Автоматизированное культивирование микробов и адаптивная эволюция с использованием системы микробной микробной культуры (MMC)

Резюме

Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.

Аннотация

Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

Введение

Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов ^1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти методы имеют много проблем, таких как громоздкие операции, низкая пропускная способность, низкая эффективность и большое потребление труда и реагентов. Высокопроизводительные методы культивирования, разработанные в последние годы, в основном основаны на микропластине. Но микропластина имеет низкий уровень растворенного кислорода, плохие перемешивающие свойства, а также сильное испарение и тепловое воздействие, которые часто приводят к плохому состоянию роста и экспериментальному распараллеливанию микроорганизмов 4,5,6,7; с другой стороны, он должен быть оснащен дорогостоящим оборудованием, таким как рабочие станции для обработки жидкостей и считыватели микропластин, для достижения автоматизированного выращивания и обнаружения процессов ^8,9.

Как важная отрасль микрофлюидной технологии, капельная микрофлюидика была разработана в последние годы на основе традиционных микрофлюидных систем непрерывного потока. Это дискретная проточная микрофлюидная технология, которая использует две несмешивающиеся жидкие фазы (обычно масло-вода) для генерации дисперсных микрокапелей и работы на них¹⁰. Поскольку микрокапли имеют характеристики малого объема, большой удельной площади поверхности, высокой внутренней скорости массопереноса и отсутствия перекрестного загрязнения, вызванного компартментализацией, а также преимущества сильной управляемости и высокой пропускной способности капель, было проведено много видов исследований с применением микрофлюидной технологии капель в высокопроизводительном культивировании, скрининге и эволюции микроорганизмов¹¹ . Тем не менее, все еще существует ряд ключевых проблем, чтобы сделать микрофлюидную технологию капель популяризированной и широко применяемой. Во-первых, работа капельной микрофлюидики громоздка и сложна, что приводит к высоким техническим требованиям к операторам. Во-вторых, капельная микрофлюидная технология сочетает в себе оптические, механические и электрические компоненты и должна быть связана со сценариями применения биотехнологии. Одной лаборатории или команде трудно построить эффективные системы микрофлюидного контроля капель, если нет междисциплинарного сотрудничества. В-третьих, из-за небольшого объема микрокапли (от пиколитра (pL) до микролитра (μL)) требуется много трудностей для реализации точного автоматизированного управления и онлайн-обнаружения капель в режиме реального времени для некоторых основных микробных операций, таких как субкультуризация, сортировка и отбор проб, а также трудно построить интегрированную систему оборудования¹².

Для решения вышеуказанных проблем была успешно разработана автоматическая система микробной микрокапельной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии¹³. MMC состоит из четырех функциональных модулей: модуля распознавания капель, модуля обнаружения спектра капель, модуля микрофлюидного чипа и модуля выборки. Благодаря системной интеграции и управлению всеми модулями точно устанавливается автоматизированная система управления, включая генерацию, культивирование, измерение (оптическая плотность (OD) и флуоресценция), расщепление, слияние, сортировку капель, достигая интеграции таких функций, как посев, культивирование, мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса выращивания микробных капель. MMC может вмещать до 200 реплицированных единиц выращивания капель объемом 2-3 мкл, что эквивалентно 200 единицам культивирования колбы. Система культивирования микрокаплет может удовлетворять требованиям к незагрязнению, растворенному кислороду, смешиванию и массо-энергетическому обмену во время роста микроорганизмов и удовлетворять различные потребности микробных исследований с помощью многочисленных интегрированных функций, например, измерения кривой роста, адаптивной эволюции, однофакторного многоуровневого анализа и исследования и анализа метаболитов (на основе обнаружения флуоресценции)^13,14.

Здесь протокол подробно описывает, как использовать MMC для проведения автоматизированного и микробного культивирования и адаптивной эволюции (рисунок 1). Мы взяли кишечную палочку дикого типа (E. coli) MG1655 в качестве примера, чтобы продемонстрировать измерение кривой роста и метанол-эссенциальный штамм E. coli MeSV2.2¹⁵, чтобы продемонстрировать адаптивную эволюцию в MMC. Было разработано операционное программное обеспечение для MMC, которое делает операцию очень простой и понятной. Во всем процессе пользователю необходимо приготовить исходный раствор бактерий, установить условия MMC, а затем ввести раствор бактерий и связанные с ним реагенты в MMC. Впоследствии MMC будет автоматически выполнять такие операции, как генерация капель, распознавание и нумерация, культивирование и адаптивная эволюция. Он также будет выполнять онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция) капель с высоким временным разрешением и отображать соответствующие данные (которые могут быть экспортированы) в программном обеспечении. Оператор может остановить процесс культивирования в любое время в соответствии с результатами и извлечь целевые капли для последующих экспериментов. MMC прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет относительно высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллель данных, что имеет значительные преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.

