Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем метод выделения внеклеточных везикул (EV), полученных из лизатов тромбоцитов (PL), и их использование для покрытия титановых (Ti) поверхностей имплантатов. Мы описываем метод капельного литья, профиль высвобождения EV с поверхностей и биосовместимость in vitro поверхностей EV, покрытых Ti.
Внеклеточные везикулы (EV) являются биологическими нановезикулами, которые играют ключевую роль в клеточной коммуникации. Их содержание включает активные биомолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, которые представляют большой потенциал в регенеративной медицине. Совсем недавно EV, полученные из лизата тромбоцитов (PL), показали остеогенную способность, сравнимую с PL. Кроме того, биоматериалы часто используются в ортопедии или реставрации зубов. Здесь мы предлагаем метод функционализации ti-поверхностей с помощью ЭЛЕКТРОМОБИЛей, полученных из PL, с целью улучшения их остеогенных свойств.
Электромобили выделяются из PL с помощью хроматографии исключения размеров, а затем ti-поверхности функционализируются PL-EV путем капельного литья. Функционализация доказана высвобождением EV и его биосовместимостью с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH).
EV представляют собой мембранные везикулы (30-200 нм), секретируемые любой клеткой и играющие ключевую роль в межклеточной коммуникации, доставляя свой груз. Они содержат различные активные биомолекулы, которые могут включать нуклеиновые кислоты, факторы роста или биологически активные липиды1. По этим причинам электромобили были оценены на предмет их потенциального использования в терапии. С точки зрения ортопедии и регенерации костей, были протестированы электромобили из разных источников. Среди них было показано, что тромбоцитарные EV индуцируют дифференцировочный эффект на стволовые клетки при сохранении низкого цитотоксического профиля2,3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения возможности сочетания EV с биоматериалами с целью их использования в повседневной клинической практике.
Биоматериалы на основе титана широко используются в качестве каркасов для клинических вмешательств по заживлению костей из-за их механических свойств, высокой биосовместимости и долговечности4. Тем не менее, имплантаты Ti являются биоинертным материалом и, следовательно, обладают плохой способностью связываться с окружающей костной тканью5. По этой причине изучаются модификации титана с целью улучшения их характеристик за счет достижения более функционального микросреды на его поверхности4,6,7. В этом смысле электромобили могут быть привязаны к титану химическими8 или физическими взаимодействиями9,10. Иммобилизованные EV, полученные из стволовых клеток или макрофагов, повышают биоактивность Ti, способствуя клеточной адгезии и пролиферации, тем самым вызывая остеогенный эффект8,9,10.
Эта статья будет подробно посвящена стратегии капельного литья для покрытия поверхностей Ti электромобилями, полученными из PL. Кроме того, мы оценим профиль высвобождения электромобилей с поверхности покрытия с течением времени и подтвердим его клеточную биосовместимость in vitro.
Лизат тромбоцитов (PL) получают, как описано ранее, в соответствии с институциональными руководящими принципами3 с использованием свежих пушистых покрытий, предоставленных биобанком IdISBa в качестве исходного материала. Их использование для текущего проекта было одобрено его Комитетом по этике (IB 1995/12 BIO).
1. Изоляция электромобилей от PL
Рисунок 1: Принципиальная схема изоляции внеклеточного везикула (EV) лизата тромбоцитов (PL). PL центрифугируется сначала при 1 500 x g, а затем при 10 000 x g для удаления более крупных тел. Супернатант фильтруется через фильтры 0,8 и 0,2 мкм. Обработанные PL загружаются в колонну, а электромобили разделяются хроматографией исключения размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Характеристика электромобилей
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика электромобилей необходима для проведения функциональных исследований12. Ранее сообщалось о электронной микроскопии или характеристике западного пятна13. В настоящем докладе основное внимание будет уделено основным методам характеристик функционализации поверхности Ti.
3. Функционализация поверхности титана
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе используются обработанные титановые диски, c.p. grade IV, диаметром 6,2 мм и высотой 2 мм. Дисками можно манипулировать с помощью пинцета Ti, но важно не царапать поверхность. Кроме того, обработанная сторона должна быть обращена вверх в течение всего процесса.
Рисунок 2: Принципиальная схема пассивации Ti и функционализации электромобилей методом капельного литья. Имплантаты Ti сначала пассивируют путем инкубации в течение 30 мин в 30% растворе HNO3 при комнатной температуре. После нескольких смывов водой DI рН достигает нейтрального уровня. Затем имплантаты Ti инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в воде DI. После этого имплантаты высушиваются в вакуумных условиях при 40 °C. Для иммобилизации электромобилей 40 мкл раствора EV наносятся на имплантаты Ti. Затем имплантаты инкубируют в вакууме в течение 2 ч, пока EV физически не будут связаны с поверхностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Характеристика поверхности Ti
Метод, представленный в данной статье, позволяет получить электромобили функционализированных титановых дисков. Электромобили физически связаны с поверхностью, что обеспечивает устойчивое высвобождение с течением времени. Количество выпущенных электромобилей может быть измерено NT...
Этот протокол направлен на предоставление четких инструкций по функционализации электромобилей на поверхностях Ti. Представленный метод основан на стратегии капельного литья, которая является физисорбционным типом функционализации. Существует плохая библиография в отношении функц?...
Авторам нечего раскрывать.
Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III, Министерством экономики и конкуренции, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (MS16/00124; СР16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) и PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), финансируемые за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
1mL syringe | BD | 303174 | |
96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
Needle | Terumo | 946077135 | |
Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены