Дуральная стимуляция и периорбитальное тестирование фон Фрея на мышах как доклиническая модель головной боли

Резюме

Наиболее заметным симптомом мигрени является сильная головная боль, и предполагается, что это опосредовано сенсорными нейронами, иннервирующими мозговые оболочки. Здесь мы представляем метод локального нанесения веществ на твердую мозговую оболочку минимально инвазивным способом, используя гиперчувствительность лица в качестве выхода.

Аннотация

Считается, что черепные мозговые оболочки, состоящие из твердой мозговой оболочки, арахноидальной и пиа-матер, в первую очередь выполняют структурные функции для нервной системы. Например, они защищают мозг от черепа и закрепляют/организуют сосудистое и нейронное снабжение коры. Тем не менее, мозговые оболочки также участвуют в расстройствах нервной системы, таких как мигрень, где боль, испытываемая во время мигрени, приписывается местному стерильному воспалению и последующей активации местных ноцицептивных афферентов. Из слоев в мозговых оболочках твердые мозги представляют особый интерес в патофизиологии мигрени. Он сильно васкуляризирован, содержит местные ноцицептивные нейроны и является домом для разнообразного массива резидентных клеток, таких как иммунные клетки. Тонкие изменения в местном менингеальном микроокружении могут привести к активации и сенсибилизации дуральных периваскулярных ноцицепторов, что приводит к мигрени. Исследования были направлены на то, чтобы выяснить, как дуральные афференты активируются / сенсибилизируются с использованием электрофизиологии in vivo, методов визуализации или поведенческих моделей, но они обычно требуют очень инвазивных операций. В этом протоколе представлен метод сравнительно неинвазивного применения соединений на твердой мозговой оболочке у мышей и подходящий метод измерения головной боли подобной тактильной чувствительности с использованием периорбитального тестирования фон Фрея после дуральной стимуляции. Этот метод поддерживает целостность твердой мозговой оболочки и черепа и уменьшает смешанные эффекты от инвазивных методов путем введения веществ через модифицированную канюлю 0,65 мм в месте соединения несросшихся сагиттальных и лямбдовидных швов. Эта доклиническая модель позволит исследователям исследовать широкий спектр дуральных стимулов и их роль в патологическом прогрессировании мигрени, таких как активация ноцицепторов, активация иммунных клеток, сосудистые изменения и болевое поведение, сохраняя при этом безвредные состояния черепа и мозговых оболочек.

Введение

Боль при мигрени остается серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Всемирная организация здравоохранения оценивает его как шестое наиболее распространенное заболевание в мире, поражающее чуть менее 15% населения Земли¹ и вызывающее существенное социально-экономическое бремя для общества ^2,3. Варианты лечения и их эффективность были неоптимальными и обеспечивают только симптоматическое облегчение и существенно не изменяют патофизиологические события, которые вызывают возникновение мигрени ^4,5. Отсутствие успеха лечения, вероятно, связано с тем, что мигрень является многофакторным расстройством, патология которого плохо изучена, что приводит к ограниченному числу терапевтических целей. Мигрень также сложно полностью уловить на животных моделях, особенно учитывая, что диагноз мигрени ставится на основе вербального общения с пациентами, которые описывают свой опыт с признаками мигрени, такими как аура, головная боль, светобоязнь и аллодиния. Несмотря на это, важно отметить, что последние достижения в лечении мигрени в настоящее время превосходят методы лечения многих неврологических состояний, которые были хорошо подтверждены доклиническими моделями. Например, моноклональные антитела и небольшие молекулы, которые нацелены на пептид, связанный с геном кальцитонина, или его рецептор были очень успешными в улучшении качества жизни страдающих мигренью и потенциально могут трансформировать клиническое ведение мигрени. Несмотря на то, что в понимании этого расстройства был достигнут прогресс, многое еще предстоит выяснить.

Основываясь на доклинических моделях на животных и исследованиях на людях, широко признано, что головные боли мигрени инициируются аберрантной активацией ноцицептивных волокон в мозговых оболочках, которые сигнализируют через тройничные и верхние шейные дорсальные ганглии 6,7,8,9,10. Несмотря на эту теорию, многие исследования по-прежнему используют системное введение лекарств для понимания основных механизмов, способствующих мигрени. Хотя системная дозировка лекарств существенно укрепила наше понимание, эти результаты напрямую не оценивают, играют ли местные действия в целевой ткани, представляющей интерес, роль в мигрени. И наоборот, в нескольких исследованиях использовался подход к стимуляции твердой мозговой оболочки; однако эти эксперименты требуют имплантации канюли с помощью инвазивной трепанации черепа и длительного времени восстановления^11,12. Из-за этих ограничений мы разработали минимально инвазивный подход к местной стимуляции твердой мозговой оболочки, где отсутствие трепанации черепа исключает послеоперационное восстановление и позволяет проводить немедленное тестирование на бодрствующих животных 12,13,14. Эти инъекции выполняются под легким изофлурановым наркозом и вводятся в месте соединения сагиттального и лямбдовидного швов у мышей.

Было разработано несколько подходов для оценки ноцицептивных поведенческих реакций у грызунов¹⁵. Кожная аллодиния была зарегистрирована примерно у 80% страдающих мигренью^16,17 и представляет собой потенциальную трансляционную конечную точку для использования у грызунов. В доклинических моделях применение нитей фон Фрея к подошвенной области лапы грызуна использовалось для оценки болевого поведения в доклинических моделях мигрени. Основным ограничением этого подхода является то, что он не тестирует головную область. Оценка лицевой гримасы использовалась для выявления болевого поведения у грызунов путем анализа выражений лица после индукции болевых стимулов^18,19. Тем не менее, его ограничения включают только захват реакций на острые раздражители, а не хронические орофациальные болевые состояния. Уход за лицом и снижение выращивания также считаются результатами поведенческих реакций в доклинических моделях мигрени^20,21. Ограничения первого включают трудности в дифференциации болевых реакций от обычного рутинного ухода и других ощущений, таких как зуд. В последнем случае поведение при выращивании обычно быстро снижается после введения грызунов в новые среды. Хотя каждая из этих поведенческих конечных точек ценна для понимания различных механизмов, которые способствуют болевым состояниям, существует острая необходимость в доклинических моделях болевых расстройств, таких как мигрень, для включения конечных точек, которые конкретно фиксируют реакции цефальной гиперчувствительности. Оценка тактильной гиперчувствительности периорбитальной кожи после дуральной стимуляции является методом, который может обеспечить лучшее понимание механизмов, способствующих мигрени, где сенсорные симптомы носят преимущественно цефальный характер. Здесь мы описываем метод введения веществ на твердую мозговую оболочку мыши как доклиническую модель мигрени. После применения дюралей мы также представляем подробный метод тестирования периорбитальной тактильной гиперчувствительности с использованием калиброванных нитей фон Фрея, применяемых в методе Диксона вверх-вниз.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были проведены с предварительного одобрения институционального Комитета по уходу и использованию животных в Техасском университете в Далласе. В этом исследовании использовались мыши ICR (CD-1) (30-35 г) и C57/BL6 (25-30 г) в возрасте 6-8 недель.

1. Дураловый инфузор

1. Создайте мышиные инфузоры/инжекторы, модифицировав коммерчески доступную внутреннюю канюлю и инфузор для односторонних инъекций с неметаллическим плавленым кварцевым пластиковым колпачком, который регулируется и вставляется в/простирается ниже направляющей канюли 28 Г с внутренним диаметром (I.D.) 0,18 мм и наружным диаметром (O.D.) 0,35 мм (рисунок 1A).
2. Используйте штангенциркуль или другое измерительное устройство для регулировки расплавленного кремнеземного пластикового колпачка на инфузоре до длины 0,6 мм; измеряется от кончика инфузора до края кремнеземного пластикового колпачка.
   1. Соблюдайте осторожность, чтобы не согнуть и не затупить инфузор при регулировке пластикового колпачка.
   2. Для других штаммов мышей, которые ранее не использовались для инъекций дураля, определите оптимальную длину инфузии, установив длину на 0,6 мм и проведя пилотные инъекции чернилами или красителем, регулируя длину инфузии до тех пор, пока не будет замечено, что краситель находится только в твердой мозговой оболочке, а не на мозге или черепе.
3. Прикрепите длинный конец (или конец, который не был измерен как 0,6 мм) отрегулированного инфузионного насоса к пластиковой трубке (насосная трубка, 2-ступенчатая, I.D. 0,19 мм, длина 406 мм).
   1. Разрежьте трубку на минимальную длину 8 дюймов, чтобы обеспечить достаточную линию для удержания объема 5 мкл.
   2. Убедитесь, что трубка покрывает металлическую часть и верхнюю часть пластиковой пробки, расположенную на инфузии. Это поможет предотвратить накопление пузырьков воздуха в линии.
4. Прикрепите другой конец трубки к стеклянному микрошприцу объемом 10 мкл (газонепроницаемый; цементированная игла; 21 г с выступом 10 мм), опять же, убедившись, что над металлической частью шприца есть плотное уплотнение (рисунок 1А).
5. После соединения линии засыпьте шприц 5 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), синтетической интерстициальной жидкости (SIF) или других транспортных средств по выбору, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
   1. Если в линии наблюдаются пузырьки воздуха, затопите линию транспортным средством до тех пор, пока пузырьки не рассеются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь заполнить шприц транспортным средством перед его прикреплением к линии, а затем протолкнуть жидкость через линию после подключения.
6. После того, как линия заполнена 5 мкл транспортного средства и работает эффективно, загрузите 5 мкл лекарственного средства / раствора в шприц Гамильтона (чернила или краситель могут быть использованы в качестве альтернативы препарату / раствору при изучении или практике этой техники).
   1. Убедитесь, что все растворы транспортного средства, вводимые на твердое вещество, поддерживаются при рН 7,4 и измеряются до осмоляльности 310. Это уменьшает потенциальную активацию кислотно-чувствительных ионных каналов и других осмочувствительных каналов в твердой мозговой оболочке.
7. Максимальный объем, протестированный на мышах, которые не вызывали утечки в мозг, составляет примерно 10 мкл. Поведенческие эффекты после инъекций с таким объемом не тестировались. По этой причине вводят только 5 мкл раствора на твердую мозговую оболочку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наблюдения основаны на штаммах мышей / возрасте / весе 6-8-недельных мышей CD1 / ICR.

2. Инъекции дуралей

1. После того, как шприц приготовлен и препарат загружен, поместите мышь на брюшко и обезболите ее под коротким 3% изофлураном со скоростью потока кислорода 0,5-1 л / мин через носовой конус.
   1. После того, как мышь перестанет проявлять рефлекс защемления, отрегулируйте анестезию и поддерживайте ее на уровне 1,5% изофлурана.
2. После обезболивания нанесите стерильную офтальмологическую мазь на глаза и побрейте голову животного, затем продезинфицируйте кожу повидон-йодом и этанолом. После этого встаньте в положение, способствующее успешной инъекции.
3. Используйте одну руку, чтобы стабилизировать голову животного, а другой рукой держите инфузию.
4. Тщательно прощупайте и найдите стык сагиттального и лямбдоидального швов на черепе мыши (рисунок 1B, C).
   1. Чтобы обнаружить это незаметное соединение через кожу, используйте топографические особенности черепа и осторожно прощупайте общее местоположение соединения с инфузией.
   2. Проверьте положение соединения, перепозиционировав инфузию вдоль черепа и почувствовав точное местоположение.
5. Как только шов будет локализован и инфузия будет на месте, очень медленно и осторожно пошевелите инфузией вперед и назад, пока она не проткнет кожу и не упадет вниз в соединение вплоть до пластиковой пробки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в соединение вставлен весь наконечник инфузора толщиной 0,6 мм.
6. Чтобы проверить точность, используйте чернила или краситель в качестве инъекционного раствора и усыплитируйте и обезглавливайте мышь.
   1. Снимите крышку черепа, чтобы визуализировать краситель внутри твердой мозговой оболочки (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель не должен наблюдаться на головном мозге или внешней стороне черепа. Аналогичным образом, мыши в любом эксперименте должны быть проверены посмертно, чтобы проверить точность инъекции, а также убедиться, что целостность твердой мозговой оболочки не была повреждена.
7. После инъекции извлеките мышь из анестезии, подождите, пока она придет в сознание, а затем вернитесь в свою клетку или поместите ее в тестовую камеру, чтобы начать желаемые анализы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте мыши восстановиться после анестезии в течение как минимум 30 минут, прежде чем проводить какие-либо поведенческие эксперименты.

3. Периорбитальный фон Фрей

1. Начните исследование с когорты примерно из 16-20 мышей.
2. За день до привыкания обрабатывайте каждую мышь не менее 5 минут.
3. Примерно через 24 часа после обработки приучите мышей к условиям испытательной комнаты и испытательному аппарату фон Фрея (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат для тестирования акрила состоит из отдельных отсеков с крышками размером приблизительно 3 x 3,5 дюйма x 5 дюймов (Ш x В x Г) и поддерживается алюминиевыми подставками, соединенными через 0,25 в квадратной оцинкованной стальной сетчатой проволоке 19 G.
   1. Поместите мышей в горизонтально расположенный стаканчик из белой бумаги весом 4 унции, который не имеет запаха и не содержит полиэтиленового или парафинового воска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти типы чашек предпочтительны, потому что они уменьшают желудочно-кишечное расстройство у мышей при приеме внутрь (рисунок 2B).
4. Пока животные находятся в своих соответствующих камерах, поместите гранулу нормальной диеты чау в отдельную камеру каждой мыши, чтобы успокоить животных и избежать любого ненужного стресса для животных. Делайте это в течение 3 дней до любого тестирования поведения фон Фрея.
   1. Убедитесь, что каждый раз, когда мыши находятся в камере, есть доступ к пище.
   2. Пронумеруйте и присвойте каждому животному одно и то же место в испытательной стойке. Помещайте мышь в одну и ту же чашку каждый день периода тестирования, чтобы убедиться, что каждое животное привыкает к своей тестовой среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши будут грызть чашки и впоследствии разрушать чашки. Если это произойдет, замените чашку и пометьте ее соответствующим номером мыши.
5. После первых 3 дней привыкания поместите мышей в их отдельные камеры.
   1. Позвольте животным акклиматизироваться в испытательной комнате и камерах в течение не менее 1 часа перед любым тестированием фон Фрея, чтобы мыши успокоились и впоследствии их было легче тестировать.
6. После акклиматизации в комнате в день тестирования извлеките одну мышь, все еще находящуюся в чашке, из соответствующей камеры.
   1. Поддерживайте чашку в горизонтальном положении, чтобы мышь находилась как на передних лапах, так и на задних лапах, чтобы помочь их весу равномерно распределиться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неравное распределение веса может изменить реакцию животных и даже помешать животным реагировать.
7. Поместите чашку с мышью внутрь на стол под испытательной стойкой на абсорбирующей прокладке.
8. Для периорбитального тестирования фон Фрея поместите нить 0,07 г фон Фрея непосредственно в центр лица и между глазами.
9. Приложите достаточное давление на нить, чтобы волосы фон Фрея согнулись в образование в форме «С».
   1. Поддерживайте контакт с областью не менее 3 с, но не более 5 с или до тех пор, пока мышь не выведет голову и не проведет лапой по нити.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нить накала скользит или больше, чем кончик нити накала касается животного во время испытаний, любые ответы не должны учитываться. Эти реакции могут быть в ответ на щетку, которые активируются различными механорецепторами и, следовательно, могут не отражать точные результаты.
   2. Применяют нити фон Фрея по методу Диксона «вверх-вниз»^22,23.
      1. Первоначально применяют нить фон Фрея, которая имеет вес 0,07 г. Наименьшая возможная нить и самая высокая испытанная нить в этом исследовании представляют собой нити с массой 0,008 г и 0,6 г соответственно.
      2. Используйте нити массой 0,008 г, 0,02 г, 0,04 г, 0,07 г, 0,16 г, 0,4 г и 0,6 г для выполнения этого анализа.
      3. В этом методе, если животное не проявляет реакции на нить, применяют нить следующего более высокого веса грамма.
      4. Если мышь реагирует на нить, учтите, что мышь реагирует на эту нить. Если это так, примените нить следующего меньшего веса грамма.
      5. Повторяйте эту схему до тех пор, пока животное не будет протестировано 4 раза после первоначального ответа или животное не будет определено как не реагирующее на любые нити, протестированные в анализе.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от применения любого дополнительного давления, исходящего от руки или запястья. Для практической практики применения нити накала может использоваться шкала.

4. Тестирование базовых пороговых значений вывода средств

1. Перед включением в эксперимент убедитесь, что мыши достигают базового порога отмены между 0,5-0,6 г.
   1. Мышь достигает исходного уровня, если она не реагирует на какую-либо нить, испытанную в серии, упомянутой на этапе 3.9.2.2 (0,07 г, 0,16 г, 0,4 г и 0,6 г).
2. Тестируйте мышей ежедневно при установлении базовых порогов отмены.
   1. Тестирование позволяет животным акклиматизироваться к условиям тестирования и давлению нитей фон Фрея.
   2. Если мыши все еще чрезвычайно гиперчувствительны после третьего дня тестирования, попробуйте подождать 1 или 2 дня, прежде чем снова тестировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много времени между днями тестирования может привести к тому, что животное не сможет приспособиться к весу нити накаливания на периорбитальной области, тем самым не достигнув целевого порога вывода.
3. Тестируйте мышей в течение примерно 7 дней, прежде чем определить, какие животные не соответствуют критериям включения в эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 70% мышей достигнут целевого базового уровня.
   1. Перед дуральной стимуляцией проанализируйте исходные данные, чтобы исключить любую мышь, которая не достигла исходного значения 0,5-0,6 грамма или выше.
   2. После исключения случайным образом выделите каждую оставшуюся мышь в тестовую группу. Достигните этого, нарисовав чашку или написав сценарий в электронной таблице, чтобы рандомизировать числа в группе.

5. Анализ результатов фон Фрея

1. После получения серии ответов определяют дельту, значение k, порог 50% и порог вывода в граммах в соответствии с ранее опубликованными методами²⁴.
2. Рассчитайте порог вывода, используя эту формулу WT = 10^(x*F+B),где WT= порог вывода, F = порог вывода лапы, рассчитанный методом Чаплана, и B = линейная регрессия логарифма (сила изгиба) = x*Число нити накала + B.
3. Постройте данные в виде либо 50% порога вывода, либо среднего порога вывода в граммах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот метод инъекции используется для введения стимулов на твердую мозговую оболочку мышей, чтобы могло произойти последующее поведенческое тестирование. Наиболее распространенным поведенческим результатом, измеренным с помощью этой модели, является кожная гиперчувствительность ли...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Дезадаптивные изменения в местной ноцицептивной системе в твердой мозговой оболочке считаются ключевым фактором фазы головной боли приступов мигрени, несмотря на отсутствие повреждения тканей^25,26. Здесь в исследовании представлен метод, при котором ми?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 oz Hot Paper Cups	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula	P1 Technologies (formerly Plastics One)	8IC313ISPCXC	I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html