JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описаны подробные пошаговые протоколы изучения механических сигналов in vitro с использованием мультипотентных клеток нервного гребня O9-1 и полиакриламидных гидрогелей различной жесткости.

Аннотация

Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой эмбриональные мультипотентные клетки позвоночных, которые могут мигрировать и дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, которые дают начало различным органам и тканям. Жесткость тканей производит механическую силу, физический сигнал, который играет решающую роль в дифференцировке NCC; однако механизм остается неясным. Способ, описанный здесь, предоставляет подробную информацию для оптимизированной генерации полиакриламидных гидрогелей различной жесткости, точного измерения такой жесткости и оценки воздействия механических сигналов в клетках O9-1, линии NCC, которая имитирует NCC in vivo NCC.

Жесткость гидрогеля измеряли с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM) и соответственно указывали на различные уровни жесткости. O9-1 NCC, культивируемые на гидрогелях различной жесткости, показали различную морфологию клеток и экспрессию генов стрессовых волокон, что указывало на различные биологические эффекты, вызванные изменениями механического сигнала. Кроме того, было установлено, что изменение жесткости гидрогеля привело к созданию эффективной системы in vitro для манипулирования механической сигнализацией путем изменения жесткости геля и анализа молекулярно-генетической регуляции в NCC. NCC O9-1 могут дифференцироваться в широкий спектр типов клеток под воздействием соответствующих дифференцирующих сред, и удобно манипулировать химическими сигналами in vitro. Таким образом, эта система in vitro является мощным инструментом для изучения роли механической сигнализации в NCC и ее взаимодействия с химическими сигналами, что поможет исследователям лучше понять молекулярно-генетические механизмы развития нервного гребня и заболеваний.

Введение

Клетки нервных гребней (NCC) представляют собой группу стволовых клеток во время эмбриогенеза позвоночных с замечательной способностью мигрировать и способствовать развитию различных органов и тканей. NCC могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая сенсорные нейроны, хрящи, кости, меланоциты и гладкомышечные клетки, в зависимости от местоположения осевого происхождения и местного экологического руководства NCC1,2. Обладая способностью дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, генетические аномалии, вызывающие дисрегуляцию на любой стадии развития нервного гребня (НК), могут привести к многочисленным врожденным заболеваниям2. Например, возмущения во время формирования, миграции и развития NCC приводят к нарушениям развития, известным в совокупности как нейрокристопатии1,3. Эти заболевания варьируются от черепно-лицевых дефектов из-за сбоя в образовании NCC, таких как синдром Тричера Коллинза, до развития различных видов рака из-за метастатической мигрирующей способности NCC, как видно при меланоме3,4,5,6. За последние несколько десятилетий исследователи сделали замечательные открытия о роли и механизмах NCC в развитии и заболеваниях, причем большинство результатов сосредоточены на химических сигналах7,8. Совсем недавно было указано, что механические сигналы играют решающую, но плохо понятную роль в разработке NCC9,10.

Экологические сигналы NCC играют решающую роль во время их развития, включая регулирование дифференцировки NCC в различные типы клеток. Сигналы окружающей среды, например, физические сигналы, влияют на ключевое поведение и клеточные реакции, такие как функциональная диверсификация. Механотрансдукция позволяет клеткам ощущать и реагировать на эти сигналы для поддержания различных биологических процессов2. NCC окружены соседними клетками и различными субстратами, такими как внеклеточный матрикс (ECM), который может давать начало механическим стимулам для поддержания гомеостаза и адаптации к изменениям посредством определения судьбы, пролиферации и апоптоза11. Механотрансдукция начинается на плазматической мембране, где происходит сенсорный компонент механических внеклеточных раздражителей, в результате чего происходит внутриклеточная регуляция клетки12. Интегрины, фокальные спайки и соединения плазматической мембраны ретранслируют механические сигналы, такие как силы сдвига, напряжение и жесткость окружающих субстратов, в химические сигналы для получения клеточных реакций12. Ретрансляция химических сигналов от плазматической мембраны к конечной клеточной регуляции осуществляется через различные сигнальные пути для завершения жизненно важных для организма процессов, таких как дифференцировка.

Несколько исследований показали, что механическая сигнализация от жесткости субстрата играет роль в дифференцировке клеток13,14. Например, предыдущие исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выращенные на мягких субстратах с жесткостью, аналогичной жесткости ткани мозга (в диапазоне 0,1-1,0 кПа), приводили к дифференцировке нейрональных клеток15,16. Однако больше МСК дифференцируются в миоцитоподобные клетки при выращивании на субстратах 8-17 кПа, имитирующих жесткость мышц, в то время как остеобластная дифференцировка наблюдалась при культивировании МСК на жестких субстратах (25-40 кПа)15,16. Значение механотрансдукции подчеркивается нарушениями и аномалиями в механическом сигнальном пути, которые потенциально приводят к тяжелым дефектам развития и заболеваниям, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и остеопороз17,18,19. При раке нормальная ткань молочной железы мягкая, и риск рака молочной железы увеличивается в жесткой и плотной ткани молочной железы, среда, которая больше похожа на опухоли молочной железы15. Обладая этими знаниями, влияние механической сигнализации на развитие NCC может быть изучено путем простого манипулирования жесткостью субстрата через систему in vitro, обеспечивая дополнительные преимущества и возможности в понимании основ прогрессирования и этиологии заболеваний, связанных с NC.

Для изучения влияния механических сигналов в НКЦ создана эффективная система in vitro для ННК, основанная на оптимизации ранее опубликованных методов и оценке реакций НКЦ на различные механические сигналы20,21. Был разработан подробный протокол для получения различной жесткости гидрогеля и оценки воздействия механической сигнализации в НКЦ. Для достижения этой цели NCC O9-1 используются в качестве модели NC для изучения эффектов и изменений в ответ на жесткие и мягкие гидрогели. O9-1 NCC представляют собой стабильную клеточную линию NC, выделенную из эмбриона мыши (E) в день 8,5. O9-1 NCC имитируют NCC in vivo, потому что они могут дифференцироваться в различные типы клеток, полученных из NC, в определенных дифференцировочных средах22. Для изучения механической сигнализации ННК изготавливали матричную подложку с перестраиваемой эластичностью из изменяющихся концентраций растворов акриламида и бис-акриламида для достижения желаемой жесткости, коррелирующей с жесткостью биологического субстрата20,21,23. Для оптимизации условий матричной субстрата для NCC, в частности O9-1 клеток, были сделаны модификации из ранее опубликованного протокола20. Одно из изменений, внесенных в этот протокол, заключалось в инкубации гидрогелей в коллагене I, разбавленном в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES, при 37 °C в течение ночи. Низкий рН уксусной кислоты приводит к однородному распределению и более высокому включению коллагена I, что позволяет более равномерно присоединять белок ECM24. Кроме того, комбинацию конской сыворотки и фетальной бычьей сыворотки (FBS) использовали в концентрациях 10% и 5% в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) соответственно перед хранением гидрогелей в инкубаторе. Конская сыворотка использовалась в качестве дополнительной добавки к FBS из-за ее способности способствовать пролиферации и дифференцировке клеток в концентрации 10%25.

С помощью этого метода биологическая среда была имитирована белковым покрытием ECM (например, коллагеном I), чтобы создать точную среду in vitro для NCC, чтобы расти и выживать20,21. Жесткость подготовленных гидрогелей была количественно проанализирована с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM), хорошо известного метода для изображения модуля упругости26. Чтобы изучить влияние различных уровней жесткости на NCC, клетки дикого типа O9-1 культивировали и готовили на гидрогелях для окрашивания иммунофлуоресценцией (IF) против нитевидного актина (F-актина), чтобы показать различия в адгезии и морфологии клеток в ответ на изменения жесткости субстрата. Используя эту систему in vitro, исследователи смогут изучить роль механической сигнализации в NCC и ее взаимодействие с другими химическими сигналами, чтобы получить более глубокое понимание взаимосвязи между NCC и механической сигнализацией.

протокол

1. Получение гидрогеля

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны быть выполнены в вытяжке для культивирования клеток, которая была продезинфицирована этанолом и ультрафиолетовым (УФ)-стерилизованным перед использованием для поддержания стерильности. Инструменты, такие как пинцет и пипетки, должны быть опрысканы этанолом. Буферные растворы также должны быть стерильно-фильтрованы.

  1. Приготовление стеклянных обложек с аминосилановым покрытием
    1. Поместите нужное количество стеклянных крышек на кусок лабораторной салфетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные 3-4 крышки, чтобы обеспечить достаточные резервные запасы, так как они легко ломаются. Различные материалы стеклянных покровных пластинок дадут разную совместимость посева и крепления клеток. Лучше определить, какой тип лучше всего подходит для эксперимента, прежде чем начинать эксперименты (см. Таблицу материалов).
    2. Используйте спиртовую горелку или горелку Бунзена, чтобы стерилизовать каждый покров, пропуская его вперед и назад через пламя (30 с для экспериментов по анализу белка). Поместите каждую стеклянную крышку на лабораторную салфетку, чтобы она остыла.
    3. Как только стеклянные крышки остынут, переложите их на чашку Петри, выстланную парапленкой, чтобы предотвратить проскальзывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если крышки недостаточно холодные, остаточное тепло расплавит парапленку на скольжениях, что сделает их непригодными для использования.
    4. Накройте крышки примерно 200 мкл и 800 мкл 0,1 М NaOH на 12 мм и 25 мм крышки соответственно и дайте им постоять в течение 5 минут. Затем аспирируйте 0,1 М NaOH и дайте обшивкам высохнуть на воздухе еще 5 минут, чтобы сформировать ровную пленку.
    5. После того, как крышки высушены, пипетка приблизительно 80 мкл и 150 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTS) на 12 мм и 25 мм покрывает крышки соответственно. Будьте осторожны, чтобы не пролить раствор на парапленку. Дайте раствору постоять 5 мин.
    6. Аспирируйте как можно больше избытка APTS и дайте остаточному APTS высохнуть в течение 5 минут. Хорошо промойте крышки, погружая их в стерильные, деионизированные (DI) H2Oтри раза в течение 5 мин каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если стеклянные крышки плохо промыты, остаточный APTS вызывает нежелательные реакции с глутаровым альдегидом, вызывая образование белого осадка и приводя к непригодным для использования покровам.
    7. Переместите крышки на новую чашку Петри реактивной стороной вверх. Добавьте достаточное количество 0,5% глутарового альдегида в чашку Петри, чтобы полностью покрыть крышки и дать обшивкам постоять в течение 30 минут.
    8. Аспирировать 0,5% глутаральдегида и снова промыть крышки в DIH2Oодин раз в течение 3 мин. Установите реактивную сторону крышки на лабораторную салфетку или чистую чашку Петри, чтобы она полностью высохла на воздухе перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен; крышки должны быть помещены в стерильный DI H2Oдо использования.
  2. Приготовление силиконизированных обшивок
    1. Поместите такое же количество обложек, как и покрытые аминосиланом чехлы (этап 1.1.1), в чашку Петри, выстланную парапленкой.
    2. Пипетка 40 мкл или 150 мкл на 12 мм и 25 мм обшивка соответственно дихлорметилсилана (DCMS) с одной стороны крышки и позволяет раствору постоять в течение 5 мин.
    3. Аспирировать любой оставшийся раствор из крышки, промыть стерильным DIH2Oодин раз в течение 1 мин и поместить реактивные покровы лицевой стороной вверх на лабораторную салфетку до полного высыхания на воздухе, прежде чем перейти к следующему этапу.
  3. Приготовление гидрогелей
    1. Смешайте акриламид, бис-акриламид и DIH2Oв центрифужной трубке объемом 1,5 мл для получения 500 мкл растворов с различной жесткостью (см. таблицу 1). Вихрь раствора в течение 30 с тщательно перемешать.
    2. Работая быстро, добавьте 10% раствор персульфата аммония (APS) и тетраметилэтилендиамин (TEMED) в трубку и снова вихрьте растворы для смешивания растворов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий 10% APS и оставьте его на льду или заморозьте в одноразовые аликвоты из-за его чувствительного цикла замораживания / оттаивания.
    3. Пипетку приблизительно 33 мкл или 100 мкл раствора на высушенные 12 мм или 25 мм покрытые аминосиланом покровные листы (раздел 1.1), соответственно.
    4. Используя изогнутый пинцет, немедленно поместите обработанный DCMS покровный лист поверх раствора геля с обработанной стороной, касающейся раствора геля, таким образом, зажав раствор геля между обработанным DCMS чехлом и покрытым аминосиланом чехлом.
    5. Дайте гелевому раствору полимеризоваться в течение 5-15 мин, при этом активно контролируя полимеризацию геля оставшегося раствора в пробирке.
    6. После полимеризации геля отделите обработанный DCMS покровный лист изогнутым пинцетом или лезвием бритвы, оставив гель прикрепленным к исходному покрытому аминосиланом чехлу.
    7. Немедленно поместите крышку с прикрепленным гидрогелем в заданную 4-луночную/24-луночную и 6-луночную пластину, покрытую 500 мкл и 2 мл стерильных PBS или DI H2O на 12 мм и 25 мм обшивки соответственно, чтобы предотвратить высыхание геля.
    8. Повторите шаги 1.3.4-1.3.7 для всех обложек.
    9. Погружают гидрогели в стерильные PBS или DI H2O на 30 мин для удаления избытка раствора акриламида. Храните гидрогели в стерильном PBS или DI H2O при 4 °C для процедурной остановки здесь.
    10. В темном помещении готовят смесь сульфосуцинимидила 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноата (сульфо-SANPAH) путем смешивания 2,5 мл 50 мМ 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этанесульфоновой кислоты (HEPES) (pH=8,5) с 25 мкл 50 мкг/мл сульфо-САНПАГ в конической трубке, обернутой в алюминиевую фольгу для защиты от света. Используйте пипетку, чтобы хорошо перемешать раствор перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объема 2,5 мл раствора сульфо-САНПАГ достаточно примерно для двадцати пяти 12-мм гидрогелей или пяти 25-мм гидрогелей.
    11. Аспират PBS или DI H2O из плиты скважины. Добавьте приблизительно 100 мкл или 500 мкл на 12 мм и 25 мм обшивки, соответственно, раствора сульфо-SANPAH (стадия 1.3.10) для покрытия геля. Убедитесь, что раствор полностью покрывает гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте силу вакуумного всасывания, чтобы предотвратить разрыв или нарушение гидрогелей сильного взаимодействия.
    12. Поместите гели с раствором под ультрафиолетовый свет 15 Вт, 365 нм в течение 10 мин, чтобы свести к минимуму любые помехи УФ-света, реагирующего с сульфо-SANPAH.
    13. Аспирируйте избыток сульфо-SANPAH, наклоняя пластину, чтобы собрать как можно больше раствора. Промыть гель с 50 мМ HEPES два-три раза.
    14. Добавьте 500 мкл и 2 мл на 12 мм и 25 мм гелей, соответственно, из 50 мг/мл коллагена I, разбавленного в 0,2% уксусной кислоты, в каждую скважину, содержащую гидрогель. Дайте гелям инкубироваться в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте коллаген I в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES для содействия однородному распределению и прикреплению коллагена I.
    15. Аспирировать коллаген I и промыть гели стерильным PBS три раза, чтобы удалить избыток коллагена I в течение 5 мин каждую стирку. Инкубируют гидрогели в PBS с 10% конской сывороткой, 5% FBS в течение 2 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 10% конской сыворотки способствует более высокой пролиферации по сравнению с использованием только FBS, как это было сделано в предыдущей публикации.
    16. Аспирировать среду. Добавьте 500 мл стерильно-фильтрованной модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином (P / S) в каждую лунку. Храните гели в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 до готовности к культивированию клеток.
    17. После готовности пластину примерно 1,5 × 104 O9-1 клеток/см2 в базальной среде в культуральной посуде. Инкубируют клетки в течение 2 дней в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2. Проверьте клетки на слияние, чтобы убедиться, что клетки достаточно прикреплены к гелям, и что количество клеток достаточно перед сбором для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. ранее опубликованный протокол для этапов восстановления, прохождения и сбора клеток O9-120.
    18. Перейдите к разделам 2, 3 или 4 для дальнейшего анализа гидрогелей.

2. Количественный анализ жесткости с помощью AFM

  1. Запустите системный компьютер AFM, а затем контроллер AFM (см. Таблицу материалов).
  2. Установите консоль AFM на держатель зонда AFM. Используйте сферический консоль с 0,5 мкм кварцевой бусины, установленной на конце кантилевера (консоль со сферической бусиной).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более жестких гидрогелей, таких как 10 кПа, 20 кПа и 40 кПа, использовался более жесткий зонд с постоянной пружины 0,24 Н/м. Более мягкий зонд использовался для более мягких гидрогелей, таких как 0,5 кПа и 1 кПа, с постоянной пружины 0,059 Н/м.
  3. Установите программное обеспечение AFM в режим контакта.
  4. Установите кремниевую пластину на стадию образца AFM для сбора кривых силы, нажав на Engage для консольного устройства, чтобы коснуться кремниевой подложки, тем самым генерируя кривые силы.
  5. Используйте кривые силы, приведенные выше (2.4) для калибровки, нажмите «Калибровка» в управляющем программном обеспечении, чтобы получить среднюю константу пружины консольного аппарата в условиях тепловой настройки, и сохраните калиброванные значения в управляющем программном обеспечении.
  6. Установите образцы, поместив крышку с прикрепленным гидрогелем в 60-миллиметровую чашку Петри на ступень сканирования AFM. Добавьте 3 мл PBS в блюдо перед проведением измерений, чтобы предотвратить высыхание геля.
  7. Настройте AFM на работу в контактном режиме (жидкость), чтобы начать измерение. Задействуйте сферическую бусину, чтобы непрерывно касаться и поднимать образец геля.
  8. Установите консоль так, чтобы ее порог отклонения оставался на уровне 10 нм. Держите размер зонда на уровне 10 мкм. Затем запишите кривые силы, как на шаге 2.4.
  9. Получите по меньшей мере 20 силовых кривых от по меньшей мере 3 до 10 различных пятен по всей поверхности гидрогеля.
  10. Рассчитайте средний модуль Юнга ~ 20 кривых силы для каждого пятна с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа AFM. Используйте кривые силы расширения рампы и линеаризированную модель (сферическую). Рассчитайте среднее значение всех пятен для каждого образца, чтобы получить окончательную жесткость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль Юнга и связанные с ним данные(т.е. стандартные отклонения) автоматически сохраняются в виде электронной таблицы.
  11. Повторите шаги 2.6-2.10 для всех образцов.

3. Молекулярный анализ жесткости с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Используйте пинцет для транспортировки крышки на новую пластину, чтобы свести к минимуму ложные сигналы от клеток, выращенных непосредственно на пластине. Промыть клетки 500 мкл стерильного PBS три раза, чтобы удалить мертвые клетки и любую оставшуюся питательную среду.
  2. Зафиксируйте клетки, используя 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин при комнатной температуре, без помех. Затем промывайте клетки три раза, используя 500 мкл PBS/лунку в течение 2 мин каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C для процедурной остановки.
  3. Обрабатывайте клетки 500 мкл 0,1% Тритона Х-100 в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки три раза 500 мкл PBS/well.
  4. Блокируйте клетки 250 мкл 10% ослиной сыворотки (разведенной в PBS и 0,1% Tween 20) на лунку в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Инкубируют клетки с 250 мкл первичных антител в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C. Затем промыть клетки три раза 500 мкл PBS/лунку в течение 5 мин каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-Винкулин (Vcl) (1:250) и анти-AP2 альфа (1:250) были использованы в этом эксперименте и были разведены в 10% ослиной сыворотке.
  6. Инкубируют клетки с соответствующими вторичными антителами и/или фаллоидином, используемыми для окрашивания F-актином, в разведении 1:400 в 250 мкл 10% ослиной сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки три раза PBS в течение 5 минут каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 568 нм фаллоидин может быть совместно инкубирован с 488 нм или 647 нм вторичными антителами или самостоятельно.
  7. Инкубируют клетки с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, разведение 1:1000) в 250 мкл PBS в течение 10 мин с последующей последней промывкой PBS в течение 2 мин.
  8. Добавьте в каждую лунку 3-4 капли монтажной среды. Храните образцы при температуре 4 °C, чтобы установить их в течение не менее 2 ч перед визуализацией, чтобы убедиться, что монтажная среда установлена правильно.
  9. Захват изображений по меньшей мере 3 случайных кадров на образец гидрогеля с помощью флуоресцентного микроскопа, производя отдельные и объединенные каналы.

4. Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-qPCR)

  1. Перенесите гидрогели с адгезивными клетками для сбора РНК на новую пластину, чтобы свести к минимуму нежелательные РНК от клеток, прикрепленных к клеточной пластине. Промыть клетки PBS три раза, чтобы удалить мертвые клетки и культуральную среду.
  2. Извлеките общую мРНК с помощью набора для экстракции РНК. Выполняют обратную транскрипцию РНК в кДНК с помощью супермикса обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Выполняют RT-qPCR с грунтовками для Vcl в качестве маркера жесткости выбора и анализируют с использованием метода 2-ΔΔCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буквенная последовательность Vcl: Вперед 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; реверс 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Результаты

Получение гидрогеля и оценка жесткости с помощью ОВМ и модели Герца
Здесь приведен подробный протокол получения полиакриламидных гидрогелей различной жесткости путем регулирования соотношения акриламида и бис-акриламида. Однако полиакриламидные гидрогели не готовы к адг...

Обсуждение

Целью текущего исследования является обеспечение эффективной и действенной системы in vitro для лучшего понимания воздействия механических сигналов в NCC. В дополнение к следу пошаговому протоколу, упомянутому выше, исследователи должны иметь в виду, что клеточная культура NCC O9-1 зави?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Ана-Марию Заске, оператора установки Atomic Force Microscope-UT Core в Центре медицинских наук Техасского университета, за вклад в AFM в этом проекте. Мы также благодарим источники финансирования от Национальных институтов здравоохранения (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 и R01HL142704 J. Wang).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Ссылки

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174O9 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены