JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Усадка зубного цемента во время отверждения смещает опорную плиту. Этот протокол минимизирует проблему, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента, который оставляет место для цементирования опорной плиты. Несколько недель спустя опорная плита может быть зацементирована в положении на этом каркасе с использованием небольшого количества нового цемента, тем самым уменьшая усадку.

Аннотация

Нейробиологи используют миниатюрные микроскопы (минископы) для наблюдения активности нейронов у свободно ведущих себя животных. Команда Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) предоставляет открытые ресурсы для исследователей для создания минископов самостоятельно. Минископ V3 UCLA является одним из самых популярных минископов с открытым исходным кодом, используемых в настоящее время. Он позволяет визуализировать флуоресцентные переходные процессы, испускаемые генетически модифицированными нейронами, через объективную линзу, имплантированную в поверхностную кору (система с одной линзой), или в глубокие области мозга через комбинацию релейной линзы, имплантированной в глубокий мозг, и объектива, который предварительно отбирается в минископе для наблюдения за ретранслируемым изображением (двухлинзовая система). Даже в оптимальных условиях (когда нейроны выражают показатели флуоресценции и правильно имплантирована релейная линза) изменение объема зубного цемента между опорной пластиной и его прикреплением к черепу при отверждении цемента может вызвать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к ухудшению качества изображения. Опорная плита - это пластина, которая помогает установить минископ на череп и фиксирует рабочее расстояние между объективом и релейными линзами. Таким образом, изменения в объеме зубного цемента вокруг опорной пластины изменяют расстояние между линзами. Настоящий протокол направлен на минимизацию проблемы смещения, вызванной изменениями объема зубного цемента. Протокол уменьшает перекос, создавая первоначальный фундамент из зубного цемента во время имплантации релейной линзы. Время выздоровления после имплантации достаточно для того, чтобы фундамент зубного цемента полностью отверзил опорную плиту, поэтому опорную плиту можно цементировать на этом каркасе, используя как можно меньше нового цемента. В настоящей статье мы описываем стратегии нанесения базовых покрытий у мышей, чтобы обеспечить визуализацию нейронной активности с помощью объектива, закрепленного в минископе.

Введение

Флуоресцентные репортеры активности идеально подходят для визуализации активности нейронов, поскольку они чувствительны и имеют большие динамические диапазоны 1,2,3. Поэтому все большее число экспериментов используют флуоресцентную микроскопию для непосредственного наблюдения активности нейронов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Первый миниатюрный однофотонный флуоресцентный микроскоп (минископ) был разработан в 2011 году Марком Шнитцером и др.5. Этот минископ позволяет исследователям контролировать динамику флуоресценции мозжечковых клеток у свободно ведущих себя животных5 (т.е. без каких-либо физических ограничений, подголовника, седации или анестезии животных). В настоящее время методика может применяться для мониторинга поверхностных участков мозга, таких как кора 6,8,15,16; подкорковые области, такие как спинной гиппокамп 8,11,13,14 и полосатое тело 6,17; и глубокие области мозга, такие как вентральный гиппокамп14, миндалина 10,18 и гипоталамус 8,12.

В последние годы было разработано несколько минископов с открытым исходным кодом.4,5,6,7,11,13,17,19. Минископ может быть экономически собран исследователями, если они следуют пошаговым рекомендациям, предоставленным командой Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA).4,7,11,13. Потому что оптический мониторинг нейронной активности ограничен ограничениями светопропускания7 Для и из интересующей нейронной популяции был разработан минископ, который требует, чтобы объектив с градиентным показателем преломления (GRIN) (или объектив) был предварительно отобран в нижней части минископа для увеличения поля зрения, которое передается из релейной линзы GRIN (или релейной линзы)6,7,8,10,16,17. Эта релейная линза имплантируется в целевую область мозга таким образом, что флуоресцентная активность целевой области мозга передается на поверхность релейной линзы.6,7,8,10,16,17. Приблизительно 1/4 полного синусоидального периода света проходит через объектив GRIN (~ 0,25 шага) (Рисунок 1A1), что приводит к увеличенному флуоресцентному изображению6,7. Объектив не всегда фиксируется в нижней части минископа, и не требуется имплантация релейной линзы6,7,11,13,15. В частности, существует две конфигурации: одна с фиксированным объективом в минископе и релейная линза, имплантированная в мозг.8,10,12,14,16 (Рисунок 1B1) и еще один со съемным объективом6,7,11,13,15 (Рисунок 1B2). В конструкции, основанной на комбинации неподвижного объектива и имплантированной релейной линзы, флуоресцентные сигналы от мозга доводятся до верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A1)7,8,10,12,14,16. Впоследствии объектив может увеличивать и передавать поле зрения с верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A2). С другой стороны, конструкция съемной объектива GRIN более гибкая, что означает, что предварительная имплантация релейной линзы в мозг не является обязательной (Рисунок 1B2)6,7,11,13,15. При использовании минископа, основанного на конструкции съемной объективной линзы, исследователям все еще необходимо имплантировать линзу в целевую область мозга, но они могут либо имплантировать объективную линзу.6,7,11,13,15 или релейная линза в головном мозге6,7. Выбор объектива или релейной линзы для имплантации определяет конфигурацию минископа, которую должен использовать исследователь. Например, минископ V3 UCLA основан на съемной конструкции объектива GRIN. Исследователи могут выбрать либо прямую имплантацию объектива в интересующую область мозга, либо установить «пустой» минископ на объектив.6,7,11,13,15 (однообъективная система; Рисунок 1B2) или имплантировать релейную линзу в мозг и установить минископ, который предварительно отобран с объективом6,7 (двухобъективная система; Рисунок 1B1). Затем минископ работает как флуоресцентная камера для захвата прямых трансляций изображений флуоресценции нейронов, создаваемой генетически закодированным индикатором кальция.1,2,3. После подключения минископа к компьютеру эти флуоресцентные изображения могут быть переданы на компьютер и сохранены в виде видеоклипов. Исследователи могут изучать активность нейронов, анализируя относительные изменения флуоресценции с помощью некоторых пакетов анализа.20,21 или написать свои коды для будущего анализа.

Минископ V3 UCLA обеспечивает гибкость для пользователей, чтобы определить, следует ли отображать активность нейронов с помощью системы7 с одной или двумя линзами. Выбор системы записи основывается на глубине и размере целевой области мозга. Короче говоря, система с одним объективом может отображать только область, которая является поверхностной (менее примерно 2,5 мм глубиной) и относительно большой (больше, чем примерно 1,8 x 1,8мм2), потому что производители производят только определенный размер объектива. Напротив, двухлинзовая система может быть применена к любой целевой области мозга. Однако зубной цемент для склеивания опорной плиты имеет тенденцию вызывать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к плохому качеству изображения. Если используется система с двумя объективами, для достижения оптимального качества изображения необходимо точно указать два рабочих расстояния (рисунок 1A). Эти два критических рабочих расстояния находятся между нейронами и нижней поверхностью релейной линзы, а также между верхней поверхностью релейной линзы и нижней поверхностью объектива (рисунок 1A1). Любое смещение или неправильное расположение объектива за пределами рабочего расстояния приводит к сбою изображения (рисунок 1C2). Напротив, система с одним объективом требует только одного точного рабочего расстояния. Однако размер объектива ограничивает его применение для мониторинга глубоких областей мозга (объектив, который подходит для минископа, составляет примерно 1,8 ~ 2,0 мм 6,11,13,15). Поэтому имплантация объектива ограничена для наблюдения за поверхностью и относительно большими областями мозга, такими как кора 6,15 и спинной cornu ammonis 1 (CA1) у мышей11,13. Кроме того, большая область коры должна быть аспирирована для нацеливания на спинную часть CA111,13. Из-за ограничения конфигурации с одной линзой, которая предотвращает визуализацию глубоких областей мозга, коммерческие системы минископов предлагают только комбинированную конструкцию объектива / релейной линзы (двухлинз). С другой стороны, минископ V3 UCLA может быть модифицирован в однообъективную или двухобъективную систему, потому что его объектив съемный 6,11,13,15. Другими словами, пользователи минископа V3 UCLA могут воспользоваться съемным хрусталиком, имплантировав его в мозг (создав систему с одной линзой), при выполнении экспериментов с участием поверхностных наблюдений за мозгом (менее 2,5 мм в глубину) или предварительно выбрав его в минископ и имплантировав релейную линзу в мозг (создав двухлинзовую систему), при выполнении экспериментов с участием глубоких наблюдений мозга. Система с двумя линзами также может быть применена для поверхностного наблюдения за мозгом, но исследователь должен знать точные рабочие расстояния между объективом и линзой реле. Основным преимуществом системы с одним объективом является то, что существует меньшая вероятность пропуска рабочих расстояний, чем в системе с двумя объективами, учитывая, что существует два рабочих расстояния, которые должны быть точно нацелены для достижения оптимального качества изображения в системе с двумя объективами (рисунок 1A). Поэтому мы рекомендуем использовать однолинзовую систему для поверхностных наблюдений за мозгом. Однако, если эксперимент требует визуализации в глубокой области мозга, исследователь должен научиться избегать смещения двух линз.

Базовый протокол двухлинзовой конфигурации минископов для экспериментов включает имплантацию линз и покрытиеоснований 8,10,16,17. Опорное покрытие - это наклеивание опорной пластины на голову животного, так что минископ может быть в конечном итоге установлен поверх животного и видеозапись флуоресцентных сигналов нейронов (рисунок 1B). Эта процедура включает в себя использование зубного цемента для приклеивания опорной пластины на череп (рисунок 1C), но усадка зубного цемента может вызвать неприемлемые изменения расстояния между имплантированной релейной линзой и объективом 8,17. Если смещенное расстояние между двумя линзами слишком велико, клетки не могут быть сфокусированы.

Подробные протоколы экспериментов по глубокой визуализации кальция мозга с использованием минископов уже опубликованы8,10,16,17. Авторы этих протоколов использовали систему Inscopix8,10,16 или другие индивидуальные проекты17 и описали экспериментальные процедуры вирусного отбора, хирургии и прикрепления опорной пластины. Однако их протоколы не могут быть точно применены к другим системам с открытым исходным кодом, таким как система V3 UCLA Miniscope, NINscope.6и финчскоп19. Смещение двух линз может произойти во время записи в конфигурации с двумя линзами с минископом UCLA из-за типа зубного цемента, который используется для цементирования опорной пластины к черепу8,17 (Рисунок 1C). Настоящий протокол необходим, поскольку расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом склонно к смещению из-за нежелательной усадки зубного цемента во время процедуры нанесения опорного покрытия. Во время нанесения опорного покрытия оптимальное рабочее расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом должно быть найдено путем регулировки расстояния между минископом и верхней частью релейной линзы, а затем опорная пластина должна быть приклеена в этом идеальном месте. После установки правильного расстояния между объективом и имплантированной релейной линзой можно получить продольные измерения с клеточным разрешением (Рисунок 1B; in vivo запись). Так как оптимальный диапазон рабочих расстояний релейной линзы невелик (50 - 350 мкм)4,8, чрезмерная усадка цемента во время отверждения может затруднить удержание объектива и имплантированной релейной линзы в соответствующем диапазоне. Общая цель этого отчета состоит в том, чтобы предоставить протокол для уменьшения проблем усадки8,17 которые происходят во время процедуры опорного покрытия и для увеличения успешности минископических записей флуоресцентных сигналов в конфигурации с двумя линзами. Успешная запись минископа определяется как запись прямой трансляции заметных относительных изменений флуоресценции отдельных нейронов у свободно ведущего себя животного. Хотя разные марки стоматологического цемента имеют разную скорость усадки, исследователи могут выбрать бренд, который был ранее протестирован.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Тем не менее, не каждый бренд легко получить в некоторых странах / регионах из-за правил импорта медицинских материалов. Поэтому мы разработали методы для проверки скорости усадки доступных зубных цементов и, что важно, предоставляем альтернативный протокол, который минимизирует проблему усадки. Преимуществом по сравнению с настоящим протоколом нанесения фундамента является увеличение успешности визуализации кальция с помощью инструментов и цемента, которые можно легко получить в лабораториях. В качестве примера используется минископ UCLA, но протокол также применим к другим минископам. В этом отчете мы описываем оптимизированную процедуру нанесения опорных покрытий, а также рекомендуем некоторые стратегии установки системы минископа UCLA с двумя линзами (Рисунок 2А). Представлены как примеры успешной имплантации (n= 3 мыши), так и примеры неудачной имплантации (n=2 мыши) для двухлинзовой конфигурации с минископом UCLA вместе с обсуждениями причин успехов и неудач.

протокол

Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были одобрены Национальным комитетом по уходу и использованию животных Тайваньского университета (номер одобрения: NTU-109-EL-00029 и NTU-108-EL-00158).

1. Оценка изменения объема зубного цемента

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в объеме зубного цемента происходят в процессе отверждения. Проверьте изменения объема зубного цемента перед имплантацией и нанесением фундамента. Исследователи могут протестировать любую марку зубного цемента и использовать бренд с наименьшим изменением объема для цементирования опорной плиты. Пример показан на рисунке 3.

  1. Взвесьте 0,5 г каждого порошка зубного цемента и смешайте его с соответствующим раствором (1 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое соотношение порошок/жидкость в инструкциях по зубному цементу составляет 0,5 г порошка на 0,25 мл раствора для получения твердой формы. Данный протокол испытаний разбавляет соотношение до 0,5 г/мл таким образом, чтобы смесь можно было аспирировать в жидкой форме для измерения изменения объема наконечников пипеток.
  2. Используйте 0,1-10 мкл наконечников пипетки, чтобы удалить 2,5 мкл зубной цементной смеси, а затем запечатайте наконечник пипетки легким отверждающим клеем.
  3. Поместите наконечники на стойку, отметьте самые верхние уровни зубной цементной смеси и измерьте уровень зубной цементной смеси через 40 минут (Дополнительное видео S1).
  4. В дополнение к мониторингу изменений уровня во время отверждения зубного цемента в наконечниках, измерьте оставшуюся плотность сухого зубного цемента. Чтобы рассчитать плотность, измерьте вес зубного цемента и измерьте объем по принципу Архимеда.
    1. Короче говоря, поместите оставшийся сухой зубной цемент в чашку, наполненную водой, и взвесьте воду, которая переполняется.
  5. Используйте зубной цемент с наименьшей усадкой для всех протоколов, описанных ниже.

2. Анестезия, хирургическая имплантация, вирусные инъекции и фиктивное покрытие фундамента

  1. Анестезия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий доклад направлен на оптимизацию процедуры хирургии и нанесения фундамента для минископа UCLA; поэтому предполагалось, что известен оптимальный вирусный титр для заражения целевых областей мозга. Методы поиска оптимального вирусного титра можно найти на этапах с 1 по 5 Resendez et al.8. После того, как вирусное разведение было оптимизировано, может быть начата хирургическая имплантация.
    1. Поместите мышь в индукционный контейнер и обеспечьте кислород (100% при скорости воздушного потока 0,2 л/мин). Преоксигенировать мышь в течение 5-10 мин.
    2. Вводят 5% изофлурана, смешанного со 100% кислородом (скорость воздушного потока: 0,2 л / мин), пока мышь не начнет терять равновесие и в конечном итоге не будет обезболена.
    3. Выводят мышь из индукционной камеры и вводят атропин (0,04 мг/кг; подкожная инъекция), чтобы предотвратить накопление слюны и бупренорфина (0,03 мг/кг; подкожная инъекция) в качестве анальгетика.
    4. Побрить голову мыши.
    5. Наденьте маску, стерильный халат и перчатки. Подготовьте стерильное пространство и стерильные хирургические инструменты к операции. Стабилизируйте голову мыши (поддерживайте анестезию от 3 до 2,5% изофлурана во время этого шага) на стереотаксическом аппарате. После обезболивающих и обезболивающих процедур убедитесь, что ушные вкладыши надежно стабилизируют голову. Обеспечьте тепловую поддержку.
    6. Убедитесь, что голова поставлена в прямое положение, стерилизуйте бритую голову бетадином, а затем опрыскивайте голову ксилокаином (10%), местным анальгетиком.
    7. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте офтальмологическую мазь для защиты глаз во время всех анестезиологических мероприятий, чтобы предотвратить травму глаза.
    8. Проверьте глубокий болевой рефлекс животного, зажав его заднюю лапу. Как только животное не проявит рефлекса отвода лапы, приступайте к хирургическим процедурам.
    9. Сделайте небольшой разрез вдоль средней сагиттальной плоскости черепа (начиная примерно от 2 мм спереди до брегмы и заканчивая примерно 6 мм сзади от брегмы). Затем очистите соединительную ткань на черепе и закрепите три винта из нержавеющей стали на левой лобной и межтеменной костях.
      1. В этот момент уменьшают изофлуран до 1-2%. Следите за частотой дыхания в течение всей хирургической процедуры. Если частота дыхания слишком медленная (примерно 1/с, в зависимости от животного), уменьшите концентрацию изофлурана.
    10. Выполните трепанацию черепа для имплантации релейной линзы под хирургическим микроскопом или стереомикроскопом с помощью сверла с диаметром наконечника 0,7 мм. Используйте микро-сверло, чтобы захватить буровое долото и нарисовать контур предполагаемой области круга (полную толщину кальвария не нужно пробивать).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Релейная линза, используемая в настоящем протоколе, имела диаметр 1,0 мм, длину ~ 9,0 мм и шаг 1 и диапазон рабочего расстояния ~100 мкм - 300 мкм; поэтому трепанация черепа имела диаметр 1,2 мм.
      1. Аккуратно углубите контур до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не обнажится.
      2. Приготовьте 3 мл стерильного физиологического раствора в шприце объемом 3 мл и охладите его в ведре со льдом. Часто промывайте открытую область 0,1 мл физиологического раствора из шприца, чтобы охладить область и предотвратить тепловое повреждение и кровоизлияние.
    11. Слегка соберите и снимите твердую мозговую оболочку с помощью иглы 27G.
    12. Нанесите маркировку на тупую иглу 27 G на расстоянии 1 мм от кончика и используйте ее для тщательного аспирации коры головного мозга, чтобы создать окно для имплантации хрусталика 8,11,13,17 (рисунок 2B1). При необходимости сделайте тупую иглу, отшлифовав кончик инъекционной иглы весом 27 г наждачной бумагой. Затем подключите иглу к шприцу, подключите шприц к трубке и подключите трубку к источнику всасывания, чтобы создать вакуум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Релейная линза тупая и будет сжимать ткань мозга, когда она помещается в глубокую область мозга. Таким образом, аспирация коры уменьшает повреждение тканей за счет имплантации релейной линзы. Толщина коры головного мозга у мышей составляет около 1 мм, но ее трудно визуализировать под стереомикроскопом. Метка создает ориентир, позволяющий определить глубину иглы более точно, чем с помощью одного только стереомикроскопа. Кроме того, можно определить, была ли достигнута или передана область коры в зависимости от сопротивления; верхняя часть коры кажется относительно мягкой, в то время как подкорковая область чувствует себя плотной. Поэтому, как только текстура начинает ощущаться плотнее, остановите аспирацию (рисунок 2B3).
    13. Приготовьте 3 мл стерильного физиологического раствора в шприце объемом 3 мл и охладите его в ведре со льдом. Промыть область физиологическим раствором, чтобы остановить кровотечение и уменьшить возможность отека мозга.
  2. Инъекции аденоассоциированного вируса (AAV)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем эксперименте использовался AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE. jGCaMP7s является генетически закодированным индикатором кальция, который излучает зеленую флуоресценцию3. Поскольку в настоящем исследовании в качестве субъекта использовалась мышь дикого типа, вирусный вектор был необходим для трансфекции нейронов с помощью гена индикатора зеленого флуоресцентного кальция и обеспечения экспрессии. Исследователи, использующие трансгенных мышей, экспрессирующих индикатор зеленого флуоресцентного кальция в качестве своих субъектов, могут пропустить протокол 2.2.
    1. Установите внутреннюю иглу внутривенного (т.е.в.) катетера 20 Г на стереотаксическую руку и медленно проколите (~100 - 200 мкм/мин) мозг в соответствующих координатах (те же координаты, которые используются при имплантации релейной линзы) (рисунок 2B3).
    2. Опустите микроинъекционную иглу со скоростью 100-200 мкм/мин в вентральный CA1 и вливайте (~ 25 нл/мин) 200 нЛ вирусного вектора в целевую область (-3,16 мм AP, 3,25 мм ML и -3,50 мм DV из брегмы).
    3. Подождите 10 минут, чтобы вирус диффундировал и свел к минимуму обратный поток.
    4. Извлеките (~100-200 мкм/мин) микроинъекционную иглу.
  3. Имплантация релейной линзы
    1. Продезинфицируйте релейную линзу 75% спиртом10,16, а затем промойте безпирогеновым физиологическим раствором. Замочите хрусталик в холодном физиологическом растворе без пирогена до имплантации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Холодная линза минимизирует отек мозга при помещении в мозг.
    2. Удерживайте релейную линзу с помощью микробульдожьего зажима (рисунок 2B3), зубы которого покрыты термоусадочной трубкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим бульдога может прочно удерживать линзу, не повреждая ее. Обратитесь к Resendez et al.8 для получения способа изготовления зажима бульдога, покрытого трубками.
    3. Медленно поместите (~100 - 200 мкм/мин) релейную линзу поверх целевой области (-3,16 мм AP, 3,50 мм ML и -3,50 мм DV от брегмы) и стабилизируйте ее зубным цементом.
  4. Фиктивное основание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью «фиктивного покрытия» во время операции по имплантации является создание зубной цементной основы, чтобы уменьшить количество зубного цемента, которое необходимо нанести во время реальной процедуры нанесения фундамента через несколько недель. Таким образом, риск изменения объема зубного цемента сводится к минимуму.
    1. Закрепите объектив на нижней части минископа и соберите опорную пластину на минископ (на этом этапе сборка анкерного объектива, опорной пластины и минископа еще не была размещена над черепом мыши).
    2. Оберните 10 см парафиновой пленки вокруг внешней стороны опорной плиты (рисунок 4А).
    3. Удерживайте минископ с помощью стереотаксического манипуляторного зонда, используя многоразовую клейкую глину.
    4. Выровняйте объектив поверх релейного объектива с как можно меньшим пространством между объективами (рисунок 4B).
    5. Используйте зубной цемент, чтобы закрепить позиционирование опорной плиты (таким образом, чтобы цемент касался только парафиновой пленки).
    6. Когда зубной цемент высохнет, снимите пленку.
    7. Снимите опорную пластину и минископ. Зубная цементная основа полая (рисунок 4В).
    8. Чтобы защитить релейную линзу от повседневной деятельности и от царапин мышью, запечатайте линзу реле силиконовой резиной до тех пор, пока линза реле не будет покрыта, и покройте силиконовую резину тонким слоем зубного цемента (рисунок 4B).
    9. Отсоедините мышь от стереотаксических инструментов и поместите мышь в камеру восстановления.
    10. Вводят карпрофен (5 мг/кг; подкожная инъекция) или мелоксикам (1 мг/кг; подкожная инъекция) для обезболивания и цефтазидима (25 мг/кг; подкожная инъекция) для профилактики инфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков не является альтернативой асептической технике. Периоперационные антибиотики (т.е. цефтазидим) могут быть показаны при определенных обстоятельствах, таких как длительные операции или установка хронических имплантатов.
    11. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
    12. Домашние мыши индивидуально и вводят мелоксикам (1 мг/кг; подкожная инъекция; q24h) в течение одной недели для облегчения послеоперационной боли. Проверяйте животное каждый день после операции, чтобы убедиться, что оно нормально ест, пьет и испражняется.
    13. Выполните нанесение фундамента через 3 или более недель.

3. Опорное покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно процедура нанесения фундамента (рисунок 5) не может быть выполнена в течение 2-3 недель после первоначальной процедуры из-за восстановления и времени инкубации вируса. Процедуры индукции для нанесения опорных покрытий аналогичны процедурам, описанным на этапах 2.1.1-2.1.8. Однако нанесение фундамента не является инвазивной процедурой, и животному требуется только легкая седация. Поэтому достаточно 0,8-1,2% изофлурана, пока животное не может передвигаться по стереотаксической рамке. Кроме того, относительно легкая изофлурановая анестезия также может помочь облегчить экспрессию флуоресцентных переходных процессов нейронов во время мониторинга8 (Дополнительное видео S2).

  1. Аккуратно вырежьте тонкий слой зубной цементной кровли с помощью костного роггера и удалите силиконовую резину. Очистите поверхность релейной линзы спиртом 75%.
  2. Прикрепите установленный винт рядом с опорной плитой, чтобы закрепить его в нижней части минископа (рисунок 5A1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опорная плита должна быть надежно затянута под дном минископа, поскольку разница между затянутой и слегка закрепленной опорной плитой может привести к несогласованному расстоянию.
  3. Отрегулируйте фокусный слайд примерно на расстоянии 2,7 - 3 мм от основного корпуса (рисунок 5A2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя длина может быть дополнительно отрегулирована во время процедуры нанесения опорного покрытия, зафиксируйте ее примерно до 2,7 мм, потому что одновременная регулировка длины минископа и оптимальной длины между имплантированной релейной линзой и линзой предварительного объектива очень запутанна.
  4. Подключите минископ к плате сбора данных и подключите его к порту USB 3.0 (или более поздней версии) на компьютере.
  5. Запустите программное обеспечение для сбора данных, разработанное командой UCLA.
  6. Отрегулируйте экспозицию до 255, коэффициент усиления до 64x, а светодиод возбуждения до 5%. Эти настройки рекомендуются для первоначального покрытия фундамента; конкретные настройки будут варьироваться в зависимости от областей мозга и уровней экспрессии генетически закодированного показателя кальция.
  7. Нажмите кнопку «Подключить », чтобы подключить минископ к программному обеспечению для сбора данных и посмотреть прямую трансляцию.
  8. Выровняйте объектив минископа с релейной линзой вручную и начните поиск флуоресцентных сигналов (рисунок 5B1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально поиск флуоресцентного сигнала вручную облегчает настройку. Поскольку для экспрессии генетически закодированного показателя кальция использовалась система AAV, как промоторный тип, так и серотип AAV влияли на эффективность трансфекции23,24. Исследователи должны проверить экспрессию индикатора кальция, найдя отдельные нейроны, которые показывают изменения в флуоресценции, прежде чем приступать к будущим экспериментам.
  9. Сверлите зубной цемент в любом месте, где он блокирует минископ (опционально).
  10. Смотрите прямую трансляцию программного обеспечения для сбора данных и используйте край релейного объектива в качестве ориентира (Дополнительное видео S2). Поле линзы реле выглядит как луноподобный серый круг на мониторе (рисунок 5B1; белые стрелки).
  11. Как только релейная линза найдена, тщательно отрегулируйте различные углы и расстояния минископа, пока не будут найдены флуоресцентные сигналы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения нейронов белее, чем фон. Точная форма нейронов указывает на то, что нейроны идеально лежат на фокальной плоскости линзы реле. Круглые нейроны предполагают, что они находились вблизи фокальной плоскости. Форма нейронов различна по всему мозгу, здесь в качестве примера показан вентральный CA1.
  12. Если ни один отдельный нейрон не проявляет изменений флуоресценции в зависимости от времени, повторно запечатайте основание силиконовой резиной. Флуоресценции не наблюдается, поскольку инкубационный период также зависит от свойства вируса23,24. Выполните шаги 3.1-3.12 через дополнительную неделю. (Это необязательно).
  13. Удерживайте минископ в оптимальном положении и переместите стереотаксическую руку многоразовой клейкой глиной к минископу (рисунок 5B2). Прикрепите минископ к стереотаксической руке с многоразовой клейкой глиной.
  14. Немного отрегулируйте рычаги x, y и z для поиска наилучшего вида (Дополнительное видео S2). Затем отрегулируйте угол между поверхностью объектива и релейной линзой, повернув ушную перекладину, зубную планку или многоразовую клейкую глину по оси Z. Вирусная экспрессия и имплантация хрусталика успешны, когда по меньшей мере одна клетка демонстрирует флуоресцентные переходные процессы (рисунок 6А; Дополнительное видео S2) во время покрытия основания (которое также зависит от области мозга, такой как CA1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если монитор показывает только белые ячейки, но без переходных процессов, есть другая причина (см. Рисунок 6B, C, Дополнительные видео S4,S5, раздел Результаты и раздел устранения неполадок).
  15. Сцементируйте опорную плиту (рисунок 5B2) зубным цементом.
  16. Контролируйте интересующую область во время цементирования, чтобы убедиться, что оптимальное положение не меняется.
  17. Используйте минимально возможное количество цемента, при этом прочно приклеивая опорную плиту на зубную цементную основу (рисунок 5B2). Нанесите второй и третий слой цемента вокруг опорной плиты, но будьте осторожны, чтобы не повлиять на линзу GRIN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение цемента на опорную плиту проще на этом этапе, так как основание опорной плиты было сформировано во время процедуры фиктивного покрытия.
  18. Тщательно отсоедините минископ от опорной плиты при отверждении цемента. Затем прикрутите защитный колпачок.
  19. Переместите животное в клетку для восстановления. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
  20. Домашние мыши по отдельности. Убедитесь, что он ест, пьет и испражняется нормально каждый день. Подождите 5 дней, пока мышь полностью восстановится, а затем проверьте изображение кальция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует только небольшое количество зубного цемента, удерживающего опорную плиту. Поэтому, если опорная плита значительно сместилась после процедуры нанесения фундамента, удалите зубной цемент с помощью сверла, выполните процедуру нанесения опорного покрытия снова.
  21. Обезболить (путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамин (87 мг/кг)/ксилазин (13 мг/кг)) и перфузить25 животным после проведения всех экспериментов.

Результаты

Оценка изменения объема зубного цемента
Поскольку объем зубного цемента изменяется в процессе отверждения, это может значительно повлиять на качество изображения, учитывая, что рабочее расстояние линзы GRIN составляет примерно от 50 до 350 мкм 4,8....

Обсуждение

В настоящем докладе описывается подробный экспериментальный протокол для исследователей, использующих двухлинзовую систему минископа UCLA. Инструменты, разработанные в нашем протоколе, относительно доступны для любой лаборатории, которая хочет попробовать визуализацию кальция in viv...

Раскрытие информации

Это не отраслевое исследование. Авторы сообщают об отсутствии финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7-mm drill bit #19008-07Fine Science Tools; USAfor surgery
0.1–10 μl pipette tips104-Q; QSPFisher Scientific; Singaporefor testing dental cement
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
27 G needleAGANI, AN*2713RTerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9; 1.5*10^13Addgene viral prep; MA, USAfor viral injection
Atropine sulfateAstart; Hsinchu, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
BaseplateV3http://miniscope.orgfor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK#30840350Bostik; Chelsea, Massachusetts, USAReusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman13 cmDiener; Tuttlingen, Germanyfor baseplating
BuprenorphineINDIVIOR; UKfor surgery
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PAanalgesia
CeftazidimeTaiwan Biotech; Taiwanprevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daqfor baseplating
Dental cement setTempronGC Corp; Tokyo, Japanfor testing dental cement
Dental cement setTokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japanfor testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors#51673Stoelting Co; Illinois, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointmentAlcon; Geneva, Switzerlandfor surgery/dummy baseplating/baseplating
IbuprofenYungShin; Taiwananalgesia
IsofluranePanion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
InscopixnVista SystemInscopix; Palo Alto, CAfor comparison with V3 UCLA Miniscope
KetaminePfizer; NY, NYfor euthanasia
Normal salinefor surgery
Micro bulldog clamps#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, Germanyfor lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge#88400Hamilton; Bonaduz, Switzerlandfor viral injection
Molding silicone rubberZA22 ThixoZhermack; Badia Polesine, Italyfor dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens#64519Edmund Optics; NJ, USAfor dummy baseplating/baseplating
Parafilm#PM996Bemis; Neenah, USAfor dummy baseplating
Portable Suction#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwanfor surgery
Relay GRIN lens#1050-002177Inscopix; Palo Alto, CA, USAfor dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws1.00 mm diameter, total length 3.00 mmfor surgery
Stereo microscope#SL720Sage Vison; New Taipei City, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus#51673Stoelting; IL, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive#3321Loctite; Düsseldorf, Germanyfor testing dental cement
V3 UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-componentsfor surgery/dummy baseplating/baseplating
XylazineX1126Sigma-Aldrich; St. Louis, MOfor euthanasia
Xylocaine pump spray 10%AstraZeneca; Södertälje, Swedenfor surgery

Ссылки

  1. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
  2. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  3. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  4. Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
  5. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  6. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  7. Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
  8. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  9. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  10. Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
  11. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  12. Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
  13. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  14. Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
  15. Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
  16. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
  17. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  18. Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
  19. Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
  20. Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
  21. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  22. Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
  23. Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
  24. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
  27. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172in vivoUCLA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены