Тромбоцитарные внеклеточные везикулы функционализация Ti имплантатов

Резюме

Здесь мы представляем метод выделения внеклеточных везикул (EV), полученных из лизатов тромбоцитов (PL), и их использование для покрытия титановых (Ti) поверхностей имплантатов. Мы описываем метод капельного литья, профиль высвобождения EV с поверхностей и биосовместимость in vitro поверхностей EV, покрытых Ti.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (EV) являются биологическими нановезикулами, которые играют ключевую роль в клеточной коммуникации. Их содержание включает активные биомолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, которые представляют большой потенциал в регенеративной медицине. Совсем недавно EV, полученные из лизата тромбоцитов (PL), показали остеогенную способность, сравнимую с PL. Кроме того, биоматериалы часто используются в ортопедии или реставрации зубов. Здесь мы предлагаем метод функционализации ti-поверхностей с помощью ЭЛЕКТРОМОБИЛей, полученных из PL, с целью улучшения их остеогенных свойств.

Электромобили выделяются из PL с помощью хроматографии исключения размеров, а затем ti-поверхности функционализируются PL-EV путем капельного литья. Функционализация доказана высвобождением EV и его биосовместимостью с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH).

Введение

EV представляют собой мембранные везикулы (30-200 нм), секретируемые любой клеткой и играющие ключевую роль в межклеточной коммуникации, доставляя свой груз. Они содержат различные активные биомолекулы, которые могут включать нуклеиновые кислоты, факторы роста или биологически активные ^{липиды1}. По этим причинам электромобили были оценены на предмет их потенциального использования в терапии. С точки зрения ортопедии и регенерации костей, были протестированы электромобили из разных источников. Среди них было показано, что тромбоцитарные EV индуцируют дифференцировочный эффект на стволовые клетки при сохранении низкого цитотоксического ^{профиля2,3}. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения возможности сочетания EV с биоматериалами с целью их использования в повседневной клинической практике.

Биоматериалы на основе титана широко используются в качестве каркасов для клинических вмешательств по заживлению костей из-за их механических свойств, высокой биосовместимости и ^{долговечности4}. Тем не менее, имплантаты Ti являются биоинертным материалом и, следовательно, обладают плохой способностью связываться с окружающей костной ^{тканью5}. По этой причине изучаются модификации титана с целью улучшения их характеристик за счет достижения более функционального микросреды на его поверхности4,6,7. В этом смысле электромобили могут быть привязаны к титану ^{химическими8} или физическими ^{взаимодействиями9,10}. Иммобилизованные EV, полученные из стволовых клеток или макрофагов, повышают биоактивность Ti, способствуя клеточной адгезии и пролиферации, тем самым вызывая остеогенный эффект8,9,10.

Эта статья будет подробно посвящена стратегии капельного литья для покрытия поверхностей Ti электромобилями, полученными из PL. Кроме того, мы оценим профиль высвобождения электромобилей с поверхности покрытия с течением времени и подтвердим его клеточную биосовместимость in vitro.

протокол

Лизат тромбоцитов (PL) получают, как описано ранее, в соответствии с институциональными руководящими ^{принципами3} с использованием свежих пушистых покрытий, предоставленных биобанком IdISBa в качестве исходного материала. Их использование для текущего проекта было одобрено его Комитетом по этике (IB 1995/12 BIO).

1. Изоляция электромобилей от PL

1. Удаление более крупных тел
   1. Разморозить PL при комнатной температуре.
   2. Центрифуга PL при 1 500 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте гранулу, так как она содержит клеточный мусор.
   3. Соберите супернатант и выполните две последовательные центрифугации при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула соответствует более крупным электромобилям, таким как микровезикулы, и в этом случае она выбрасывается.
   4. Фильтруют супернатант сначала через пористую мембрану 0,8 мкм, а затем через пористую мембрану 0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги удаляют все ненужные электромобили.
   5. Объедините фильтрованный PL и храните при температуре -20 °C до использования.
2. Исключение размеров хроматография
   1. Уравновешивайте колонну, соединенную с хроматографическим оборудованием, с требуемой скоростью потока с фильтрованным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый расход зависит от характеристик колонны; в этом случае он установлен на 0,5 мл/мин.
   2. Загрузите обработанный PL (5 мл) шприцем на оборудование.
   3. Введите PL в колонну и начните собирать фракции 5 мл в пробирках по 15 мл.
   4. Соберите фракции, обогащенные электромобилями, и храните их при -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении эксперимента в первый раз охарактеризуйте все фракции путем количественной оценки белка и иммунодетекции для определения фракции, обогащенной ^EV3,11. В этом эксперименте собирается ^9-я фракция.
   5. Промыть хроматографическую колонку 30 мл 0,2% раствора NaOH и хранить его в 20% растворе этанола, как только он достигнет равновесия.