протокол

1. Установка приборов и программного обеспечения

1. Выберите чистую и стерильную среду (например, чистую скамейку) в качестве выделенного постоянного пространства для MMC. Установите MMC стабильно в пространстве.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите MMC подальше от помех сильных электрических полей, магнитных полей и источников сильного теплового излучения. Избегайте сильной вибрации, влияющей на оптические компоненты обнаружения. Обеспечьте питание переменного тока AC220 В, 50 Гц для MMC. Для получения подробной информации о MMC обратитесь к Таблице материалов и веб-сайту MMC¹⁶.
2. Установите операционное программное обеспечение из файла MMC.zip
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свяжитесь с авторами для получения файла MMC.zip.
   1. Создайте выделенную папку и сохраните в ней zip-файл.
   2. Создайте еще одну выделенную папку в виде "Каталог установки". Распакуйте консоль MMC.zip и сохраните файлы в новой папке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация компьютера лучше всего подходит: (1) 64-разрядная операционная система Windows 7 или выше; (2) Процессор: i5 или выше; (3) память: 4 ГБ или выше; (4) жесткий диск: 300 ГБ или выше (скорость вращения более 7200 об/мин или твердотельный диск).

2. Препараты

1. Соедините шприцевую иглу (внутренний диаметр 0,41 мм, наружный диаметр 0,71 мм), быстрый соединитель А и флакон с реагентом (рисунок 2С) и автоклавируйте их при 121 °C в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слегка открутите крышку флакона с реагентом во время стерилизации. Каждый раз можно готовить еще несколько бутылок с реагентами для использования.
2. Используйте фильтр 0,22 мкм поливинилиденфторида (PVDF) для фильтрации масла MMC. Поместите микрофлюидный чип (рисунок 2B) и масло MMC в чистую скамью заранее и стерилизуйте их ультрафиолетовым облучением в течение 30 минут перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о быстром разъеме А, бутылке с реагентом, масле MMC и микрофлюидном чипе приведена в Таблице материалов.
3. Установка микрофлюидного чипа
   1. Откройте дверцу операционной камеры (рисунок 2А) и поднимите оптоволоконный зонд.
   2. Выровняйте отверстия электрического поля с помощью игл электрического поля и аккуратно поместите чип на пьедестал чипа. Затем вставьте две позиционирующие колонны в позиционирующие отверстия и положите оптический волоконный зонд (рисунок 2D).
   3. Подключите быстрый разъем A на микросхеме к соответствующему порту MMC согласно номеру положения (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Затем закройте дверцу операционной камеры.
4. Пополните масло MMC (примерно до 80 мл) в бутылке с маслом и опорожните отработанную жидкость в бутылке для отходов перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость для отходов обычно представляет собой органические отходы. Пожалуйста, обратитесь к региональному законодательству и нормативным актам при утилизации, которые могут быть изменены на основе экспериментальной установки.

3. Измерение кривой роста в MMC

1. Подготовка к исходному бактериальному раствору
   1. Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки среды Luria-Bertani (LB) и автоклава при 121°C в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты среды LB: NaCl (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и триптон (10 г/л).
   2. Извлеките штамм E. coli MG1655 из глицеринового бульона и культивируйте его в колбе 50 мл с 10 мл среды LB в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 5-8 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования зависит от конкретных штаммов. Оптимально культивировать штамм до логарифмического периода/фазы.
   3. Культивируют культивируемым раствором E. coli MG1655 со свежей средой до OD₆₀₀ 0,05-0,1 для получения исходного раствора бактерий (готовят около 10 мл).
2. Щелкните Инициализация , чтобы инициализировать консоль MMC. После появления интерфейса инициализации установите температуру культивирования на уровне 37 °C и значение фотоэлектрического сигнала на 0,6 (рисунок 3A). Инициализация займет около 20 минут.
3. Включите УФ-лампу (длина волны 254 нм) во время инициализации.
4. Введите исходный раствор бактерий и масло MMC во флакон с реагентом.
   1. Выньте стерилизованную бутылку реагента на чистую скамейку и затяните крышку.
   2. Используйте стерильный шприц объемом 10 мл для введения 3-5 мл масла MMC из шприцевой иглы боковой трубки. Наклоните и медленно вращайте бутылку с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.
   3. Введите около 5 мл исходного раствора бактерий, а затем заполните флакон с реагентом, снова введя 5-7 мл масла.
   4. Вытащите независимый быстрый разъем A и вставьте быстрый разъем A бутылки с реагентом в его быстрый разъем B для завершения операции впрыска образца (рисунок 4A).
5. Дождитесь окончания инициализации, а затем выключите ультрафиолетовую лампу (длина волны 254 нм).
6. Откройте дверцу операционной камеры и поместите бутылку с реагентом в металлическую ванну.
7. Вытащите разъем C2 чипа и быстрый разъем A бутылки с реагентом. Подключите разъем боковой трубки бутылки реагента к разъему C2, а соединитель верхней трубки к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.
8. Нажмите на кривую роста , чтобы выбрать функцию измерения кривой роста (рисунок 3A). В интерфейсе настройки параметров введите число как 15, включите переключатель обнаружения OD и установите длину волны как 600 нм. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь Number относится к количеству капель, которые должны быть сгенерированы. Длина волны относится к длине волны OD, которая должна быть обнаружена. Установите число (максимум 200) и длину волны (350-800 нм) в соответствии с требованиями эксперимента.
9. Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с запросом «Извлеките бутылку реагента между C2 и O2, затем, пожалуйста, нажмите кнопку OK после завершения», откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть бутылку реагента и подключите разъемы C2 и O2.
10. Закройте дверь и нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и определить значения OD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MMC обнаруживает значение OD, когда капля проходит через датчик оптического волокна. Поэтому период обнаружения зависит от количества генерируемых капель.
11. Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное в течение периода культивирования, в формате .csv, который может быть открыт соответствующим программным обеспечением (например, Microsoft Excel). Затем используйте картографическое программное обеспечение (например, EXCEL и Origin 9.0) для построения кривой роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса культивирования можно в любое время нажать на Экспорт данных , чтобы экспортировать данные OD всех текущих капель.

4. Адаптивная эволюция в MMC

1. Подготовка к исходному бактериальному раствору
   1. Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки специальной жидкой среды и твердых пластин для MeSV2.2 и автоклава при 121 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для компонентов специальной среды обратитесь к Таблице 1 и Таблице материалов.
   2. Культивируйте MeSV2.2 с помощью твердой пластины (диаметр = 90 мм) в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч. Затем соберите самостоятельную колонию и культивируйте ее в колбе для встряхивания 50 мл с 10 мл специальной жидкой среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 72 ч.
   3. Культивируемый раствор MeSV2.2 разводят средой до OD₆₀₀ 0,1-0,2 (убедитесь, что общий объем составляет не менее 10 мл) и продолжают культивировать его в колбе для встряхивания в течение 5 ч для получения исходного раствора бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MeSV2.2 является метаноло-незаменимым штаммом E. coli . Специальная жидкая среда содержит 500 ммоль/л метанола, что является сильным стрессом для MeSV2.2, что приводит к очень медленному росту. Обратите внимание, что получение исходного раствора бактерий здесь отличается от того, что описано в шаге 3.1.
2. Инициализируйте консоль MMC, как описано в шагах 3.2, 3.3 и 3.5.
3. Достаньте две стерилизованные бутылки с реагентами, одна из которых предназначена для исходного раствора бактерий, а другая - для свежей среды. Вводят исходный раствор бактерий (5 мл), свежую среду (12-15 мл) и масло MMC во флаконы с реагентами, как описано на этапе 3.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку адаптивная эволюция является долгосрочным процессом, включающим несколько субкультур, храните как можно больше свежей среды в MMC. Среда не может быть пополнена во время эксперимента.
4. Установите две бутылки с реагентами в MMC, как описано в шаге 3.6. Установите один для исходного раствора бактерий между разъемами C2 и O2, а другой для свежей среды между разъемами C4 и O4.
5. Нажмите на ALE , чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции (рисунок 3B). В интерфейсе настройки параметров включите переключатель OD Detection .
6. Установите число 50, длину волны 600 нм, концентрацию как 0%, введите как время, параметр как 30 ч и повторения как 99. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 25 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь «концентрация» относится к максимальной концентрации химических факторов для адаптивной эволюции. Для различных капель в MMC возможно введение различных концентраций химических факторов для обеспечения различных условий роста. Рассчитайте введенные концентрации, используя следующее уравнение:
   
   Здесь «С» относится к концентрации химических факторов, вводимых в капли; "а" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами С4 и О4; "b" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами C6 и O6; а "i" означает имеющуюся концентрацию. Существует восемь концентраций, доступных в MMC. Поскольку химический фактор здесь имеет единую концентрацию (500 ммоль/л метанола) и является одним из ингредиентов среды, здесь устанавливается только одна бутылка с реагентом, содержащая химический фактор, а концентрация устанавливается как 0%. Тип относится к режиму субкультуры, который делится на три типа: режим времени, режим значения OD и режим флуоресценции. Первый означает культивирование капель в течение фиксированного времени, а затем субкультурацию, в то время как последние два средства культивируют капли до заранее определенного значения OD / интенсивности флуоресценции, а затем субкультурируют. Параметр относится к соответствующему параметру, необходимому при выборе режима субкультуры. Повторения относятся к количеству субкультур.
7. Извлеките флакон с реагентом, помещенный между разъемами C2 и O2, как описано в шаге 3.8.
8. Обратите внимание, значительно ли увеличились максимальные значения ОД капель в течение каждого периода субкультуры. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD, как описано в шаге 3.9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь период субкультуры зависит от параметра. Например, при установке параметра Тип как Время и Параметр как 30 ч, период субкультуры равен 30 ч. В течение каждого периода субкультуры существуют максимальные значения OD капель. Оценить, соответствует ли адаптивная эволюция требованиям эксперимента за счет увеличения максимальных значений ОД (Увеличение зависит от фактического процесса культивирования штамма, например, увеличенного более чем на 20%).
   ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на то, исчерпана ли хранящаяся свежая среда. Если значительное увеличение не произошло даже после истощения среды, извлеките более быстрорастущие капли и проведите новый виток адаптивной эволюции.
9. Извлеките целевые капли из MMC.
   1. Нажмите на кнопку Скрининг , чтобы выбрать функцию извлечения капель (рисунок 3C). Выберите опцию Собирать , нажмите на количество целевых дроплетов, а затем нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капельный скрининг включает в себя "Сбор", "Выброс" и "Извлечение семенного раствора". "Экстракционный семенной раствор" означает сбор оставшихся капель¹³ после операции субкультуры.
   2. Подождите, пока всплывающее окно предложит: «Пожалуйста, вытащите быстрый разъем CF и поместите его в трубку EP». Вставьте быстрый разъем CF в трубку микроцентрифуги для сбора в соответствии с подсказкой программного обеспечения, а затем нажмите OK (рисунок 4D).
   3. Через 1-2 минуты в программном интерфейсе появится новое окно с подсказкой: «Пожалуйста, вставьте разъем обратно и нажмите OK , если закончите». Затем вставьте быстрый разъем CF обратно и нажмите OK , чтобы MMC продолжала работать (рисунок 4D). Когда следующая целевая капля достигнет сайта распознавания капель, повторите 4.9.2-4.9.3, чтобы собрать ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как все целевые капли будут собраны, MMC продолжит культивирование оставшихся капель. Если культивация не нужна, нажмите «Стоп», чтобы напрямую завершить операцию.
   4. Извлеките каплю с помощью пипетки объемом 2,5 мкл, опустите ее на агарозную пластину толщиной 90 мм и равномерно распределите треугольным стеклянным разбрасывающим стержнем с длиной стороны 3 см. Затем культивируйте его в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч.
   5. Соберите 3-5 самостоятельных колоний и отдельно культивируйте их в колбах по 50 мл с 10 мл свежей среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 48-72 ч. Следуйте соответствующим стандартным правилам для хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой трубке для последующих экспериментов.

5. Очистка MMC

1. После завершения эксперимента нажмите кнопку Стоп , чтобы остановить все операции. Затем нажмите « Очистить», чтобы очистить чип и трубки. Это займет около 15 минут.

Результаты

Этот протокол использует E. coli MG1655 и штамм MeSV2.2 в качестве примеров для демонстрации культивирования микробов и адаптивной эволюции, необходимой для метанола, с автоматизированной и относительно высокой пропускной способностью в MMC. Измерение кривой роста в основном использовалос...

Обсуждение

В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культив?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.