JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Убиквитинация является критической посттрансляционной модификацией белка, дисрегуляция которой была вовлечена в многочисленные заболевания человека. Этот протокол подробно описывает, как фаговый дисплей может быть использован для выделения новых вариантов убиквитина, которые могут связывать и модулировать активность лигазов E3, которые контролируют специфичность, эффективность и паттерны убиквитинирования.

Аннотация

Убиквитин представляет собой небольшой белок 8,6 кДа, который является основным компонентом системы убиквитин-протеасома. Следовательно, он может связываться с разнообразным массивом белков с высокой специфичностью, но низкой аффинностью. С помощью фагового дисплея варианты убиквитина (UbV) могут быть спроектированы таким образом, что они демонстрируют улучшенное сродство к убиквитину дикого типа и сохраняют специфичность связывания с целевыми белками. Фаговый дисплей использует библиотеку фагемидов, в соответствии с которой белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13 (выбранный потому, что он отображается снаружи на поверхности фага) сливается с UbVs. Специфические остатки убиквитина дикого типа человека мягкие и рандомизированные (т.е. существует уклон в сторону нативной последовательности диких типов) для генерации UbV, чтобы избежать вредных изменений в конформации белка при одновременном введении разнообразия, необходимого для содействия новым взаимодействиям с целевым белком. Во время процесса отображения фагов эти UbV экспрессируются и отображаются на белках фаговой оболочки и сравниваются с интересующим белком. UbV, которые демонстрируют благоприятные связывающие взаимодействия с целевым белком, сохраняются, в то время как плохие связующие смываются и удаляются из библиотечного пула. Сохраненные UbV, которые присоединены к фаговой частице, содержащей соответствующий фагемид UbV, элюируют, усиливают и концентрируют таким образом, чтобы их можно было панорамировать против того же целевого белка в другом раунде фагового дисплея. Как правило, выполняется до пяти раундов отображения фагов, во время которых сильное давление отбора накладывается на UbV, которые связываются слабо и / или беспорядочно, так что те, у кого более высокое сродство, концентрируются и обогащаются. В конечном счете, UbV, которые демонстрируют более высокую специфичность и /или сродство к целевому белку, чем их аналоги дикого типа, выделяются и могут быть охарактеризованы с помощью дальнейших экспериментов.

Введение

Понимание молекулярных деталей белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для определения механизмов сигнальной трансдукции биологических процессов, особенно тех, которые способствуют клинически важным заболеваниям. В последние годы фаговой дисплей использовался в качестве практичного и доступного метода выделения белков/пептидов с значительно улучшенным связыванием с желаемым целевым белком1,2,3,4, который, в свою очередь, может быть использован в качестве внутриклеточных зондов белково-белковых взаимодействий.

Убиквитинирование представляет собой каскад ферментативной активности (активирующий фермент E1 → конъюгирующий фермент E2 → лигазы E3), которые ковалентно конъюгируют убиквитин (Ub) с белковыми субстратами, чтобы нацелить их на деградацию или опосредовать изменения клеточной сигнализации. Кроме того, деубиквитиназы катализируют удаление убиквитина из белков. Таким образом, в клетках существуют тысячи Ub-зависимых белково-белковых взаимодействий, подавляющее большинство из которых распознают общую поверхность с низким сродством, но высокой специфичностью, чтобы обеспечить слабые взаимодействия через большие и разнообразные поверхности.

Ernst et al. ввели мутации в известные области связывания Ub, чтобы увидеть, могут ли они повысить сродство связывания с интересующим белком, сохраняя при этом высокую селективность5. Была разработана комбинаторная библиотека из более чем 10 миллиардов (7,5 x 1010) вариантов Ub (UbV) с мутациями в положениях по всей поверхности Ub, которые опосредуют известные взаимодействия Ub-белка. Эта библиотека состояла из фагемидов, которые экспрессируют белок оболочки бактериофага PIII M13, слитый с диверсифицированными UbV. Таким образом, отдельные UbV могут отображаться на поверхности фага через белок оболочки при экспрессии. Во время процесса селекции фаг, который отображает UbV со значительными связывающими взаимодействиями с целевым белком, будет сохранен и обогащен в последующих раундах отображения фагов, тогда как фаг, отображающий UbV, которые плохо связываются с целевым белком, смывается и удаляется из фагового пула. Сохраненные фаговые частицы содержат фагемид, соответствующий их отображаемому UbV, что позволяет секвенировать их и дополнительно характеризовать после выделения.

Используя эту стратегию белковой инженерии, ингибиторы UbV были разработаны для человеческих деубиквитиназ5 и вирусных протеаз6. Важно отметить, что мы создали ингибирующие UbV для человеческих лигазов E3 семейства HECT путем захвата сайта связывания E2 и активации UbV, которые занимают Ub-связывающий экзозит на домене HECT7. Мы также можем ингибировать мономерные RING-семейства E3s, нацеливаясь на сайт связывания E2 и индуцируя димеризацию UbV для активации гомодимерного RING E3s8. Для многосубъединичных RING E3s UbV могут достигать ингибирования путем нацеливания на субъединицу RING (например, для комплекса APC/C9) или нарушения образования комплекса (например, для SCF E3s10). В совокупности UbV могут быть использованы для систематического опроса белково-белковых взаимодействий в системе Ub-протеасом (UPS), чтобы мы могли лучше расшифровать биохимические механизмы ферментов UPS, а также идентифицировать и проверить функциональные сайты для терапевтического вмешательства.

Следующий протокол описывает, как использовать ранее сгенерированную фаговую отображаемую библиотеку UbV для нацеливания на интересующий белок и как обогатить связующие вещества UbV, которые взаимодействуют с целевым белком посредством последовательных раундов отображения фагов.

протокол

1. Подготовка реагентов

  1. PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор): Смешайте 50 мл 10-кратного раствора PBS с 450 мл сверхчистого H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (бычий сывороточный альбумин): Медленно добавляйте 1 г BSA к 7 мл сверхчистого H2O и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 10 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  3. Буфер PB (PBS, дополненный 1% BSA): Медленно добавляйте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого H2O и 50 мл PBS и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  4. Буфер PBT (PBS, дополненный 1% BSA и 0,05% Tween 20): Медленно добавьте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого H2O и 50 мл PBS и перемешайте до полного растворения (без сгустков). Добавьте 250 мкл Tween 20. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  5. БУФЕР PT (PBS с добавлением 0,05% Tween 20): Смешайте 1 мл Tween 20 с 400 мл PBS. Долить ультрачистым H2O до конечного объема 2 л. Стерилизовать фильтрацией и хранить при температуре 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
  6. 2YT бульон: Добавьте 16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl до 800 мл ультрачистого H2O и перемешайте до полного растворения (без комков). Доливать ультрачистым H2O до конечного объема 1 л. Стерилизовать автоклавом и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
  7. Пластины LB/carb: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара до 400 мл H2O. Добавьте ультрачистый H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 100 мг мг карбенициллина, хорошо перемешайте и разлейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
  8. Пластины LB/tet: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара в 400 мл сверхчистого H2O. Добавьте ультрачистой H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 10 мг мл тетрациклина, хорошо перемешайте и вылейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
  9. 20% ПЭГ (полиэтиленгликоль)/2,5 М NaCl: Добавьте 50 г ПЭГ-8000 и 36,5 г NaCl к 200 мл сверхчистого H2O. Смешайте до полного растворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время; отопление может помочь. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 250 мл. Стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования.
  10. 0,1 M HCl: Смешайте 20 мл 1 M HCl со 180 мл сверхчистого H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при комнатной температуре (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11,0): Добавьте 6,1 г основы Tris к 40 мл сверхчистого H2O. Отрегулируйте pH до 11,0 с HCl и перемешайте до полного растворения Tris. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 50 мл. Стерилизовать фильтрацией и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
  12. 100 мг/мл (1000x) карбенициллина: Добавьте 2 г соли динатрия карбенициллина к 20 мл сверхчистого H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
  13. 50 мг/мл (1000x) канамицина: Добавьте 1 г канамицина сульфата к 20 мл сверхчистого H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
  14. 10 мг/мл (1000x) тетрациклина: Добавьте 0,2 г тетрациклина гидрохлорида к 20 мл 70% этанола. Перемешать до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.

2. Белковый препарат

  1. Определяют концентрацию целевого запаса белка в мкМ. Наиболее удобным способом оценки концентрации белка является измерение абсорбции белкового запаса при 280 нм. Если концентрация известна в мг/мл, преобразуйте ее в мкМ, используя молекулярную массу белка-мишени. В зависимости от интересующего белка может быть использован ряд методов; подробности см. в разделе Обсуждение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок усечен (специфический белковый домен/мотив) или помечен, не забудьте учесть эти изменения молекулярной массы при преобразовании из мг/мл в мкМ.
  2. Подготовьте три микроцентрифужные трубки с надписями «круглый 1», «круглый 2/3» и «круглый 4/5».
    1. Рассчитайте объем белка, необходимый для разбавления его до 1 мкМ в 800 мкл PBS и аликвотировать этот объем в пробирки без добавления PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество доступного целевого белка низкое, концентрация может быть снижена до 0,25 мкМ.

3. Подготовка к первому раунду отбора

  1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для второго раунда селекции.
    1. Инокулируют 5 мл 2YT/tet хорошо изолированной колонией Escherichia coli и инкубируют ночью при 37 °C с орбитальным сотрясением 200 об/мин.
  2. Нанесите покрытие на тарелку для первого раунда отбора.
    1. Разбавьте целевой белок в «круглой 1» трубке с соответствующим количеством PBS и аликвотой 100 мкл в восемь лунок 96-луночной связующей пластины (т.е. целевой пластины).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фаговой дисплей может быть выполнен для четырех различных белков одновременно на одной пластине путем покрытия колодцев в углах пластины.
    2. Необязательный контроль: Если целевой белок помечен, например, GST или MBP (мальтозосвязывающий белок), покройте восемь лунок в другой 96-луночной связывающей пластине 100 мкл раствора 1 мкМ, содержащего соответствующую эпитопную метку. Это будет использоваться для удаления нежелательных фагов, которые связываются с тегом неспецифично.
    3. Встряхните пластину (пластины) в течение ночи при 4 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.

4. Первый раунд отбора

  1. Подготовьте вход второго раунда.
    1. Инокулируют 30 мл 2YT/tet 200 мкл семенной культуры со стадии 3.1.
    2. Инкубировать при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (OD600figure-protocol-6527 0,6 - 0,8). Это занимает примерно три часа.
  2. Блок целевой пластины.
    1. Снимите раствор покрытия с пластины или с обеих пластин, если была изготовлена контрольная пластина, путем инвертирования и встряхивания раковины. Вытрите насухо на бумажных полотенцах.
    2. Добавьте 300 мкл буфера ПБ к каждому покрытому колодцу.
    3. Удалите буфер PB, как показано на шаге 4.2.1, и добавьте еще 200 мкл буфера PB.
    4. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
  3. Подготовьте фаговую библиотеку.
    1. Разморозьте библиотеку фагов на льду и разбавьте ее в 100 раз больше библиотечного разнообразия в PBS. Например, если разнообразие библиотек составляет 1 x 1010 , а концентрация библиотеки 1 x 1013, разбавьте библиотеку так, чтобы концентрация составляла 1 x 1012. Для библиотек, используемых здесь, разбавьте их в 10 раз в PBS, объединив 1 мл библиотеки с 9 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотечное разнообразие должно было быть определено во время создания библиотеки и не может быть легко оценено иначе. Концентрацию библиотеки можно определить путем инокуляции клеток кишечной палочки в средней фазе (OD600figure-protocol-7875 0,6 - 0,8) и нанесения покрытия на LB/carb.
    2. Добавить 1/5 объема ПЭГ/NaCl. Например, для 10 мл ранее разбавленной библиотеки добавьте 2 мл PEG/NaCl.
    3. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
    4. Центрифуга при 11 000 х г в течение 30 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и недавняя рифмуга в течение 2 мин, чтобы вытащить оставшийся супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
    5. Осторожно повторно суспендировать гранулу фага в 1 мл ПБТ на белок. Для четырех белков повторно суспендируют гранулу в 4 мл ПБТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не трогать гранулы и не вводите пузырьки воздуха.
  4. Покажите фаг целевому белку (белкам).
    1. Дополнительное управление: Добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый на контрольной пластине. Инкубируют при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин и переносят библиотеку с управляющей пластины на целевую пластину. Пропустите шаг 4.4.2.
    2. Удалите буфер ПБ с целевой пластины, как показано на этапе 4.2.1, и добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый.
    3. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
  5. Элют вокруг одного фага.
    1. Извлеките библиотеку фагов и четыре раза вымойте покрытые оболочкой колодцы ПТ-буфером. Переверните тарелку и нажмите на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на одной пластине покрыты несколько белков-мишеней, постарайтесь свести к минимуму поток всех последующих растворов между скважинами.
    2. Добавьте 100 мкл 0,1 М HCl к каждой хорошо покрытой оболочке и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
    3. Нейтрализуют рН, добавляя 12,5 мкл 1 М Трис-HCl (рН 11) к каждому хорошо покрытому.
    4. Объедините элюированный фаг из всех 8 скважин в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Пипетка вверх и вниз во время переноса, чтобы сделать растворы однородными и аспирировать всю жидкость из скважин.
    5. Добавьте 10% BSA к объединенному элюированному фагу до конечной концентрации 1%. Для типичного круглого элюционного объема 950 мкл добавьте 95 мкл 10% BSA. Хранить при температуре 4 °C. Это круглый выход.

5. Подготовка к последующим раундам отбора

  1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда отбора, как показано на шаге 3.1.
  2. Покройте пластину для третьего раунда отбора, как на этапе 3.2, с изменениями, указанными ниже.
    1. Только покрывайте четыре лунки на белок в 96-луночной связывающей пластине. Используйте половину содержимого «круглых 2/3» или «круглых 4/5» трубок для соответствующего раунда. Разбавьте содержимое этих пробирок по мере необходимости, чтобы избежать оседания белков из раствора.
  3. Подготовьте фаговые входные данные для следующего раунда отбора.
    1. Используйте половину круглого одного выхода из шага 4.5.5 для прививки 3 мл среднелогарифмических фазовых ячеек с шага 4.1. Для типичного круглого выхода инокулируют 500 мкл выхода.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    3. Добавьте вспомогательный фаг M13K07 до конечной концентрации 1 x 1010 PFU/мл.
    4. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    5. Переведите все 3 мл культуры в 30 мл 2YT/углевод/кан. Расти ночью при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    6. На следующий день переложите культуру в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C до осаждения клеток.
    7. Наполнителе в новую 50-литровую центрифужную трубку, смешайте с 8 мл ПЭГ/NaCl и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
    8. Центрифуга при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, выбросьте супернатант и снова центрифугируйте в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
    9. Повторно суспендируйте гранулу фага в 800 мкл ПБТ, чтобы она была полностью однородной и не было видно сгустков.
    10. Переложите фаговый раствор в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 16 200 х г в течение 4 мин при 4 °C в гранулированный мусор.
    11. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку. Это входные данные для следующего раунда отбора.
  4. Дополнительно: Титр входных и выходных решений.
    1. Используйте 500 мкл посева семян E. coli для прививки 5 мл 2YT/тет и инкубации при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (OD600figure-protocol-13003 0,6 - 0,8). Это занимает примерно 1 ч.
    2. Разбавляют фаговые входные/выходные растворы до 10-3 - 10-5 в PBS и добавляют 10 мкл каждого разведения к 90 мкл культивируемых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте разбавленные фаговые растворы немедленно, потому что фаг будет адсорбироваться в трубке с течением времени, и превращения могут привести к ложноотрицательным результатам.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    4. Пластина 5 мкл на отдельных пластинах LB/carb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество покрытия варьируется в зависимости от предыдущих результатов / личных предпочтений.

6. Последующие раунды отбора

  1. Выполните все последующие раунды вместе с подготовкой, как это было сделано на шагах 3 и 4, соответственно, с различиями, указанными ниже.
    1. Используйте входные данные, полученные в предыдущем раунде, в качестве фагового источника вместо библиотеки. Покрыть 4 лунки на целевой белок 100 мкл фагового входа, полученного из предыдущего раунда. Храните оставшиеся фаговые входы при 4 °C.
    2. Делайте шаг стирки в 4.5.1 более строгим с каждым раундом выбора. Первый раунд требует стирки 4 раза, второй раунд требует 6 раз, третий раунд требует 8 раз, а раунды четыре и пять требуют стирки 10 раз.
    3. Уменьшите некоторые объемы по сравнению с теми, которые используются в первом раунде, потому что последующие раунды покрывают только четыре скважины вместо восьми. Например, на стадии 4.5.5 только 45 мкл 10% BSA добавляют к выходу фага, а на стадии 5.3.1 только 250 мкл фагового выхода используется для инокуляции клеток.

7. Обработка после отбора и выделение фагов

  1. Титруйте входные и выходные решения для четвертого и пятого раундов.
    1. Если это еще не сделано на этапе 5.4, выполните те же шаги, чтобы титровать круги четырех и пяти фаговых выходов, в идеале производя диапазон в 30-300 колоний на нескольких пластинах.
  2. Культивировать и выделять фаги.
    1. Aliquot 450 мкл 2YT/carb/M13K07 в каждую трубку 96 мини-ящика для культуры.
    2. Выберите хорошо изолированные колонии из любой из пластин на этапе 7.1, чтобы привить каждую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте верхнюю половину коробки для выходов четвертого раунда и нижнюю половину для выходов пятого раунда.
    3. Насиживайте в течение ночи при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    4. Центрифуга при 1 200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    5. Перенесите как можно больше супернатанта в новую коробку для культуры mini tube 96, не нарушая гранулу клетки, и выбросьте старую. Хранить при температуре 4 °C.
    6. Из новой коробки переложите 100 мкл из каждой трубки в 96 луночную несвязывающую пластину, содержащую 100 мкл 50% глицерина во всех скважинах. Хорошо перемешайте и храните при -80 °C в качестве резервного запаса.

Результаты

Связующие вещества, полученные из фагового дисплея, могут быть проверены и проанализированы различными способами. Рекомендуется сначала приступить к секвенированию фага с помощью праймеров, которые обрамляют диверсифицированную вставку в библиотеке фагемид. Идеальный эксперимент с...

Обсуждение

Как упоминалось на этапе 2.1 (получение белка), для оценки концентрации белка могут быть использованы различные методы, и каждый из них будет иметь уникальные преимущества и недостатки, основанные на конкретном целевом белке, используемом для отображения фагов. Источник подробных описа?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Технология убиквитинового варианта была разработана в лаборатории доктора Сачдева Сидху (Университет Торонто). WZ в настоящее время является глобальным ученым CIFAR Azrieli в программе «Люди и микробиом». Это исследование финансировалось грантами NSERC Discovery, присужденными WZ (RGPIN-2019-05721).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)Fisher Scientific14-222-198Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher ScientificDF0446-17-3Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction VBioShop CanadaALB001Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrousMillipore-SigmaC1389-5GCulturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate ShakerFisher Scientific11-676-337Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing TapeFisher Scientific07-200-684Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-01-0Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/FluorometerDeNovixDS-11 FX+Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher Scientific7000133Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-500Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coliFisher ScientificC854003Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin SulfateFisher ScientificAAJ1792406Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper PhageNew England Biolabs N0315SPermit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital ShakerFisher Scientific11-676-076Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottomLife Technologies44-2404-21Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X SolutionFisher ScientificBP3994Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and IncubationVWR60941-120Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1Phage precipitation.
Sodium chlorideMillipore-SigmaS3014Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent PolypropyleneFisher Scientific14-956-1DCulturing phage inputs.
Tetracycline HydrochlorideFisher ScientificBP912-100Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris BaseFisher ScientificBP1525Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone PowderFisher ScientificBP1421-2Cell growth media component.
Tween 20Fisher ScientificBP337500Buffer component.
Yeast ExtractFisher ScientificBP1422-2Cell growth media component.

Ссылки

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены