JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.

Аннотация

Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.

Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.

Введение

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергается олигомеризации посредством ассоциации своих DED, что приводит к образованию DED-нитей с последующей активацией и обработкой прокаспазы-8. Это запускает каскад каспазы, который приводит к гибели клеток(рисунок 1)3,4. Таким образом, прокаспаза-8 является центральным инициатором каспазы внешнего пути апоптоза, опосредованного CD95 или TRAIL-Rs, активированным на соответствующей макромолекулярной платформе, DISC.

Известно, что две изоформы прокаспазы-8, а именно прокаспаза-8а (p55) и -8b (p53), рекрутируются в DISC5. Обе изоформы состоят из двух DED. DED1 и DED2 расположены в N-концевой части прокаспазы-8a/b, за которой следуют каталитические домены p18 и p10. Детальный криоэлектронный микроскопический (крио-ЭМ) анализ DED прокаспазы-8 выявил сборку белков прокаспазы-8 в нитевидные структуры, называемыеDED-нитями 4,6. Примечательно, что первоначально предполагалось, что линейные цепи прокаспазы-8 будут заниматься димеризацией с последующей активацией прокаспазы-8 на ДИСК. Теперь известно, что эти цепи являются лишь подструктурой прокаспазы-8 ПСД, последняя состоит из трех цепей, собранных в тройнуюспираль 3,4,6,7.

При димеризации на нити DED конформационные изменения прокаспазы-8а/б приводят к образованию активного центра прокаспазы-8 и ее активации3,8. За этим следует обработка прокаспазы-8, которая опосредована двумя путями: первый идет через генерацию продукта расщепления p43 / p41, а второй - через начальное поколение продукта расщепления p30. Путь p43/p41 инициируется расщеплением прокаспазы-8a/b в Asp374, в результате чего образуются продукты расщепления p43/p41 и p12(рисунок 2). Далее эти фрагменты автокаталитически расщепляются на Asp384 и Asp210/216, давая начало образованию активного гетеротетрамера каспазы-8, p102/p1829,10,11. Кроме того, было показано, что параллельно пути обработки p43/p41 прокаспаза-8a/b также расщепляется на Asp216, что приводит к образованию продукта С-концевого расщепления p30 с последующим его протеолизом на p10 и p1810 (фиг.2).

Активация прокаспазы-8a/b в нити DED строго регулируется белками, называемыми c-FLIPs12. Белки c-FLIP встречаются в трех изоформах: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)и c-FLIPRaji (c-FLIPR). Все три изоформы содержат два DED в их N-концевой области. c-FLIPL также имеет С-концевой каталитически неактивный каспазоподобный домен12,13. Обе короткие изоформы c-FLIP-c-FLIPS и c-FLIPR-действуют антиапоптотическим образом, нарушая образование нити DED наДИСКЕ 6,14,15. Кроме того, c-FLIPL может регулировать активацию каспазы-8 в зависимости от концентрации. Это может привести как к про-, так и к антиапоптотическим эффектам16,17,18. Образуя каталитически активный гетеродимер прокаспазы-8/c-FLIPL, c-FLIPL приводит к стабилизации активного центра прокаспазы-8 и его активации. Про- или антиапоптотическая функция c-FLIPL напрямую зависит от его количества на DED нитях и последующего количества собранных гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL 19. Низкие или промежуточные концентрации c-FLIPL на DISC приводят к достаточному количеству гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL на нити DED, что поддерживает активацию каспазы-8. Напротив, увеличение количества c-FLIPL непосредственно приводит к его антиапоптотическим эффектам на DISC20.

В совокупности активация и обработка прокаспазы-8a/b на DISC представляет собой строго регулируемый процесс, включающий несколько этапов. В данной работе рассматривается измерение обработки прокаспазы-8 непосредственно на ДИСК, а также анализ состава этого комплекса. Это будет представлено с использованием CD95 DISC в качестве образцового комплекса АВАРИЙНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты с Т-клетками проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.

1. Подготовка клеток к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этой иммунопреципитации составляет 1 × 107. Адгезивные клетки должны быть посеяны за один день до эксперимента, чтобы в день эксперимента было 1 ×10 7 клеток.

  1. Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
    1. Семена 5-8 × 106 адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов композиции) для каждого состояния в посуде по 14,5 см за день до начала эксперимента.
    2. В день эксперимента убедитесь, что клетки на 80-90% сливаются и прилипают к блюду. Выбросьте среду и добавьте свежую среду в клетки адгезивов.
  2. Подготовка суспензионных клеток к эксперименту
    1. Аккуратно поместите 1 × 107 суспензионных клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
    2. При использовании первичных клеток выделяют первичные Т-клетки в соответствии с ранее описанной процедурой21. Обрабатывайте первичные Т-клетки 1 мкг/мл фитогемагглютинином в течение 24 ч, а затем 25 Ед/мл IL2 в течение 6 дней.
    3. Тщательно поместите 1 × 108 первичных Т-клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для композиции) в каждое условие в чашках по 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется увеличить количество первичных Т-клеток, так как эти клетки меньше.

2. Стимуляция CD95L

  1. Стимулируют клетки CD95L (продуцируются, как описаноранее 20 или коммерчески доступны (см. Таблицу материалов)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация CD95L и время стимуляции зависят от клеточного типа13,15,22,23,24,25. Подготовьте одно условие стимуляции дважды, чтобы параллельно сгенерировать образец «контроля бусины».
    1. Стимулируют адгезивные клетки выбранной концентрацией CD95L. Держите пластину под углом и пипетируйте лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
    2. Стимулируйте клетки суспензии CD95L путем пипетирования раствора лиганда в клеточную суспензию.

3. Сбор и лизис клеток

  1. Поместите клеточную посуду на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте носитель. Умирающие клетки плавают в среде и важны для анализа.
  2. Добавьте 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в клеточную суспензию и соскоблите прикрепленные ячейки с пластины. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
  3. Дважды вымойте посуду с 10 мл холодного PBS и поместите раствор для мытья в ту же трубку объемом 50 мл. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С.
  4. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1 мл холодного PBS.
  6. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °С. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл лизисного буфера (содержащего 4% коктейля ингибитора протеазы). Инкубируйте его в течение 30 минут на льду.
  7. Центрифугировать лизат с максимальной скоростью (~17 000 × g)в течение 15 мин, 4 °C.
  8. Переложите супернатант (лизат) в чистую трубку. Выбросьте гранулу. Возьмите 50 мкл лизата в другой пробирке. Проанализируйте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда и возьмите количество лизата, соответствующее 25 мкг белка во флаконе. Добавьте буфер загрузки (см. Таблицу материалов для состава) во флакон. Храните его при температуре -20 °C в качестве контроля лизата.

4. Иммунопреципитация (ИП)

  1. Добавьте к лизату 2 мкл антител против АПО-1 и 10 мкл бусин сефарозы белка А (приготовленных по рекомендации производителя). Добавьте только 10 мкл шариков в отдельную пробирку, содержащую лизат (стимулированный образец), чтобы создать «контроль шариков».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипетки с широкими отверстиями, либо разрезая наконечники, либо покупая специальные наконечники для IP при работе с бусинами сефарозы белка А.
  2. Инкубировать смесь лизата с антителами/белком А сефарозными шариками с мягким перемешиванием в течение ночи при 4 °C. Центрифугировать лизаты антителами/белком А сефарозными шариками при 500 × г в течение 4 мин, 4 °С. Выбросьте супернатант, добавьте в бусины 1 мл холодного PBS и повторите этот шаг не менее трех раз.
  3. Выбросьте супернатант. Аспирировать шарики предпочтительно с помощью 50 мкл гамильтоновского шприца.

5. Вестерн Блот

  1. Добавьте 20 мкл 4-кратного нагрузочного буфера (см. Таблицу материалов для композиции) к шарикам и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин. Нагревайте элементы управления лизатом при 95 °C в течение 5 мин.
  2. Загрузите лизаты, IP и белковый стандарт на 12,5% гель додецилсульфата натрия (SDS) (см. Таблицу материалов для приготовления геля) и работайте с постоянным напряжением 80 В.
  3. Перенесите белки из геля SDS в нитроцеллюлозную мембрану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь полусухой метод, оптимизированный для интересующих белков, был использован для переноса в течение 12 мин (25 В; 2,5 А = постоянная). Замочите нитроцеллюлозную мембрану и две мини-стопки переноса в буфере электрофореза (см. Таблицу материалов для композиции, подготовьте согласно инструкции производителя) за несколько минут до вестерн-блоттинга.
  4. Поместите промокаемую мембрану в коробку и заблокируйте ее на 1 ч в блокирующем растворе (0,1% Tween-20 в PBS (PBST) + 5% в молоке). Инкубировать мембрану блокирующим раствором при мягком перемешивании.
  5. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.

6. Обнаружение вестерн-блоттинга

  1. Добавьте первое первичное антитело в указанном разведении (см. Таблицу материалов)к мембране и инкубируйте его в течение ночи при 4 °C с мягким перемешиванием.
  2. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
  3. Инкубировать мембрану с 20 мл вторичного антитела (разбавленного 1:10 000 в ПБСТ + 5% молока) с легким встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Промывайте мембрану три раза ПБСТ в течение 5 мин каждую стирку.
  5. Отбросьте ПБСТ и добавьте примерно 1 мл субстрата пероксидазы хрена в мембрану.
  6. Обнаружение хемолуминесцентного сигнала (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции и количество захваченных изображений зависят от количества белка в клетке и специфичности используемых антител. Он должен быть установлен эмпирически для каждого антитела, используемого для обнаружения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для анализа набора каспазы-8 в DISC и ее обработки на CD95 DISC, в этой статье описывается классический рабочий процесс, который сочетает IP CD95 DISC с западным блот-анализом. Это позволяет обнаружить несколько ключевых особенностей активации каспазы-8 на ДИСК: сборка макромолекулярной платформы, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот подход был впервые описан Kischkel et al.27 и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.

Во-первых, важно соблюд?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим Фонд Вильгельма Сандера (2017.008.02), Центр динамических систем (CDS), финансируемый программой ЕС ERDF (Европейский фонд регионального развития) и DFG (LA 2386) за поддержку нашей работы. Мы благодарим Карину Гуттек за поддержку наших экспериментов. Мы благодарим профессора Дирка Рейнхольда (OvGU, Магдебург) за предоставление нам первичных Т-клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12.5% SDS gelself madefor two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
acrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin AbSigma AldrichA2103dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by EnzoALX-805-038-C100used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Abcell signaling9662 Sdilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-Edilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Abcell signaling9542dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006used according to manufacturer's instructions
CD95Lprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis bufferself made10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001for activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL		Bio Rad161-0747prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
lysis bufferself made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powderCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTself made20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkself made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801for activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

Ссылки

  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174CD95 DISC8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены