JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает минигенный репортерный анализ для мониторинга влияния мутаций 5-образного сайта сращивания на сплайсинг и разрабатывает супрессор U1 snRNA для спасения ингибирования сплайсинга, вызванного мутациями. Конструкции репортера и супрессора U1 snRNA экспрессируются в клетках HeLa, а сплайсинг анализируется путем праймерного расширения или ОТ-ПЦР.

Аннотация

Во время экспрессии генов жизненно важный этап сплайсинга пре-мРНК включает в себя точное распознавание участков сращивания и эффективную сборку сплайсеосомальных комплексов для соединения экзонов и удаления интронов до цитоплазматического экспорта зрелой мРНК. Эффективность сплайсинга может быть изменена наличием мутаций в местах сращивания, влиянием транс-действующих факторов сплайсинга или активностью терапевтических средств. Здесь мы описываем протокол для клеточного анализа, который может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга любого данного экзона. В анализе используется адаптируемый плазмидный закодированный 3-экзон/2-интронный минигенный репортер, который может быть экспрессирован в клетках млекопитающих путем транзиторной трансфекции. После трансфекции выделяют общую клеточную РНК, а эффективность сплайсинга экзонов в репортерной мРНК определяют либо расширением праймера, либо полуколичественной обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Мы описываем, как влияние связанных с заболеванием 5' мутаций сращивания может быть определено путем введения их в репортер; и как подавление этих мутаций может быть достигнуто путем совместной трансфекции с конструкцией малой ядерной РНК (snRNA) U1, несущей компенсаторные мутации в ее 5'-области, которая базирует пары с 5'-сращивающимися участками на экзон-интронных переходах в премРНК. Таким образом, репортер может быть использован для проектирования терапевтических частиц U1 для улучшения распознавания мутантных 5' сращивающихся сайтов. Вставка цис-действующих регуляторных сайтов, таких как последовательности усилителя сращивания или глушителя, в репортер также может быть использована для изучения роли U1 snRNP в регулировании, опосредованном конкретным альтернативным фактором сплайсинга. Наконец, репортерные экспрессирующие клетки могут быть инкубированы с небольшими молекулами для определения влияния потенциальных терапевтических средств на конститутивное сплайсинг пре-мРНК или на экзоны, несущие мутантные 5' места сращивания. В целом, репортерный анализ может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга в различных условиях для изучения фундаментальных механизмов сплайсинга и заболеваний, связанных со сплайсингом.

Введение

Сплайсинг пре-мРНК является важным этапом обработки, который удаляет некодирующие интроны и точно кодирует кодирующие экзоны для формирования зрелой мРНК. Распознавание консенсусных последовательностей на экзон-интронных переходах, называемых 5'-сращивающим участком и 3'-сращивающим участком, компонентами сращивающего механизма инициирует процесс сращивания. Малый ядерный рибонуклеопротеин U1 (snRNP) распознает сайт 5'-сращивания путем спаривания основания snRNA U1 с пре-mRNA1. Генетически унаследованные мутации, которые изменяют последовательности 5'-сращивания, связаны со многими заболеваниями2,3. Прогнозируется, что потеря парировки основания snRNA U1 с мутантными 5'-сращивающими сайтами вызывает аберрантное сплайсинг, что может поставить под угрозу трансляцию пораженного транскрипта. Потенциальный терапевтический подход к исправлению дефектов сплайсинга включает подавление мутаций модифицированной U1 snRNA, несущей компенсаторные нуклеотидные изменения в своей 5'-области, которая имеет основания с 5'-сращенным участком. Было обнаружено, что такие модифицированные U1 snRNAs, также называемые экзон-специфическими U1 snRNAs, эффективны в обращении вспять дефектов сплайсинга, что приводит к увеличению экспрессии белка из спасенной мРНК4,5,6,7,8.

Здесь мы описываем анализ комплементации U1 snRNP, основанный на репортерах клеточный сплайсинг, который позволяет оценить влияние мутаций 5'ss на сплайсинг экзона, а также может быть использован для разработки модифицированных U1 snRNAs для спасения включения экзонов. Мы также предоставляем протоколы для мониторинга сращенных репортерных транскриптов с помощью праймерного расширения и ОТ-ПЦР, а также для определения экспрессии модифицированных snRNAs U1 с помощью праймерного расширения и RT-qPCR.

протокол

1. Реагенты и буферы

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся стерилизация с использованием вакуумных фильтров должна выполняться с мембраной 0,2 мкм полиэфирсульфона (PES) в шкафу биобезопасности.

