Кристаллизация на кристалле и крупномасштабная последовательная дифракция при комнатной температуре

Резюме

В этом вкладе описывается, как настроить кристаллизацию белка на кристаллических устройствах и как выполнять автоматизированный последовательный сбор данных при комнатной температуре с использованием платформы кристаллизации на кристалле.

Аннотация

Биохимические реакции и биологические процессы можно лучше всего понять, продемонстрировав, как белки переходят между своими функциональными состояниями. Поскольку криогенные температуры не являются физиологическими и могут предотвращать, сдерживать или даже изменять структурную динамику белка, очень желателен надежный метод для обычных экспериментов по дифракции рентгеновских лучей при комнатной температуре. Устройство «кристалл на кристалле» и сопутствующее аппаратное и программное обеспечение, используемое в этом протоколе, предназначены для обеспечения рентгеновской дифракции in situ при комнатной температуре кристаллов белка различных размеров без каких-либо манипуляций с образцами. Здесь мы представляем протоколы для ключевых этапов от сборки устройства, кристаллизации на кристалле, оптического сканирования, распознавания кристаллов до планирования рентгеновского снимка и автоматизированного сбора данных. Поскольку эта платформа не требует сбора кристаллов или каких-либо других манипуляций с образцами, от сотен до тысяч кристаллов белка, выращенных на чипе, могут быть введены в рентгеновский луч программируемым и высокопроизводительным способом.

Введение

Из-за ионизирующего воздействия рентгеновского излучения кристаллография белка в значительной степени была ограничена криогенными условиями в последние три десятилетия. Таким образом, современные знания о движениях белка во время его функционирования в значительной степени возникают из сравнений статических структур, наблюдаемых в различных состояниях в криогенных условиях. Однако криогенные температуры неизбежно препятствуют прогрессированию биохимической реакции или взаимоконверсии между различными конформационными состояниями во время работы белковых молекул. Для непосредственного наблюдения структурной динамики белка при атомном разрешении с помощью кристаллографии необходимы надежные и рутинные методы проведения дифракционных экспериментов при комнатной температуре, что требует технических инноваций в доставке образцов, сборе данных и анализе задних данных. С этой целью последние достижения в области серийной кристаллографии предложили новые возможности для захвата молекулярных изображений промежуточных продуктов и короткоживущих структурных видов при комнатной температуре ^1,2,3. В отличие от стратегии «один кристалл — один набор данных», широко используемой в обычной криокристаллографии, серийная кристаллография использует стратегию сбора данных, аналогичную стратегии криоэлектронной микроскопии с одной частицей. В частности, экспериментальные данные в серийной кристаллографии собираются в небольших фракциях из большого количества отдельных образцов с последующей интенсивной обработкой данных, в которой фракции данных оцениваются и объединяются в полный набор данных для определения 3D-структуры⁴. Эта стратегия «один кристалл — один выстрел» эффективно облегчает рентгеновское радиационное повреждение кристаллов белка при комнатной температуре посредством дифракции перед стратегией разрушения⁵.

Поскольку серийная кристаллография требует большого количества кристаллов белка для завершения набора данных, она создает серьезные технические проблемы для многих биологических систем, где образцы белка ограничены и / или связана деликатная обработка кристаллов. Другим важным соображением является то, как наилучшим образом сохранить целостность кристаллов в экспериментах по серийной дифракции. Методы дифракции in situ решают эти проблемы, позволяя кристаллам белка дифрагировать непосредственно из того места, где они растут, не нарушая уплотнения камеры кристаллизации ^6,7,8,9. Эти методы без обработки естественным образом совместимы с крупномасштабной последовательной дифракцией. Недавно мы сообщили о разработке и реализации кристаллизационного устройства для дифракции in situ на основе концепции кристалл-на-кристалле - белковых кристаллов, выращенных непосредственно на монокристаллическом кварце¹¹. Это устройство «кристалл на кристалле» предлагает несколько преимуществ. Во-первых, он имеет рентгеновское и светлое прозрачное окно, сделанное из монокристаллической кварцевой подложки, которая производит небольшое фоновое рассеяние, что приводит к отличным соотношениям сигнал/шум на дифракционных изображениях из кристаллов белка. Во-вторых, монокристаллический кварц является отличной пароизоляцией, эквивалентной стеклу, тем самым обеспечивая стабильную среду для кристаллизации белка. Напротив, другие кристаллизационные устройства, использующие подложки на полимерной основе, склонны к высыханию из-за паропроницаемости, если полимерный материал не имеет существенной толщины, что, следовательно, способствует высокому фоновому рассеянию¹⁰. В-третьих, это устройство позволяет доставлять большое количество кристаллов белка в рентгеновский луч без какой-либо формы манипуляции с кристаллами или сбора, что имеет решающее значение для сохранения целостности кристаллов¹¹.

Для оптимизации последовательных экспериментов по дифракции рентгеновских лучей с использованием кристаллических устройств мы разработали прототип дифрактометра, облегчающий легкое переключение между режимами¹² оптического сканирования и дифракции рентгеновских лучей. Этот дифрактометр имеет небольшую площадь и используется для последовательного сбора данных на двух линиях луча усовершенствованного источника фотонов (APS) в Аргоннской национальной лаборатории. В частности, мы использовали BioCARS 14-ID-B для дифракции Лауэ и LS-CAT 21-ID-D для монохроматических колебаний. Это дифрактометрическое оборудование не требуется, если синхротронная или рентгеновская лазерная линия свободных электронов оснащена двумя ключевыми возможностями: (1) моторизованное позиционирование образца с диапазоном перемещения ±12 мм вокруг рентгеновского пучка во всех направлениях; и (2) осевая цифровая камера для просмотра кристаллов при световом освещении, безопасная для исследуемых кристаллов белка. Монокристаллическое кварцевое устройство вместе с портативным дифрактометром и управляющим программным обеспечением для оптического сканирования, распознавания кристаллов и автоматизированного сбора данных in situ в совокупности составляют платформу inSituX для серийной кристаллографии. Хотя эта разработка в первую очередь мотивирована ее динамическими кристаллографическими приложениями с использованием полихроматического источника рентгеновского излучения, мы продемонстрировали потенциал этой технологии для поддержки методов монохроматических колебаний^10,12. Благодаря автоматизации эта платформа предлагает высокопроизводительный метод последовательного сбора данных при комнатной температуре с доступным потреблением белка.

В этом материале мы подробно описываем, как настроить кристаллизацию на кристалле в влажной лаборатории и как выполнять последовательный сбор рентгеновских данных на линии синхротронного пучка с помощью платформы inSituX.

Пакетный метод используется для установки кристаллизации на чипе в условиях, аналогичных условиям метода диффузии паров, полученного для того же образца белка (таблица 1). В качестве отправной точки мы рекомендуем использовать осадок в концентрации 1,2-1,5x от таковой для метода диффузии паров. При необходимости состояние кристаллизации партии может быть дополнительно оптимизировано с помощью тонкого сетчатого просеивания. Кварцевые пластины не нужны для оптимизационных испытаний; вместо этого можно использовать стеклянные крышки (см. ниже). Частично загруженные кристаллизационные устройства рекомендуются для проведения оптимизационных испытаний в меньших масштабах. Ряд белковых образцов был успешно кристаллизован на таких устройствах с использованием периодического метода¹⁰ (таблица 1).

Само устройство состоит из следующих частей: 1) наружного кольца; 2) две кварцевые пластины; 3) одна шайбообразная прокладка из пластика или нержавеющей стали; 4) стопорное кольцо; 5) микроскоп погружное масло в качестве герметика (рисунок 1). Общий объем кристаллизационного раствора, загруженного на один чип, зависит от цели эксперимента. Емкость камеры кристаллизации можно регулировать, выбирая прокладку различной толщины и/или внутреннего диаметра. Мы регулярно устанавливаем кристаллизационные устройства емкостью 10-20 мкл с использованием прокладок толщиной 50-100 мкм. Типичное устройство может производить от десятков до тысяч кристаллов белка, достаточных для последовательного сбора данных (рисунок 2).

В случае успеха кристаллизация на чипе будет производить десятки, сотни или даже тысячи кристаллов белка на каждом кварцевом устройстве, готовых к рентгеновской дифракции. На синхротронной лучевой линии такое устройство монтируется на трехосевой ступени трансляции дифрактометра с помощью кинематического механизма. Окно кристаллизации навесного устройства оптически сканируется и визуализируется на десятках-сотнях микроснимков. Эти микроснимки затем сшиваются в монтаж с высоким разрешением. Для светочувствительных кристаллов оптическое сканирование может быть выполнено под инфракрасным (ИК) светом, чтобы избежать непреднамеренной фотоактивации. Было разработано программное обеспечение для компьютерного зрения для идентификации и определения местоположения кристаллов белка, случайным образом распределенных на устройстве. Затем эти кристаллы ранжируются в соответствии с их размером, формой и положением, чтобы информировать или направлять стратегию сбора данных в серийной кристаллографии. Например, один или несколько выстрелов могут быть расположены на каждом целевом кристалле. Пользователи могли планировать один проход или несколько маршрутов через целевые кристаллы. Мы внедрили программное обеспечение для вычисления различных маршрутов путешествий. Например, кратчайший маршрут вычисляется с использованием алгоритмов, которые решают задачу¹³ коммивояжера. Для динамических кристаллографических применений насос-зонд можно выбрать время и продолжительность лазерных (накачки) и рентгеновских (зондовых) снимков. Автоматизированный последовательный сбор данных запрограммирован на перемещение каждого целевого кристалла в рентгеновский пучок один за другим.

К ключевым компонентам дифрактометра insituX относятся: 1) держатель прибора; 2) трехосевой этап трансляции; 3) источник света для оптического сканирования; 4) остановка рентгеновского пучка; 5) накачивать лазеры, если изучаются светочувствительные белки; 6) Микрокомпьютер Raspberry Pi, оснащенный ИК-чувствительной камерой; 7) программное обеспечение управления для синхронизации двигателей, камеры, источников света, накачки лазера и взаимодействия с элементами управления линией луча.

протокол

1. Предварительная сборка устройства

1. Маркировка наружного кольца (диаметр 30 мм) для идентификации образца. При необходимости укажите название проекта, номер устройства, условие кристаллизации и дату (рисунок 1A). Поместите наружное кольцо вверх ногами на чистую поверхность (рисунок 1B) и аккуратно поместите одну кварцевую пластину внутрь кольца (рисунок 1C). Эта первая кварцевая пластина служит входным окном для падающих рентгеновских лучей.
2. Налейте небольшое количество погружного масла микроскопа (вязкость 150 сСт) в чашку Петри. Окуните прокладку в масло и убедитесь, что обе стороны прокладки правильно смазаны маслом (рисунок 1D). Удалите излишки масла, нанеся прокладку на чистую поверхность.
3. Поместите промасленную прокладку поверх первой кварцевой пластины (рисунок 1Е).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иммерсионное масло является отличным герметиком, который защищает камеру кристаллизации от потенциальной потери пара. Правильно собранные чипсы обычно служат неделями без видимого высыхания. Этот этап предварительной сборки выполняется при освещении помещения. Для светочувствительных образцов все последующие этапы, включая загрузку образцов, хранение устройства и наблюдение, должны проводиться при безопасном свете.

2. Загрузка образца и сборка устройства

1. Используйте пипетку, чтобы тщательно смешать белковый раствор и буфер кристаллизации на первой кварцевой пластине. Объемное соотношение между образцом белка и буфером обычно колеблется от 2:1 до 1:2 (рисунок 1F). Убедитесь, что общий объем кристаллизационного раствора не превышает максимальную емкость кристаллизационной камеры, определяемую размером и толщиной прокладки. Избегайте пузырьков воздуха во время перемешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера кристаллизации варьируется от одного эксперимента к другому. Условия кристаллизации приведены в таблице 1 .
2. Поместите вторую кварцевую пластину поверх смешанного раствора, когда раствор начнет растекаться (рисунок 1G). Эта вторая кварцевая пластина служит выходным окном дифрагированных рентгеновских лучей.
3. Слегка нажмите на вторую кварцевую пластину по краю, чтобы помочь намазать масло, выталкивая воздух. Закрепите устройство, вкрутив стопорное кольцо во внешнее кольцо (рисунок 1H). При необходимости используйте инструмент для затяжки (рисунок 1I). Имейте в виду, что чрезмерное затягивание может привести к деформации или даже растрескиванию тонких кварцевых пластин.

3. Оптимизация хранения и кристаллизации устройства

1. Храните собранные устройства (рисунок 1J) в коробке при комнатной температуре или внутри инкубатора с контролем температуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы белка могут появиться через несколько часов или дней после сборки кристаллизационного устройства. Типичные результаты кристаллизации на чипе показаны для нескольких репрезентативных образцов белка (рисунок 2).
2. Контролируйте рост кристаллов, наблюдая за кристаллизационным устройством под микроскопом. При необходимости оптимизируют условия кристаллизации итерациями секций 1-3.

4. Калибровка

ПРИМЕЧАНИЕ: Программы и команды, упомянутые в разделах ниже, выполняются в программном обеспечении inSituX.

1. Установите тонкий кристалл легированного иттриевого алюминиевого граната на держатель чипа (рисунок 3). Установите упор балки. Сделайте рентгеновские флуоресцентные снимки прямого луча, запустив программу:
   burnmark.py <устройство>.param
   где <устройство> — выбранное пользователем имя устройства кристаллизации. .param — это имя файла, содержащее параметры управления для конкретного устройства. Значения по умолчанию будут постепенно заменяться определенными значениями по протоколу. Пример файла .param приведен в дополнительном файле 1.
2. Найдите точное положение прямого рентгеновского пучка, запустив программу установки профиля пучка:
   beam.py <обожженное изображение> -d <устройство>
   где <снежное изображение> — имя файла рентгеновского флуоресцентного изображения (рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа вычисляет точное положение прямого луча, а также размер луча. Положение луча обозначает место назначения перемещения для всех кристаллов одного и того же устройства. Размер луча также используется для планирования цели.

5. Оптическое сканирование

1. Поместите кристаллизационное устройство в держатель чипа и закрепите устройство с помощью винта большого пальца (рисунок 3A).
2. Установите держатель микросхемы на ступень трансляции дифрактометра с помощью кинематического механизма (рисунок 3B).
3. Установите правильный источник света для съемки микрофотографий из оптического окна устройства. Белый свет, ИК-свет или другой свет по выбору могут быть использованы в зависимости от светочувствительности образца белка, а также цели эксперимента.
4. Запустите программу сканирования:
   scan.py <устройство>.param
   Эта программа захватывает набор микроснимков, которые автоматически передаются на указанные компьютеры пользователей.
5. Запустите программу разметки на компьютере пользователя:
   tile.py <устройство> -x -y
   где и — начальные значения смещений столбцов и строк микрофотографий соответственно. Эта программа сшивает все микроснимки в монтаж с разрешением 1-3 мкм/пиксель (рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 5.4 и 5.5 обычно занимают несколько минут. Общее количество микроснимков колеблется от нескольких десятков до сотен в зависимости от области сканирования и увеличения.
6. Запустите программу поиска кристаллов:
   findX.py <монтаж> -c <длительность> <ширина> -w -x размер < луча>
   где <монтаж> — это изразцовое изображение. Эта программа выполняет распознавание кристаллов и планирование выстрелов. < длиной> и шириной <> указывают размер кристалла, который необходимо найти. Если пользователь хочет избежать меньших кристаллов, <широту> можно использовать в качестве отсечки, установив число, превышающее размеры нежелательных мелких кристаллов. <кровка> — угловое значение, задающее допуск для кристаллов неправильной формы. <размер луча> относится к размеру прямого луча, полученного в результате установки профиля выше (этап 4.2; Рисунок 4). Кроме того, номинальное значение может быть установлено пользователями для дальнейшего освобождения от целевых выстрелов. Эти ключевые параметры позволяют выбирать кристаллы и планировать цели (рисунок 6).

6. Рентгеновская дифракция

1. Извлеките источник света и установите упор луча. Установите соответствующее расстояние детектора. Следуйте протоколу безопасности лучевой линии для поиска рентгеновского домика. Откройте рентгеновский затвор и лазерный затвор, если это применимо.
2. Запустите программу сбора данных для последовательной дифракции:
   collect.py <устройство>.param -l <световая длительность>
   Эта команда запускает сбор данных, при котором все запланированные снимки посещаются один за другим в соответствии с заранее запрограммированной последовательностью. Каждый целевой кристалл перемещается в положение пучка (шаг 4.2). На каждой остановке рентгеновское облучение снимается с лазерной подсветкой или без нее с запланированной временной задержкой. На ролике 1 показана автоматизированная последовательность сбора данных, работающая на частоте 1 Гц. Обычно от десятков до сотен дифракционных изображений собираются с устройства монокристаллизации (фильм 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка секции 4 и оптическое сканирование секции 5 являются автономными в платформе inSituX, поэтому полностью переносятся на другую линию луча. Секция 6 Дифракция рентгеновских лучей должна включать некоторые детали в работу линии луча.

Результаты

За последние несколько лет было опубликовано несколько репрезентативных наборов данных^10,12 вместе с кристаллографическими результатами и научными выводами из разнообразного спектра белков, включая фоторецепторные белки и ферменты, например, раститель...

Обсуждение

Кристаллография белка в первые годы, проводимая при комнатной температуре, испытывала огромные трудности в борьбе с повреждением рентгеновским излучением. Таким образом, он был заменен более надежным методом криокристаллографии, поскольку синхротронные рентгеновские источники стал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Outer ring	In-house developed
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed