Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз

Резюме

Здесь представлен протокол для подхода на основе капиллярного электрофореза на основе водорода / дейтерия (HDX) в сочетании с масс-спектрометрией сверху вниз. Этот подход характеризует различие в структурах более высокого порядка между различными видами белков, включая белки в разных состояниях и различные протеоформы, путем проведения одновременного дифференциального HDX и электрофоретического разделения.

Аннотация

Разрешение конформационной гетерогенности множественных белковых состояний, сосуществующих в растворе, остается одним из основных препятствий в характеристике белковой терапии и определении конформационных путей перехода, критически важных для биологических функций, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа. Реакция водородно-дейтериевого обмена (HDX) в сочетании с масс-спектрометрическим анализом сверху вниз (MS) обеспечивает средство для характеристики структур и динамики белка более высокого порядка в зависимости от конформера. Конформационная разрешающая способность этого метода в значительной степени зависит от эффективности разделения белковых состояний на уровне интактного белка и минимизации остаточного недейтерированного протического содержания во время реакций HDX.

Здесь мы описываем вариант подхода HDX MS на основе капиллярного электрофореза (CE), который направлен на улучшение конформационного разрешения. При таком подходе белки подвергаются реакциям HDX при миграции через дейтерированный раствор фонового электролита (BGE) во время капиллярного электрофоретического разделения. Различные белковые состояния или протеоформы, которые сосуществуют в растворе, могут быть эффективно разделены на основе их различного соотношения заряда к размеру. Разница в электрофоретической подвижности между белками и молекулами протического растворителя сводит к минимуму остаточный недететерированный растворитель, что приводит к почти полной дейтерирующей среде во время процесса HDX. Проточный микроволичный интерфейс CE-MS обеспечивает эффективную электрораспылительную ионизацию элюированных белковых веществ после быстрого смешивания с раствором модификатора закалки и денатурации на выходе из опрыскивателя. Онлайн-анализ РС сверху вниз измеряет глобальный уровень дейтрации элюированных интактных белковых видов и, следовательно, дейтрацию их фрагментов газовой фазы. В данной работе демонстрируется этот подход в дифференциальном HDX для систем, включая естественные варианты белка, сосуществующие в молоке.

Введение

Различение белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях и характеристика их структурных различий важны для мониторинга путей переходов между этими видами, участвующими в биологических событиях, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа, и понимания механизмов, лежащих в основе этих событий. Обычные биофизические методы не обеспечивают полного решения из-за таких ограничений, как недостаточное разрешение и потеря динамической информации в растворе. Водородно-дейтериевый обмен в сочетании с масс-спектрометрией (HDX MS) представляет собой метод, который маркирует структурные и конформационные особенности белков дейтерием (²H) посредством обмена между лабильными атомами водорода белков и ²H из преднамеренно введенного раствора ²H_2O. Протоны, участвующие в водородной связи или изолированные от растворителя внутри белка, не обмениваются легко¹. Таким образом, поскольку обменный курс на обменном участке сильно зависит от его участия в структурах более высокого порядка, белковые структуры могут быть выявлены с высоким пространственным разрешением MS, который исследует степень и скорость поглощения ²H на основе различных атомных масс между ¹H и ²H. За последние десятилетия HDX MS стал чрезвычайно успешным методом изучения конформаций и динамики белка².

В классическом восходящем подходе HDX MS ансамбль белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях протеолизируется без разделения на интактном белковом уровне, что делает невозможным характеристику отдельных видов путем анализа полученных протеолитических фрагментов с запутанным содержанием дейтерия. Напротив, в нисходящем подходе различные белковые состояния или протеоформы, которые включали различное содержание дейтерия, приводят к множественному распределению неповрежденных белковых масс при сканировании РС. Это позволяет отдельным видам быть разделенными путем массового отбора ионов, соответствующих каждому распределению массы, с использованием надлежащего массового фильтра (такого как квадруполь) и характеристики их конформационных различий в последующем тандемном анализе МС 3,4,5,6. Однако эффективность разделения белковых состояний или протеоформ в этой стратегии ограничена степенью разницы в их соответствующих массовых распределениях.

Капиллярный электрофорез (СЕ) обеспечивает средство для разделения белковых видов на основе их различных зарядов и гидродинамических размеров в фазе раствора с высокой эффективностью⁷. Сочетание CE с HDX обеспечивает дополнительное разделение белковых состояний или протеоформ в фазе раствора. Кроме того, небольшой объем капилляра CE позволяет использовать полностью дейтерированный раствор в качестве фонового раствора электролита (BGE), т. е. работающего буфера, превращая капилляр в реактор HDX для образцов белка. Из-за разницы в электрофоретической подвижности между белками и протическими реагентами в процессе электрофореза, проведение HDX во время CE приводит к почти полной дейтерирующей среде для белковых аналитов с минимальным остаточным недететерированным содержимым, тем самым повышая чувствительность структурного анализа с использованием данных HDX. Таким образом, мы разработали дифференциальный подход HDX на основе CE в сочетании с нисходящим MS для характеристики белковых структур более высокого порядка специфическим для состояния или протеоформа способом⁸.

В этом документе описываются протоколы для этого подхода путем подробного описания этапов подготовки материала, экспериментальной процедуры и анализа данных. Факторы, которые могут повлиять на производительность метода или качество данных, перечислены в кратких примечаниях. Репрезентативные результаты, представленные здесь, включают дифференциальные данные HDX смесей различных белков и природных вариантов бычьего β-лактоглобулина (β-lg), основного сывороточного белка, присутствующего в молоке⁹. Мы демонстрируем эффективность разделения, воспроизводимость и производительность ²H-маркировки двух распространенных вариантов β-lg, т.е. A и B^10,11 во время HDX на основе CE и характеризацию их конформаций для конкретных вариантов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности используйте высокоэффективные реагенты для жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или РС, чтобы свести к минимуму загрязняющие вещества, которые могут мешать анализу РС. Не прикасайтесь к интерфейсу CE-MS голыми руками во время измерения, чтобы избежать возможности поражения электрическим током, вызванного электрофоретическим напряжением или напряжением электрораспыления.

1. Подготовка материала

1. Модификация плавленого капилляра кремнезема для CE
   1. Готовят 5% (мас./мас.) раствор гидроксипропилцеллюлозы (HPC) путем растворения порошка HPC (молекулярная масса [MW]: 100 кДа) в воде с непрерывным перемешиванием при комнатной температуре на магнитной мешалке в течение ~12 ч или до полного исчезновения твердых частиц¹². Удалите все видимые пузырьки воздуха с помощью ультразвукового аппарата.
   2. Смонтируйте в прибор CE расплавленный капилляр из кремнеземистого стекла (внутренний диаметр [ID]: 50 мкм, наружный диаметр [OD]: 360 мкм) длиной приблизительно 85 см. Промыть капилляр путем непрерывного настаивания органического растворителя, такого как ацетон¹³, используя автосамплер CE при давлении инфузии 40 фунтов на квадратный дюйм в течение 10-15 мин.
   3. Заполните очищенный капилляр раствором HPC с помощью автопробоотборника при давлении инфузии 40 фунтов на квадратный дюйм (что часто занимает ~ 40 минут). Вливайте воздух в заполненный HPC капилляр со скоростью 40 фунтов на квадратный дюйм, чтобы обеспечить свободный воздушный поток в капилляре, о чем свидетельствуют пузырьки воздуха, выбрасываемые из капилляра при погружении в воду.
   4. Выпекать капилляр с покрытием HPC в температурно-программируемой печи (в идеале колонной печи с контролируемой температурой газового хроматографа) с газообразным азотом (25 фунтов на кв. дюйм), протекающим через капилляр, следуя температурной программе, показанной на рисунке 1.
   5. Охладите духовку до комнатной температуры, прежде чем вынуть капилляр. Используйте этот капилляр, модифицированный HPC, для разделения CE.

Рисунок 1: Рекомендуемая температурная программа для капиллярной выпечки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Раствор фонового электролита (БГЭ) и раствор модификатора⁸
   1. Готовят 1-10 мл БГЭ в желаемой концентрации (например, 10 мМ), растворяя соответствующее количество ацетата аммония в 2 Ч₂О. Поместите ²⁰⁰мкл-аликвот БГЭ в отдельные флаконы БГЭ и запечатайте флаконы парапленкой, чтобы свести к минимуму реакцию HDX между БГЭ и водяным паром в воздухе.
   2. Готовят 10 мл раствора модификатора с 75% (v/v) метанолом и 25% (v/v) воды, с рН, скорректированным до 2,5 с использованием муравьиной кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ²H_2Oи дейтерированный метанол для приготовления раствора модификатора, если атомы дейтерия в боковых цепях и незащищенные амиды позвоночника должны быть сохранены для обнаружения РС.
3. Обессоливание белковых образцов
   1. Готовят раствор ацетата аммония в недетерированной воде в нужной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать концентрацию менее 100 мМ, чтобы избежать сильного электрического тока во время электрофореза и возникающего в результате эффекта нагрева Джоуля.
   2. При необходимости отрегулируйте рН раствора ацетата аммония до нужного уровня с помощью муравьиной кислоты (для рН < 6,8) или гидроксида аммония (для рН > 6,8).
   3. Заменить исходные буферы белкового раствора раствором ацетата аммония (приготовленным в недететерированной воде в желаемой концентрации; рН, скорректированным до 7,5 с гидроксидом аммония) через по меньшей мере пять последовательных концентраций и стадий разбавления при 4 °C с использованием центробежного фильтра с надлежащим отключением MW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы белка, подлежащие обессоливанию, могут быть либо получены в результате предыдущих производственных процедур (например, очистки или состава), либо получены путем растворения лиофилизированного порошка белка. «Соли», подлежащие удалению из растворов образцов на этом этапе, относятся в целом ко всем малым ионам или молекулам, которые являются нелетучими. Хотя эти виды могут быть эффективно отделены от белков в процессе электрофореза, этот этап рекомендуется, чтобы избежать компрометации электрофоретического разрешения и, таким образом, свести к минимуму загрязнение масс-спектрометра. Когда белковые аналиты должны быть стабилизированы специфическими солями или добавками, включите их в состав БГЭ.
   4. Определить концентрацию белка можно с помощью микрообъемного спектрофотометра UV-Vis.

2. Работа анализа HDX MS на основе CE

ПРИМЕЧАНИЕ: Масс-спектрометр, используемый в этом подходе, должен быть оснащен анализатором массы со сверхвысоким разрешением, таким как циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR) или орбитрап, массовым фильтром, таким как квадруполь, который позволяет выбирать массу ионов-предшественников для фрагментации, и функциями диссоциации переноса электронов (ETD) или диссоциации захвата электронов (ECD) для выполнения нисходящего анализа с надежными тандемными данными MS (в идеале изотопно разрешенные сигналы фрагментов ионов).

1. Оптимизация настроек CE и MS
   1. Выполните пилотное измерение MS с использованием стандартного источника электрораспылительной ионизации (ESI) путем распыления либо предварительно загруженного образца из боросиликатного стеклянного капилляра с металлическим покрытием («статическая» схема nanoESI), либо непрерывно вводимого образца из металлического излучателя для оптимизации настроек MS для измерения неповрежденных белков (MS1) и их газофазных фрагментов (MS2). Фрагментировать интересующие белковые виды путем массового отбора ансамбля его ионов в однозарядном состоянии с последующим ETD или ECD ионов-предшественников.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные настройки включают параметры, влияющие на дезинсервацию, массовый отбор ионов-предшественников (во избежание вмешательства со стороны других видов) и эффективность фрагментации. Как центр, так и ширина окна выбора массы должны быть увеличены, чтобы соответствовать результирующему массовому распределению ионов анализируемого вещества после HDX. Поскольку окно элюирования вида белка в CE обычно колеблется от 0,5 мин до 2 мин, оцените эффективность фрагментации на основе сканирования MS2, накопленного за сопоставимое временное окно. Оптимальные значения этих параметров являются белково-специфическими; читатели ссылаются на ранее опубликованные отчеты по примерным настройкам ^8,14.
   2. Выполните пилотное измерение CE с помощью прибора CE, оснащенного оптическим детектором, то есть детектором фотодиодной решетки (PDA) или УФ-детектором для оптимизации настроек CE для разделения белковых видов и времени миграции, что эквивалентно времени реакции HDX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным в зависимости от наличия оптического детектора CE. При отсутствии оптического детектора настройки CE могут быть оптимизированы с использованием CE-MS после завершения раздела 2.2, следуя инструкциям, описанным в разделе 2.3. Основные настройки включают параметры, которые влияют на эффективность разделения, пиковые формы, показанные на электроферограммах, и время элюирования.
2. Предварительное кондиционирование установки CE-HDX
   1. Очистите проточный микровизионный интерфейс CE-MS смесью 50% метанола, 49% воды и 1% муравьиной кислоты (v/v) с использованием ультразвука в течение не менее 30 мин при комнатной температуре.
   2. После установки HPC-модифицированного капилляра на инструмент CE промойте капилляр с помощью автопробоотборника в течение 10 минут и оставьте капилляр заполненным BGE.
   3. Получить надлежащую длину немодифицированной плавленой капиллярной трубки кремнезема (ID: 50 мкм, OD: 360 мкм) в качестве инфузионной трубки для раствора модификатора. Соедините трубку-модификатор с газонепроницаемым стеклянным шприцем с тупым наконечником с помощью соединения и соответствующей втулки и промойте трубку раствором модификатора с помощью инфузионного насоса в течение не менее 10 мин.
   4. Вставьте выпускные отверстия капиллярной и модификаторной трубки CE с покрытием HPC, которые были загружены соответствующими решениями, в очищенный интерфейс CE-MS, как показано на рисунке 2.
   5. Выдвигайте шприц для инфузии модификатора либо вручную, либо с помощью инфузионного насоса, чтобы убедиться, что раствор модификатора достигает кончика интерфейса. Установите собранный интерфейс CE-MS на корпус источника nanoESI масс-спектрометра.

Рисунок 2: Схематическая иллюстрация установки HDX MS на основе CE. Эта цифра была изменена с⁸. Сокращения: BGE = раствор фонового электролита; CE = капиллярный электрофорез; MS = масс-спектрометрия; HDX = водородно-дейтериевый обмен; ESI = электрораспылительная ионизация; FTICR = циклотронный резонанс ионов с преобразованием Фурье; ETD = диссоциация переноса электронов; ECD = диссоциация захвата электронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Одновременное разделение CE, реакция HDX и анализ MS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дейтерированный БГЭ рекомендуется использовать в течение 1 дня после вскрытия.
   1. Приложите напряжение распыления 3-5 кВ к интерфейсу CE-MS.
   2. Начните вливание раствора модификатора с инфузионным насосом со скоростью потока от 0,1 до 10 мкл/мин и обеспечьте стабильное электрораспыление на кончике интерфейса CE-MS.
   3. Поместите флакон с образцом, содержащий BGE, в автопробоотборник и используйте его на этапе 2.3.4 для получения пустых электроферограмм и пустых масс-спектров.
   4. Вводите раствор образца с помощью автопробоотборника при 2 фунтах на квадратный дюйм и в течение надлежащего периода времени, чтобы обеспечить инъекцию желаемого количества образца. Оцените объем впрыска, используя соотношение между объемом впрыска и параметрами^{впрыска 15} , определенным уравнением (1).
      (1)
      Где V_inj - объем инъекции, Δp - давление инъекции, d_c - внутренний диаметр капилляра, A - поперечное сечение капилляра, t_inj - продолжительность инъекции, η - вязкость жидкости в капилляре, а L - длина капилляра.
   5. Начните разделение СЕ, применив электрофоретическое напряжение 30 кВ и давление инфузии в диапазоне от 0 до 2 фунтов на квадратный дюйм, и получите электроферограмму. Между тем, начать сбор данных МС в хроматографическом режиме, где график ионного тока получается в зависимости от времени, а соответствующие МС-сканы автоматически не объединяются в единый спектр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белки подвергаются спонтанной реакции HDX в точке контакта ^{молекул 2}H₂O в BGE во время их электрофоретической миграции на этом этапе. Оптическое обнаружение для CE может использоваться в дополнение к обнаружению MS. Поскольку обнаружение на колонне требует удаления определенной длины полиимидного покрытия на выходном конце расплавленного капилляра кремнезема, следует проявлять дополнительную осторожность, чтобы избежать повреждения капилляров во время сборки интерфейса CE-MS.
   6. Сохраните пустую электроферограмму и масс-спектры в качестве ссылок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые данные должны использоваться для устранения неполадок, а не для базового вычитания.
   7. Поместите флаконы с образцом, содержащие желаемые концентрации растворов образца белка, в автопробоотборник. Получите электроферограммы и масс-спектры для образцов белка, выполнив шаги 2.3.4-2.3.5. Соберите достаточное количество ms-сканирований для получения спектров MS1 электрофоретически разделенных и ²H-меченых белковых форм.
   8. Выполняйте тандемные измерения MS для интересующих видов либо после получения спектров MS1 в рамках того же пробега, либо в последующем, отдельном прогоне.
   9. При необходимости отрегулируйте время миграции/время реакции HDX, изменив давление инфузии или длину капилляра CE. Если время реакции HDX должно быть короче, чем время миграции, используйте подход, описанный ранее⁸, который использует как дейтерированный, так и невейтерированный BGE в капилляре во время процесса CE.
   10. Промывайте капилляр CE BGE при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм в течение не менее 10 минут после каждого измерения.
   11. По завершении экспериментов очистите интерфейс CE-MS и все трубки для хранения.
   12. Получить набор данных образца «конечной точки» HDX (который может быть подготовлен с использованием подходов, описанных ранее ^6,16) с MS в режиме прямой инфузии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требуется только в том случае, если для HDX на основе CE используется дейтерированное модификаторное решение.

3. Анализ данных

1. Анализ данных CE
   1. Используйте один из следующих графиков в качестве электроферограммы для определения электрофоретических характеристик, включая количество пиков, время миграции и эффективность разделения: (a) поглощение УФ-излучения против времени миграции, полученное оптическим детектором прибора CE (при наличии); b) график общего ионного тока (ТИЦ), полученный MS; c) график извлечь ионного тока (EIC/XIC), полученный MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EIC/XIC обеспечивает оптимальное соотношение сигнал/шум (S/N), в целом, среди вышеупомянутых форматов электроферограмм. Примечательно, что даже при отсутствии каких-либо инструментальных смещений, в то время как поглощение УФ-излучения пропорционально массовой концентрации белка, сигнал РС пропорционален молярной концентрации. Следовательно, разумно наблюдать различия в пиковых паттернах между электроферограммами, полученными из CE и MS.
   2. Используйте площадь под кривой (AUC) пиков, показанных в электроферограммах, для полуквантования. Для образцов, включающих белковые комплексы, используйте подход, описанный ранее¹⁷ , для вывода данных о концентрации массы из электроферограмм TIC/EIC.
2. Анализ данных MS
   1. Получите спектры MS1 и MS2, объединив сканы MS1 и MS2, полученные в соответствующих окнах элюирования соответственно.
   2. Определите массы интактного белка (M (интактный белок)) и фрагментов одним из следующих двух методов.
      1. Рассчитайте средние массы ионов, дающих начало изотопно разрешенным сигнальным кластерам.
      2. Используйте центр гауссовских кривых, возникающих в результате подгонки соответствующих изотопных оболочек⁶.
   3. Используйте программное обеспечение, такое как Biopharma Finder, ProSight¹⁸ или MASH Suite¹⁹ , для создания массового списка фрагментов ионов и их идентификации.
3. Анализ данных HDX
   1. Определите общий уровень дейтрации интактного вида белка с помощью уравнения (2).
      (2)
      где M (²H) или M (¹H) — атомные веса ²H или ¹H. Звездочкой обозначены данные образца ^{с маркировкой 2}H.
   2. Определите кумулятивную защиту или кумулятивную дейтрацию магистральных амидов определенного сегмента.
      1. Для данных, полученных с помощью дейтерированного модификатора, используйте уравнения (3) и (4) для определения кумулятивного уровня защиты.
         (3)
         (4)
         Где P(S_k(N)) - полная защита N-концевого сегмента, охватывающего остатки от 1 до k, P(S_m(C)) - полная защита C-концевого сегмента, содержащего m остатков, M (²H) или M (¹H) - атомные массы ²H или ¹H, а M (c_i) или M (z_i) - молекулярные массы ионов c_i или z_i .
         ПРИМЕЧАНИЕ: Двойная звездочка указывает на данные образца "конечной точки" HDX.
      2. Для данных, полученных с помощью невыполненного решения модификатора, используйте уравнения (5) и (6) для определения кумулятивного уровня дейтерации.
         (5)
         (6)
         Где D(S_k(N)) - кумулятивное поглощение дейтерия N-концевым сегментом, охватывающим остатки от 1 до k; D(S_m(C)) - кумулятивное поглощение дейтерия С-концевым сегментом, содержащим м-остатки .
   3. Определение уровня дейтрации в локальной амидной группе позвоночника
      1. Для данных, полученных с помощью дейтерированного модификаторного решения, используйте уравнения (7), (8), (9), (10) и (11) для определения локального уровня защиты.
         для данных, полученных из с-ионов
         (7)
         для данных, полученных из z-ионов
         (8)
         Где P(R_i) — защита основного амида при остатке i, а подстрочный индекс «total» обозначает общее остаточное число белка.
         Для участков остатков, где последующие фрагменты ионов отсутствовали, назначьте P(R_i), используя уравнения (9) и (10).
         для данных, полученных из с-ионов
         (9)
         для данных, полученных из z-ионов
         (10)
         Затем определите уровень дейтрации D(R_i) в локальной амидной группе позвоночника с помощью уравнения (11).
         (11)
      2. Для данных, полученных с помощью невыполненного решения модификатора, используйте уравнения (12), (13), (14) и (15) для определения локального уровня защиты.
         для данных, полученных из с-ионов
         (12)
         для данных, полученных из z-ионов
         (13)
         Где D(R_i) — защита амида позвоночника при остатке i, а подстрочный индекс «всего» обозначает общее остаточное число белка.
         Для участков остатков, где последующие фрагменты ионов отсутствовали, назначьте D(R_i), используя уравнения (14) и (15).
         для данных, полученных из с-ионов
         (14)
         для данных, полученных из z-ионов
         (15)

Результаты

Изменение давления инфузии BGE позволяет регулировать как эффективность разделения, так и время миграции, что эквивалентно времени реакции HDX разделяемых белков (рисунок 3). Более низкое давление инфузии приводит к лучшему разделению пиков CE за счет продолжительности эк?...

Обсуждение

Цели покрытия внутренней стенки капилляра CE включают минимизацию электроосмотического потока и поглощения белка во время процесса^{CE 13}. Хотя электроосмотический поток полезен для обычного анализа СЕ малых молекул из-за его способности направлять нейтральные или противоп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130