  1. Приготовьте воду без РНКазы, добавив 1,0 мл диэтилпирокарбоната (DEPC) к 1,0 л деионизированной воды, перемешайте в течение не менее 1 часа при комнатной температуре (RT), дважды автоклав, а затем охладите до RT перед использованием.
  2. Приготовьте модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), смешав один пакет порошка DMEM (13,4 г), 3,7 г бикарбоната натрия, 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллин и стрептомицин с ~ 800 мл стерильной деионизированной воды. Конечная концентрация пенициллина и стрептомицина в ДМЭМ должна составлять 50 Ед/мл и 50 мкг/мл соответственно. Отрегулируйте pH до 7,4, а затем восполните объем до 1,0 л стерильной деионизированной водой. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  3. Приготовьте 10x фосфатного буферного физиологического раствора (10x PBS), добавив 25,6 г гептагидрата водорода динатрия (Na2HPO4· 7H2O), 2 г дигидрофосфата калия (KH2PO4), 2 г хлористого калия (KCl) и 80 г хлорида натрия (NaCl) до 800 мл деионизированной воды. Перемешать до растворения и восполнить объем до 1,0 л. Стерилизовать фильтрацией и хранить при 4 °C.
  4. Приготовьте 0,5 М этилендиамина тетра-уксусной кислоты (ЭДТА), растворив 186,1 г Na2•EDTA•2H2O в ~800 мл деионизированной воды. Отрегулируйте pH до 8,0, а затем увеличьте объем до 1,0 л стерильной деионизированной водой. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  5. Готовят 1-кратный раствор трипсина-ЭДТА, смешивая 100 мл 10-кратного трипсина (2,5%), 2 мл 0,5 М ЭДТА, и добавляют 1x PBS до 1,0 л. Стерилизуют фильтрацией и аликвотой в конические пробирки по 50 мл. Хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 недель или заморозить при -20 °C для длительного использования.
  6. Получают 2-кратный формамидный краситель для загрузки ДНК/РНК путем смешивания 14,4 мл формамида и 0,6 мл 0,5 М ЭДТА для конечного объема 15 мл. Добавьте бромфеноловый синий и ксилол-цианоловый порошок до конечной концентрации 0,02% и храните при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формамид токсичен и коррозионен. Ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов для получения дополнительных рекомендаций по безопасности.
  7. Приготовьте 5x буфер Tris/Borate/EDTA (5x TBE), смешивая 54,0 г основания tris, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 M ЭДТА в ~800 мл деионизированной воды. Смешайте до растворения и восполните объем до 1,0 л с деионизированной водой.
  8. Готовят раствор мочевинно-полиакриламидного геля электрофореза (urea-PAGE), смешивая 200 мл 5x TBE, 250 мл 40% 19:1 бис/акриламид и 450,5 г мочевины. Затем добавляют деионизированную воду до 1,0 л. Смешивают до полного растворения ингредиентов, затем стерилизуют фильтрацией и хранят при 4 °C в янтарной стеклянной бутылке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бис/акриламид токсичен. Ознакомьтесь с паспортами безопасности материала для получения дополнительных процедур безопасности.
  9. Готовят 10% персульфат аммония (АФС), растворяя 1 г АФС в 10 мл деионизированной воды и хранят при 4 °C.

2. Котрансфекция клеток HeLa с репортерными и U1 snRNA плазмидами

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция клеток Hela должна выполняться в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности. Наружная поверхность всех материалов должна быть опрыскана 70% этанолом перед введением в шкаф биологической безопасности.

  1. Поддерживайте клетки Hela в DMEM в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 путем пропускания каждые 2-3 дня, когда клетки составляют около 80-90% слива.
  2. Для пропускания клеток HeLa аспирируют отработанную среду, а затем инкубируют клетки с 3 мл 0,25% трипсина, содержащего 1 мМ ЭДТА при 37 °C в течение 3 мин.
  3. После инкубации добавить 7 мл свежего ДМЭМ. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 10 мл, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин.
  4. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл свежего DMEM, а затем нанесите клетки на новую чашку для культуры тканей при 20% слиянии.
  5. Для переходных трансфекций подсчитайте клетки Hela с помощью чистого слайда гемоцитометра и подготовьте суспензию плотностью 2,5 х 105 клеток/мл.
  6. Посейте 1,0 мл 2,5 х 105 клеток/мл клеточной суспензии Hela в каждую лунку из 12-луночной пластины и инкубируют в течение ночи при 37 °C.
  7. На следующий день аспирировать отработанную среду и добавить 0,8 мл свежего ДМЭМ с сывороткой.
  8. Готовят раствор I, добавляя 0,2 мкг репортерной плазмиды Dup51 или Dup51p, 1,8 мкг pcDNA, pNS6U1 или pNS6U1-5a плазмиды и 100 мкл трансфекционной среды в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  9. Приготовьте главную смесь раствора II для всех образцов, подлежащих трансфекции, добавив 100 мкл трансфекционной среды и 4,0 мкл трансфекционного реагента на образец.
  10. Приготовьте трансфекционную смесь, добавив 100 мкл раствора II в каждую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор I.
  11. Вихревую трансфекцию смешивают в течение 15 с, центрифугу в настольной микроцентрифуге при 3000 х г в течение 10 с при РТ, а затем инкубируют при РТ в течение 5 мин.
  12. Добавьте все 200 мкл трансфекционной смеси в одну лунку 12-луночной клеточной пластины HeLa для достижения конечного объема 1,0 мл на лунку и инкубируйте пластину при 37 °C в течение 48 часов.
  13. После инкубации экстрагируют РНК из трансфектированных клеток HeLa коммерчески доступным раствором гуанидина тиоцианата и фенола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот реагент содержит фенол, и этот этап должен быть выполнен в вытяжном шкафу. Использование очищенной DEPC воды рекомендуется для повторного суспендирования экстрагированной РНК.
    1. Аспирировать отработанную среду и добавить в каждую лунку по 500 мкл реагента. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    2. Гомогенизация путем пипетки вверх и вниз. Затем переложите раствор в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    3. Добавьте 100 мкл хлороформа и вихря в течение 15 с.
    4. Центрифуга при 12 000 х г в течение 15 мин при RT.
    5. Перенос 200 мкл РНК, содержащего верхний водный слой, в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    6. Добавьте 2 мкг гликогена и 200 мкл изопропанола к каждому образцу РНК. Перемешайте, перевернув трубки.
    7. Собирают осадок РНК путем центрифугирования при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    8. Удалите и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу РНК.
    9. Промыть гранулу дважды, добавив 1,0 мл 70% этанола, перевернув трубки и центрифугируя, как описано на этапе 2.13.7.
    10. Гранулы сушат на воздухе в течение ~10-20 мин при РТ и повторно суспендируют РНК в 10-20 мкл воды, не содержащей РНКазы.
    11. Определение концентрации РНК путем измерения абсорбции при 260 нм, как описано Desjardins и Conklin9.
  14. Продолжайте удлинение праймера или храните образцы РНК при -20 °C. Изолированная РНК может храниться при -20 °C в течение 6-12 месяцев.

3. 32P-маркировка олигонуклеотидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы, связанные с использованием олигонуклеотидов , меченных 32P-АТФ и 32P, должны выполняться за акриловым щитом подготовленными лицами с разрешения уполномоченных учреждений. Протокол, описанный ниже, может быть использован для маркировки олигонуклеотидов, Dup3r и U17-26-R, а также маркеров для мочевины-PAGE. Использование очищенной DEPC воды рекомендуется для повторного суспензии олигонуклеотидов и исключения размеров шариков.

  1. К микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл добавляют олигонуклеотид, полинуклеотидкиназу Т4 (Т4 ПНК), буфер Т4 ПНК и 32P-АТФ, как описано в Таблице 1. В последнюю очередь добавить в смесь 32P-АТФ; это важно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для добавления радиоактивных растворов рекомендуется использовать наконечники фильтров.
  2. Инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 30 мин.
  3. В то время как реакции маркировки инкубируются, повторно суспендируйте шарики исключения размера с молекулярной массой 25 кДа, отрезанными путем осторожного вихря в течение ~ 10 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики для исключения размеров должны быть приготовлены в соответствии с инструкциями завода-изготовителя и храниться в виде 50% суспензии в 25% этаноле при 4°C.
  4. Подготовьте колонны, переместив 600 мкл повторно суспендированных шариков в одноразовый мини-столбец, помещенный в трубку для сбора 1,5 мл, и вернув булатный материал до 4 °C.
  5. Центрифуга при 2 000 х г в течение 1 мин при РТ и отбрасывает поток насквозь.
  6. Вымойте шарики, добавив в колонку 300 мкл воды без РНКазы.
  7. Повторите шаги 3.5. и 3.6. дважды и перенесите мини-колонку в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  8. Добавляют реакционную смесь киназы в колонку шарика и центрифугу при 5000 х г в течение 1 мин при РТ.
  9. Соберите и сохраните поток, который имеет 32P-меченый олигонуклеотид, и выбросьте все наконечники и трубки в акриловый ящик для отходов.
  10. Добавьте 20 мкл войны без РНКазы, чтобы разбавить 32P-меченый олигонуклеотид до конечной концентрации 2,5 мкМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте маркированные маркеры по мере необходимости для загрузки на гели мочевины-PAGE.
  11. Храните меченый олигонуклеотид в коробке из акриловых микротрубок при -20 °C или продолжайте анализ растяжения грунтовки.

4. Анализ сращенных репортерских расшифровок по праймерному расширению

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием рекомендуется очищать поверхности и оборудование реагентом, инактивирующим РНКазу.

  1. Добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 6,55 мкл.
  2. Приготовьте Master Mix I с разбавленными 32P-Dup3r и dNTP, как показано в таблице 2, и добавьте 0,9 мкл смеси в каждую ПЦР-трубку, содержащую образцы РНК.
  3. Инкубируют пробирки, сначала при 65 °C в течение 5 мин, а затем на льду в течение 1 мин.
  4. Приготовьте Master Mix II с 5-кратным буфером первой нити, дитиотрейтолом (DTT), ингибитором РНКазы и обратной транскриптазой, как показано в таблице 2.
  5. Добавьте 2,55 мкл смеси в каждую трубку, содержащую РНК и Master Mix 1; общий объем реакции должен составлять 10 мкл. Держите пробирки при РТ в течение 10 мин.
  6. Переложите трубки в сухую ванну или термальный циклер и инкубируйте сначала при 50 °C в течение 60 мин, а затем при 70 °C в течение 15 мин.
  7. После инкубации добавьте 10 мкл 2-кратного формамидного РНК-нагрузочного красителя к каждому образцу и храните в акриловой коробке при -20 °C или приступайте к разделению фрагментов мочевиной-PAGE с использованием геля длиной 14 см и визуализации изображения геля, как описано ниже на этапе 8.
  8. Выполните денситометрическое сканирование гелевого изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений и используйте интенсивности полос включенных и пропущенных продуктов для расчета процента включения экзона 2, как показано ниже.
    figure-protocol-11622

5. Анализ сращенных репортерских расшифровок флуоресцентной ОТ-ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе ОТ-ПЦР, описанном ниже, используются случайные гексамеры для синтеза кДНК и комбинация немаркированных олигонуклеотидов Dup8f и Cy5-меченых Dup3r для амплификации ПЦР сращенных продуктов.

  1. Для синтеза кДНК добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из трансфектированных клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 11,0 мкл.
  2. Приготовьте Master Mix I, содержащий случайные гексамеры и dNTP, как показано в таблице 3 , и добавьте 2,0 мкл смеси к каждому образцу. Инкубировать, сначала при 65 °C в течение 5 мин, затем на льду в течение 1 мин.
  3. Приготовьте Master Mix II, содержащий буфер первой нити, ингибитор РНКАЗЫ, DTT и обратную транскриптазу, как показано в таблице 3 , и добавьте 7,0 мкл смеси в каждую трубку, содержащую РНК и Master Mix I.
  4. Держите пробирки при RT в течение 10 мин, а затем инкубируйте при 50 °C в течение 60 мин и 70 °C в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Завершенные реакции кДНК могут храниться при -20 °C.
  5. Для ПЦР перенесите 1,0 мкл (100 нг/мкл) каждого образца кДНК в новые пробирки ПЦР.
  6. Приготовьте мастер-смесь, состоящую из Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq-буфера, Taq-полимеразы и воды, как описано в таблице 4 , и добавьте 11,5 мкл смеси в каждую пробирку, содержащую кДНК.
  7. Выполняют ПЦР с помощью термоциклера с начальным шагом денатурации при 94 °C в течение 3 мин; затем 20 циклов денатурации (94 °C в течение 30 с), отжига (65 °C в течение 30 с) и удлинения (72 °C в течение 15 с), а также этап окончания при 72 °C в течение 5 мин.
  8. Добавьте 12,5 мкл 2-кратного формамидного ДНК-нагрузочного красителя в каждую трубку и нагревайте при 95 °C в течение 5 мин.
  9. Храните реакцию ПЦР при -20 °C или продолжайте с мочевиной-PAGE, как описано ниже на этапе 8.1-8.4.
  10. После электрофореза извлеките стеклянные пластины из аппарата электрофореза и просканируйте с помощью флуоресцентного тепловизора для визуализации геля.
  11. Выполните денситометрическое сканирование гелевого изображения и используйте интенсивность полосы входящих и пропущенных продуктов для расчета процента включения экзона 2, как описано в Шаге 4.8.

6. Анализ варианта экспрессии snRNA U1 по праймерному расширению

  1. Добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 4,325 мкл, а затем добавьте dATP, как показано в таблице 5.
  2. Добавьте 10 000 CPM олигонуклеотида 32P-U17-26-R в каждую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 10 000 cpm/μl раствора 32P-U17-26-R (из этапа 3) разбавляют меченый олигонуклеотид (разбавление 1:20), определяют cpm в 1,0 мкл с помощью сцинтилляционного счетчика и далее разбавляют деионизированной водой для приготовления раствора 10 000 cpm/μL в новой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
  3. Инкубировать при 65 °С в течение 5 мин, а затем на льду в течение 1 мин.
  4. Приготовьте мастер-микс с 5-кратным буфером первой нити, ингибитором РНКАЗЫ, DTT и обратной транскриптазой, как показано в таблице 5 , и добавьте 1,8 мкл смеси к каждому образцу.
  5. Инкубировать, сначала при RT в течение 10 мин, а затем при 42 °C в течение 10 мин.
  6. После инкубации добавьте 10 мкл 2x формамидного РНК-нагрузочного красителя в каждый образец и храните в акриловой коробке при -20 °C или приступайте к разделению фрагментов мочевиной-PAGE с использованием геля длиной 38 см (см. Шаг 8).

7. Анализ экспрессии варианта snRNA U1 методом RT-qPCR

  1. Разбавить запас кДНК, приготовленный, как описано выше на этапах 5.1 - 5.4, до концентрации 0,2 нг/мкл.
  2. Пипетка 5,0 мкл разбавленной кДНК в отдельные скважины 96-луночной qPCR пластины в трех экземплярах. Добавьте деионизированную воду вместо кДНК для управления без шаблона (NTC).
  3. Приготовьте две отдельные грунтовочные смеси, состоящие из прямой и обратной грунтовок для snRNAs U1 и U2 и воды, как показано в таблице 6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для U1 и U2 snRNA-специфических праймеров приведены в таблице 7.
  4. Добавьте 5,0 мкл грунтовочной смеси snRNA U1 и U2 к образцу и лункам NTC.
  5. Добавьте 10,0 мкл ПЦР-смеси в режиме реального времени в каждую лунку.
  6. Запечатайте пластины оптической пленкой, затем центрифугу при 1000 х г в течение 2 мин на РТ для сбора реакций на дно скважин.
  7. Выполняют qPCR с начальной стадией денатурации при 95 °C в течение 10 мин, за которой следуют 40 циклов 2-ступенчатого протокола, состоящего из денатурации (95 °C в течение 15 с) и отжига/расширения (62 °C в течение 60 с) при сборе значений порогового цикла количественной оценки (Cq) целевых ампликонов.
  8. Завершите реакцию qPCR, проверив наличие одного пика в кривой диссоциации для реакций snRNA U1 и U2.
  9. Из значений Cq рассчитайте дельта Cq (ΔCq) для snRNAs U1 и U2 по сравнению с контролем ПХДНК.
  10. Определите вариант выражения snRNA U1 как относительную величину (RQ) U1 по сравнению с U2, используя значение ΔΔCq, как показано ниже для всех образцов.
    figure-protocol-17189
    figure-protocol-17259
    figure-protocol-17329

8. Настройка и запуск гелей Urea-PAGE

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка стеклянных пластин и гелевого рабочего аппарата должна производиться в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Литье 10% геля мочевины-PAGE может быть выполнено в соответствии с ранее описанным протоколом Summer et al.10. Этапы, связанные с подготовкой маркеров и образцов, а также запуском и визуализацией гелей, описаны ниже. Необязательно, чтобы предотвратить прилипание геля к стеклянным пластинам, внутренняя поверхность может быть покрыта силиконовым раствором путем добавления 1 мл раствора на поверхность и равномерного распределения по всей поверхности тканью. После высыхания пластины следует промыть деионизированной водой и снова высушить.

ВНИМАНИЕ: Неполимеризованный акриламид является нейротоксичным и должен обрабатываться с защитой, рекомендованной в паспорте безопасности материала.

  1. Подготовьте образцы и маркеры грунтовки путем нагревания при 95 °C в течение 5 мин, а затем центрифугирования в настольной микроцентрифуге при 3000 х г в течение 5 с при РТ.
  2. Перед загрузкой маркеров и образцов промывайте скважины 1x буфером TBE, чтобы удалить осевший мочевину.
  3. Загрузите 10 мкл / образец / скважину и запустите гель при 300-500 В в течение 2-3 часов или до тех пор, пока ксилол цианол не достигнет дна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 1000 копий в минуту маркера с маркировкой 32P могут быть загружены.
  4. После электрофореза снимите стеклянные пластины с аппарата электрофореза.
  5. Тщательно разделите две пластины так, чтобы гель лежал ровно на любой стеклянной поверхности, перенесите гель на фильтровальную бумагу и накройте полиэтиленовой пленкой.
  6. Вакуумная сушка геля на фильтровальной бумаге при 80 °C в течение 30 мин с помощью гелевой сушилки.
  7. Поместите высушенный гель в люминофорную кассету и храните в RT на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Люминофорный экран должен быть стерт с помощью светового короба перед использованием.
  8. Чтобы визуализировать изображение геля, снимите экран и отсканируйте с помощью люминофорного тепловизора.

Результаты

Сплайсинг-репортер Dup51, миниген из трех экзонов-двух интронов, был получен из гена β-глобина человека и был описан ранее (рисунок 1A)11,12. Мы создали мутантный репортер Dup51p, введя мутации сайта 5'-сращивания, связанные с синдромом Ашера, которы?...

Обсуждение

Анализ может быть адаптирован для анализа сплайсинга в клеточных линиях, отличных от HeLa, однако факторы, влияющие на эффективность трансфекции, такие как клеточная конфузия и количество ДНК, возможно, потребуется оптимизировать. Отношение репортера к конструкции U1 является еще одним к...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана фондами S.S. от Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (грант на институциональные исследования 74-001-34-IRG), а также S.S. и W.M. от Valley Research Partnership Program (P1-4009 и VRP77). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent Grade Deionized WaterThermoFisher Scientific23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packetGibco12100-046
Sodium BicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat InactivatedOmega ScientificFB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S)Sigma-AldrichP4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0NSigma-AldrichS2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%ThermoFisher ScientificA144-500
Disposable PES Bottle Top FiltersThermoFisher ScientificFB12566510
EDTA Disodium Salt DihydrateAmresco0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol redThermoFisher Scientific15090046
Sodium ChlorideFisher BioreagentBP358-212
Potassium ChlorideFisher BioreagentBP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate HeptahydrateFisher BioreagentBP332-1
Potassium Dihydrogen PhosphateFisher BioreagentBP362-1
Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol redThermoFisher Scientific11058021
Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000ThermoFisher Scientific13778150
TRIzol™ ReagentThermoFisher Scientific15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)ThermoFisher ScientificBP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2618-212
Glycogen (5 mg/ml)ThermoFisher ScientificAM9510
Direct-zol RNA Miniprep KitZymo ResearchR2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCiPerkinElmerNEG035C001MC
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201L
Size exclusion beands - Sephadex® G-25Sigma-AldrichG2580-10G
Size exclusion mini columnsUSA Scientific1415-0600
pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsN3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 ntAffymetrix76410 100 UL
Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™Sigma-AldrichR2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea)ThermoFisher Scientific18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease InhibitorThermoFisher Scientific10777019
Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific28025013used for primer extension
Taq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific10342020
Random Hexamers (50 µM)ThermoFisher ScientificN8080127
Real time PCR mix - SYBR™ Select Master MixThermoFisher Scientific4472903
SuperScript™ III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080093used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher Scientific18080093
5X First-Strand BufferThermoFisher Scientific18080093
Formamide (≥99.5%)ThermoFisher ScientificBP228-100Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium saltSigma-Aldrich114405-5G
Xylene Cyanol FFSigma-Aldrich2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)ThermoFisher ScientificBP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)ThermoFisher ScientificBP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)ThermoFisher ScientificBP1406-1Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)ThermoFisher ScientificBP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics GradeVWRM133-25G
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, UltrapureVWR0761-25MLReview Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, ExpedeonVWRASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cmVWRNGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cmVWRNGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cmVWRNGP-400NR
GE Storage Phosphor ScreensSigma-AldrichGE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular ImagerGE Healthcare28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation CounterGMI8043-30-1194
C1000 Touch Thermal CyclerThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemsThermoFisher Scientific

Ссылки

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175U1 snRNPDup51p

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены