображение сагиттального поперечного сечения электропорированного мозжечка 10-DPI; Белые линии разграничивают мозжечковые слои, а масштабная линейка составляет 25 мкм. (C) Максимальное проекционное изображение одного электропорированного гранулированного нейрона 10-DPI и соответствующего 3D-следа, масштабная линейка составляет 10 мкм. (D) 3D-реконструкции были сгенерированы с помощью плагина FIJI Simple Neurite Tracer. Все измерения были прослежены через z-стек по сигналу заполнения ячейки. Измерения ствола и когтя были прослежены отдельно для каждого дендрита; Пунктирная линия обозначает часть дендрита в текущей плоскости. Сокращения: 3D = трехмерный; GFP = зеленый флуоресцентный белок; DPI = дни после инъекции; PSD-95 = белок постсинаптической плотности 95; GNP = предшественники гранулярных нейронов; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Рисунок 4: Анализ морфологии гранулярных нейронов в процессе развития мозжечка. (A) Максимальные проекционные изображения электропорированных CGN от 3 до 14 точек на дюйм (постнатальный возраст от P10 до P21), яде...

Обсуждение

Мозжечковые гранулярные нейроны являются наиболее распространенными нейронами в мозге млекопитающих, составляя почти 60-70% от общей популяции нейронов в мозге грызунов ^1,14. Мозжечок широко использовался для выяснения механизмов клеточной пролиферации, ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Betadine	Purdue Production	67618-150-17
Cemented 10 µL needle	Hamilton	1701SN (80008)	33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style
Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	AB16901	Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration
Cotton-tip applicator
Donkey anti-chicken Cy2	Jackson ImmunoResearch	703-225-155	Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration
Ethanol (200 proof)	Koptec	V1016
Electroporator ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0052
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
FUGW plasmid	Addgene	14883
Glass slides	VWR	48311-703	Superfrost plus
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Heating pad	Softheat
Hoescht 33342 fluorescent dye	Invitrogen	62249
Imaris	Bitplane
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Micro cover glass	VWR	48382-138
Nail polish	Sally Hansen	Color 109
Normal goat serum	Gibco	16210064
O.C.T. embedding compound	Tissue-Tek	4583
Olympus MVX10 Dissecting Scope	Olympus	MVX10
P200 pipette reach tip	Fisherbrand	02-707-138	Used for needle spacer
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS pH 7.4 (10x)	Gibco	70011-044
Simple Neurite Tracer	FIJI		https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions
Sucrose	Sigma	S0389
Surgical tools	RWD Life Science		Small scissors and tweezers
Triton X-100	Roche	11332481001	non-ionic detergent
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489	5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Vectashield mounting media	Vectashield	H1000
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Zeiss 780 Upright Confocal	Zeiss	780