Рисунок 1: Принципиальная схема изоляции внеклеточного везикула (EV) лизата тромбоцитов (PL). PL центрифугируется сначала при 1 500 x g, а затем при 10 000 x g для удаления более крупных тел. Супернатант фильтруется через фильтры 0,8 и 0,2 мкм. Обработанные PL загружаются в колонну, а электромобили разделяются хроматографией исключения размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Характеристика электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика электромобилей необходима для проведения функциональных ^{исследований12}. Ранее сообщалось о электронной микроскопии или характеристике западного ^пятна13. В настоящем докладе основное внимание будет уделено основным методам характеристик функционализации поверхности Ti.

1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
   1. Разбавьте электромобили (1:1000) в 0,2 мкм отфильтрованной PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком концентрированные образцы или слишком разбавленные пробы будут находиться вне диапазона для определения НТА, и потребуется корректировка.
   2. Загрузите 1 мл разбавленных электромобилей шприцем в оборудование NTA и впрыскивайте их в оборудование NTA.
   3. Следуйте протоколу производителя для определения концентрации частиц и распределения по размерам.
2. Концентрация белка
   1. Определяют концентрацию, используя 1 мкл раствора EV. Измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длине волны 280 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EV должны иметь низкий уровень белков по сравнению с количеством частиц.
   2. Следуйте инструкциям производителя, чтобы получить показания абсорбции с помощью спектрофотометра.

3. Функционализация поверхности титана

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе используются обработанные титановые диски, c.p. grade IV, диаметром 6,2 мм и высотой 2 мм. Дисками можно манипулировать с помощью пинцета Ti, но важно не царапать поверхность. Кроме того, обработанная сторона должна быть обращена вверх в течение всего процесса.

1. Мойка дисков Ti
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем растворов, используемых для мойки Ti, должен быть достаточным для покрытия Ti-дисков. Поместите диски Ti в стеклянный стакан и налейте на них растворы. Затем удалите раствор путем декантирования.
   1. Промойте имплантаты Ti деионизированной (DI) водой, а затем выбросьте воду.
   2. Промыть имплантаты Ti этанолом на 70%, а затем декантировать для удаления раствора.
   3. Поместите имплантаты в воду DI и соникуйте при 50 °C в течение 5 минут. Выбросьте воду.
   4. Инкубировать имплантаты Ti в 40% растворе NaOH при 50 °C в течение 10 мин с перемешиванием. Выбросьте раствор.
      ВНИМАНИЕ: Раствор NaOH нагревается во время приготовления. Раствор является коррозионным и должен использоваться внутри вытяжной вытяжки.
   5. Обработайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 минут, а затем удалите воду.
   6. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5), пока она не достигнет нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
   7. Обработайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 минут и удалите воду.
   8. Инкубировать имплантаты Ti в 50% растворе _HNO3 при 50 °C в течение 10 мин с перемешиванием. Удалите раствор.
      ВНИМАНИЕ: _HNO3 является коррозионным и окислительным веществом, и его следует использовать внутри вытяжного шкафа.
   9. Обрабатывайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 мин. Удалите воду.
   10. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5) до получения нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
   11. Обрабатывайте имплантаты ультразвуком в воде DI при 50 °C в течение 5 мин. Удалите воду.
       ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент можно остановить, сохранив имплантаты Ti в 70% растворе этанола.
2. Ти пассивация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы пассивации Ti выполняются путем полного покрытия дисков Ti различными решениями в порядке, указанном ниже. Диски Ti помещают в стеклянный стакан и аккуратно наливают на них растворы. Объемы, используемые на всех этапах стирки, должны полностью покрывать имплантаты и удаляться с помощью декантирования.
   1. Инкубируйте имплантаты Ti в 30% растворе _HNO3 в течение 30 мин при комнатной температуре при мягком перемешивании. Удалите раствор.
   2. Выполните несколько промывок водой DI (не менее 5), пока она не достигнет нейтрального рН. Проверьте pH с помощью индикаторов pH.
   3. Инкубируйте имплантаты Ti на ночь при комнатной температуре в воде DI.
   4. Высушите имплантаты в вакуумных условиях при 40 °C в течение 10 мин.
3. Капельное литье электромобилей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для функциональных исследований клеток важно работать в шкафу клеточной культуры.
   1. Поместите имплантаты Ti в 96-луночную пластину, обработанную стороной вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантаты перевернуты вверх дном, можно использовать иглу, чтобы установить их обратно.
   2. Разморозьте раствор электромобилей и смешайте их с перемешиванием. Используйте вихрь для пульса в течение 3 с.
   3. Поместите электромобили на поверхность Ti. В этом исследовании капли 40 мкл раствора EV помещают на Ti для иммобилизации максимум 4 x 1011 EV на имплантат в соответствии с концентрацией, определенной NTA.
   4. Поместите пластины, содержащие Ti, в вакуумных условиях при 37 °C до полного высыхания капель (~2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время в зависимости от количества имплантатов и воды, присутствующей в вакуумной камере.

Рисунок 2: Принципиальная схема пассивации Ti и функционализации электромобилей методом капельного литья. Имплантаты Ti сначала пассивируют путем инкубации в течение 30 мин в 30% растворе _HNO3 при комнатной температуре. После нескольких смывов водой DI рН достигает нейтрального уровня. Затем имплантаты Ti инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в воде DI. После этого имплантаты высушиваются в вакуумных условиях при 40 °C. Для иммобилизации электромобилей 40 мкл раствора EV наносятся на имплантаты Ti. Затем имплантаты инкубируют в вакууме в течение 2 ч, пока EV физически не будут связаны с поверхностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Характеристика поверхности Ti

1. Исследование релиза
   1. Инкубировать поверхность Ti с 200 мкл фильтрованного PBS при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PBS фильтруется во избежание помех измерению NTA.
   2. Замените PBS в разные моменты времени и храните при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании были проанализированы 2-, 6-, 10- и 14-дневные временные точки.
   3. Анализ хранимых PBS для исследования частиц NTA в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация частиц в PBS в разное время является представлением профиля высвобождения EV с течением времени.
2. Исследования биосовместимости
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины человека (hUC-MSC), получают из биобанка IdISBa в соответствии с институциональными руководящими принципами.
   1. Поддерживать hUC-MSC в DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% FBS до использования. Меняйте среду два раза в неделю.
   2. Для посева клеток промыть клетки в колбах с 5 мл PBS дважды.
   3. Трипсинизируют hUC-MSC путем добавления 1 мл раствора трипсина. Убедитесь, что он полностью покрывает монослой клеток. Удалите раствор трипсина и поместите колбу для культивирования клеток при 37 °C примерно на 2 мин. Просмотр отслоения клеток под микроскопом. Отсоединившиеся клетки будут выглядеть округлой формы и будут находиться во взвешенном состоянии.
   4. Повторное суспендирование клеток в DMEM с низким содержанием глюкозы с 1% EV истощенным FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте носитель, дополненный 1% FBS, а затем ультрацентрифугу при 120 000 х г в течение 18 ч для удаления FBS-EV. Важно удалить ev, чтобы избежать помех с тромбоцитарными EV.
   5. Определение концентрации клеток путем подсчета количества клеток с камерой ^{Нойбауэра14}.
   6. Доведите hUC-MSC до концентрации 50 000 клеток/мл.
   7. Посадите 200 мкл клеточного раствора на имплантаты Ti.
   8. Через 48 ч собрать 50 мкл среды и выполнить цитотоксическое определение с использованием набора активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в соответствии с протоколом производителя.

Результаты

Метод, представленный в данной статье, позволяет получить электромобили функционализированных титановых дисков. Электромобили физически связаны с поверхностью, что обеспечивает устойчивое высвобождение с течением времени. Количество выпущенных электромобилей может быть измерено NT...

Обсуждение

Этот протокол направлен на предоставление четких инструкций по функционализации электромобилей на поверхностях Ti. Представленный метод основан на стратегии капельного литья, которая является физисорбционным типом функционализации. Существует плохая библиография в отношении функц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787