Определение базального расхода энергии и способности термогенных адипоцитов расходовать энергию у мышей с ожирением

Резюме

В этой рукописи описывается протокол измерения базальной скорости метаболизма и окислительной способности термогенных адипоцитов у мышей с ожирением.

Аннотация

Измерения расхода энергии необходимы, чтобы понять, как изменения в метаболизме могут привести к ожирению. Базальный расход энергии может быть определен у мышей путем измерения потребления кислорода всем телом, производства _CO2 и физической активности с использованием метаболических клеток. Термогенные коричневые/бежевые адипоциты (БА) вносят значительный вклад в расход энергии грызунов, особенно при низких температурах окружающей среды. Здесь измерения базального расхода энергии и общей способности БА расходовать энергию у мышей с ожирением описаны в двух подробных протоколах: первый объясняет, как настроить анализ для измерения базального расхода энергии с использованием анализа ковариации (ANCOVA), необходимого анализа, учитывая, что расход энергии изменяется вместе с массой тела. Второй протокол описывает, как измерить емкость расхода энергии BA in vivo у мышей. Эта процедура включает в себя анестезию, необходимую для ограничения расходов, вызванных физической активностью, с последующей инъекцией бета3-адренергического агониста CL-316,243, который активирует расход энергии при БА. Эти два протокола и их ограничения описаны достаточно подробно, чтобы обеспечить успешный первый эксперимент.

Введение

Метаболизм можно определить как интеграцию биохимических реакций, ответственных за поглощение, хранение, трансформацию и распад питательных веществ, которые клетки используют для роста и выполнения своих функций. Метаболические реакции преобразуют энергию, содержащуюся в питательных веществах, в форму, которая может быть использована клетками для синтеза новых молекул и выполнения работы. Эти биохимические реакции по своей сути неэффективны в преобразовании этой энергии в пригодную для использования форму для поддержания ^жизни1. Такая неэффективность приводит к рассеиванию энергии в виде тепла, причем это производство тепла используется для количественной оценки стандартной скорости метаболизма (SMR) ^{организма1}. Стандартное состояние было классически определено как производство тепла, происходящее у бодрствующего, но отдыхающего взрослого человека, не глотающего и не переваривающего пищу, при термонейтральности и без какого-либо ^{стресса1}. Базальная скорость метаболизма (BMR) или базальный расход энергии у мышей называется SMR, но у людей, принимающих и переваривающих пищу при легком тепловом стрессе (температура окружающей среды 21-22 ° C) ¹. Проблемы и трудности непосредственного измерения производства тепла сделали косвенную калориметрию, а именно расчет производства тепла из измерений потребления кислорода, наиболее популярным подходом к определению БМР. Расчет BMR по потреблению кислорода возможен, потому что окисление питательных веществ митохондриями для синтеза АТФ отвечает за 72% общего кислорода, потребляемого в организме, причем 8% общего потребления кислорода также происходит в митохондриях, но без генерации АТФ (несвязанное дыхание)¹. Большая часть оставшихся 20% потребляемого кислорода может быть отнесена к окислению питательных веществ в других субклеточных местах (окисление пероксисомальных жирных кислот), анаболическим процессам и образованию активных форм ^{кислорода1}. Так, в 1907 году Ласк установил уравнение, основанное на эмпирических измерениях, широко используемое для преобразования потребления кислорода и производства _CO2 в рассеивание энергии в виде тепла. У людей мозг составляет ~ 25% BMR, опорно-двигательный аппарат ~ 18,4%, печень ~ 20 %, сердце ~ 10% и жировая ткань ~ 3-7%². У мышей вклад ткани в BMR немного отличается: мозг составляет ~ 6,5%, скелетные мышцы ~ 13%, печень ~ 52%, сердце ~ 3,7% и жировая ткань ~ 5%³.

Примечательно, что биохимические реакции, определяющие BMR, не являются фиксированными и изменяются в ответ на различные потребности, такие как внешняя работа (физическая активность), развитие (рост тканей), внутренние стрессы (противодействие инфекциям, травмам, обороту тканей) и изменения температуры окружающей среды (защита от холода)¹. Некоторые организмы активно рекрутируют процессы для генерации тепла при воздействии холода, подразумевая, что тепло, производимое метаболизмом, не является просто случайным побочным продуктом. Вместо этого эволюция выбрала регуляторные механизмы, которые могли бы специфически повышать выработку тепла, изменяя скорость метаболических ^{реакций1}. Таким образом, эти же измерения потребления кислорода могут быть использованы для определения способности организма генерировать тепло в ответ на холод.

Два основных процесса способствуют выделению тепла при воздействии холода. Первым из них является дрожь, которая генерирует тепло путем увеличения митохондриального окислительного фосфорилирования и гликолиза в мышцах, чтобы покрыть физическую работу, выполняемую непроизвольным сокращением мышц. Поэтому воздействие холода увеличит потребление кислорода в ^{мышцах1}. Второй — недрожащий термогенез, который происходит за счет увеличения потребления кислорода в коричневых и бежевых адипоцитах (БА). Рассеивание энергии в тепло в БА опосредовано митохондриальным разъединяющим белком 1 (UCP1), который позволяет протону возвращаться в митохондриальный матрикс, уменьшая митохондриальный протонный градиент. Диссипация митохондриального градиента протонов UCP1 увеличивает производство тепла за счет повышения переноса электронов и потребления кислорода, а также энергии, высвобождаемой при рассеивании протонов как таковом без генерации АТФ (несвязанной). Кроме того, термогенный БА может вызывать дополнительные механизмы, которые повышают потребление кислорода, не вызывая большого рассеивания в протонном градиенте, активируя бесполезные циклы окислительного синтеза и потребления АТФ. Метаболические клетки, описанные здесь, а именно система CLAMS-Oxymax от Columbus Instruments, предлагают возможность измерять расход энергии при различных температурах окружающей среды. Однако, чтобы определить термогенную способность БА с помощью измерений потребления кислорода всем телом, необходимо: (1) устранить вклад дрожи и других метаболических процессов, не связанных с БА, в расход энергии и (2) специфически активировать термогенную активность БА in vivo. Таким образом, второй протокол описывает, как избирательно активировать BA in vivo с использованием фармакологии у обезболенных мышей при термонейтральности (30 ° C), с анестезией и термонейтральностью, ограничивающей другие термогенные процессы без БА (т. Е. Физическая активность). Фармакологическая стратегия активации БА заключается в лечении мышей агонистом β3-адренергических рецепторов CL-316,246. Причина в том, что воздействие холода способствует симпатическому ответу, высвобождая норадреналин для активации β-адренорецепторов в БА, что активирует UCP1 и окисление жиров. Кроме того, экспрессия β3-адренергических рецепторов высоко обогащена жировой тканью у мышей.

протокол

Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA). Мышам вводили их диету и воду ad libitum в метаболической клетке, размещенной в среде с контролируемой температурой (~ 21-22 или 30 ° C) с 12-часовым циклом света / темноты. Для этого исследования использовались 8-недельные самки мышей, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров или диетой чау в течение 8 недель.

1. Измерение базальной скорости метаболизма (BMR)

1. Измерьте общую массу тела мыши с помощью весовой шкалы с точностью в пределах 0,1 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо сделать до размещения мышей в метаболических клетках и после 2-3 дней акклиматизации к метаболическим клеткам.
2. Измерьте состав тела, включая жир и мышечную массу у мышей без анестезии, используя соответствующую систему анализа состава тела (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти измерения необходимы для определения расхода энергии и выполняются параллельно с измерениями общей массы тела (этап 1.1).
3. Установите метаболические клетки и начните период акклиматизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система метаболических клеток включает в себя корпус, который позволяет пользователю контролировать температуру корпуса и свет 12 клеток (рисунок 1A,B). Каждая клетка имеет бутылку для воды, кормушку и сетку (рисунок 1С). Сетка отделяет мышь от нижней части клетки, позволяя собирать кал. После того, как клетка установлена в каждом заранее определенном пространстве, крышка, которая герметизирует клетку, включает в себя слот для бутылки с водой, трубочный отбор проб воздуха, систему воздушного потока и датчик физической активности (рисунок 1D).
   1. Включите температурный корпус, систему воздушного потока и компьютер за 2 часа до начала анализа.
   2. Через 2 ч откройте программное обеспечение, управляющее корпусом (см. Таблицу материалов) и воздушным потоком, и позвольте программному обеспечению проверить связь компьютера с оборудованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящей работы использовалось программное обеспечение Oxymax.
   3. После установления связи щелкните Файл, затем Откройте конфигурацию эксперимента (рисунок 2A) и выберите конфигурацию эксперимента, предварительно разработанную поставщиком (или настроенную из предыдущего анализа).
   4. Нажмите «Эксперимент», затем нажмите « Свойства», после чего откроется окно «Свойства эксперимента» (рисунок 2B).
   5. В окне Свойства настройте параметры корпуса окружающей среды, включая температуру окружающей среды (21 °C) и циклы освещения 12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание программного обеспечения открытым и работающим позволяет воздуху поступать в клетки и корпус для поддержания выбранной температуры и световых циклов. Таким образом, вся система может работать с мышами внутри клеток в течение нескольких дней, даже без измерения кислорода и _CO2.
   6. Нажмите «Эксперимент», затем нажмите « Настройка», и откроется окно «Настройка эксперимента », где определены параметры каждой метаболической клетки.
   7. Назначьте каждый идентификатор мыши отдельной клетке, в которой находится мышь (рисунок 2C).
   8. Включайте мышечную массу или общую массу тела для каждой мыши только в том случае, если между группами не наблюдается различий в массе тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение исходных значений потребления кислорода и расхода энергии облегчает анализ ANCOVA.
   9. Установите скорость воздушного потока в метаболическую клетку на уровне 0,5-0,6 л/мин.
   10. В окне Настройка эксперимента выберите путь и имя файла для сохранения. Выберите каталог резервной копии (рисунок 2D).
   11. Добавьте предварительно взвешенное количество пищи в кормушки, которое покрывает, по крайней мере, потребление пищи в течение 1 дня.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки имеют встроенные весы, пища может быть добавлена напрямую, и программное обеспечение запишет ее.
   12. Добавьте бутылки с водой. Убедитесь, что флакон запечатан правильно и не протекает.
   13. Через 24 ч после добавления пищи взвесьте пищу, которая осталась на клетке.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленные граммы пищи минус граммы оставшейся пищи будут измерять потребление пищи.
   14. Начните измерения кислорода, _CO2 и активности (шаг 1.4.10), как только значения потребления пищи будут такими же, как у мышей, содержащихся в обычных клетках.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь завершается период акклиматизации (обычно 2-3 дня), и могут начаться измерения расхода энергии.
4. Непрямая калориметрия и измерения активности для оценки расхода энергии
   1. Измерьте массу тела, жир и мышечную массу всех мышей перед началом измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это значения массы тела и мышечной массы, используемые для выполнения анализа ANCOVA.
   2. Откалибруйте детектор системы CLAMS на основе _O2 и _CO2 на основе циркония (см. Таблицу материалов) с рекомендуемой концентрацией кислорода; всегда повторно калибруйте детектор перед началом нового эксперимента.
   3. Используйте калибровочный газ известного состава (20,50% кислорода и 0,50% _CO2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщики газа часто называют этот газ «первичным стандартным сортом».
   4. Включите и убедитесь, что выходное давление в баке составляет 5-10 фунтов на квадратный дюйм.
   5. Откройте программное обеспечение Calibration Utility для калибровки и тестирования газовых датчиков (рисунок 2E). Нажмите «Эксперимент», затем «Калибровка».
   6. Нажмите кнопку Пуск. Затем подождите, пока датчики будут протестированы и программное обеспечение попросит пользователя повернуть ручки газового датчика (рисунок 2F), пока значение идентификатора _O2 не достигнет 1 (рисунок 2G-H). Нажмите кнопку Далее, когда шаг будет завершен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если утилита калибровки выполняет все текущие шаги, калибровка автоматически перейдет к следующему шагу при заполнении индикатора выполнения.
   7. Проверьте результаты калибровки, когда все шаги будут выполнены, и результаты будут представлены.
   8. Выключите калибровочный газ.
   9. Измените питание и добавьте достаточное количество пищи на период 48-72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клетки могут быть открыты во время измерений расхода энергии для мониторинга массы тела и ежедневного изменения пищи, мыши могут подвергаться стрессу от этих манипуляций, и измерения теряются, когда клетки открываются. Таким образом, рекомендуется избегать любых манипуляций в период измерения.
   10. В программном обеспечении нажмите Эксперимент , а затем Выполнить , чтобы начать измерения кислорода_{, CO2} и активности (рисунок 3A).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение измерений можно отслеживать в режиме реального времени в коробке, расположенной в нижней левой части программного обеспечения (красный прямоугольник, рисунок 3B). Красный прямоугольник на рисунке 3B показывает, что система измеряет клетку No 1 с интервалом No 3, а именно 3-е измерение. Одно измерение в одной клетке может занять около 1 мин. Таким образом, при подключении 12 клеток потребление кислорода можно измерять примерно каждые 12 мин. Рекомендуется проводить непрерывные измерения в течение как минимум 48 ч.
   11. Остановите эксперимент, щелкнув Эксперимент, а затем Остановить (рисунок 3C).
   12. Откройте клетки, взвесьте мышей и пищу. Соберите кал для расчета количества калорий и липидов, выведенных за период измерений 48-72 ч.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Фекалии могут храниться при температуре -20 °C для последующего анализа. Эти клетки не могут быть эффективно использованы для сбора мочи.
   13. Нажмите «Эксперименты», затем «Экспорт» и «Экспортируйте все объекты в виде CSV-файла» (рисунок 3D).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения анализа ANCOVA необходимо экспортировать значения потребления сырого кислорода (_VO2) и производства _CO2 (_VCO2) без нормализации массы тела.
5. Анализ данных и контроль качества
   1. В экспортируемом листе CSV (рисунок 3D) (из шага 1.4.13) используйте исходные значения потребления кислорода (_VO2) и производства _CO2 (VCO2), измеренные каждые 12 мин в течение 2-3-дневного периода, которые автоматически перечисляются программным обеспечением и включают метку времени, а именно час и дату, когда они были измерены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения _VO2 и _VCO2 будут автоматически скорректированы при добавлении значений массы тела или мышечной массы.
   2. В экспортируемом листе CSV используйте необработанные значения коэффициента дыхательного обмена (RER: _VCO2/_VO2), которые автоматически вычисляются и перечисляются программным обеспечением в соответствии с их меткой времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, близкие к 1, показывают, что мышь в основном окисляет углеводы, в то время как значения, близкие к 0,7, показывают, что мышь в основном окисляет жир. RER выше 1 может возникать во время анаэробных упражнений, так как организм выталкивает больше _CO2 , чтобы компенсировать ацидоз, вызванный лактатом. RER выше 1 может указывать на стресс. Экспортированный CSV-файл также содержит исходные значения из расхода энергии (EE) или производства тепла в калориях в минуту на мышь, измеренные каждые 12 минут в течение 2-3 дней. Здесь все перечисленные значения содержат метку времени.
   3. Поскольку для ANCOVA необходимы одиночные значения EE на мышь, усредните значения EE, записанные между 09:00-16:00 для светлой (дневной) фазы и 19:00-04:00 для темной (ночной) фазы на мышь и день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать вручную с помощью Excel или Graph Pad. Выбор этих двух временных окон позволяет избежать усреднения промежуточных, постепенных и нестабильных значений ЭЭ, связанных со светло-темным фазовым переходом.
   4. В течение 48 часов рассчитайте среднее значение двух значений дневного света и двух значений темной фазы на мышь с помощью Excel или Graph Pad.
   5. Чтобы количественно оценить общую физическую активность, используйте Excel или Graph Pad для суммирования количества разрывов пучка x, y и z, измеренных в метаболических клетках и перечисленных в CSV-файле для каждой мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая активность x,y,z вычисляется сначала средним значением каждого X, Y, Z на мышь и цикл. Затем сумма каждого среднего значения X, Y, Z на мышь и цикл определяется для построения данных, как показано на рисунке 5E (в среднем за 2 дня).
   6. В качестве альтернативы, представьте данные, показывающие каждое значение измерения с течением времени, которые генерируют кривые, иллюстрирующие изменения в ЭЭ во время перехода от светлых к темным циклам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения о том, как и когда выполнять анализ ANCOVA, а различные формулы, используемые для расчета _VO2, _VCO2 и EE, приведены в Дополнительном файле 1.

2. Измерение способности термогенных адипоцитов расходовать энергию

1. Настройте измерения и обработку на мышах. Подробную информацию об экспериментальных препаратах для мониторинга потребления кислорода см. на этапе 1, поскольку термогенная емкость в адипоцитах определяется косвенно потреблением кислорода в соответствии с этапами 2.1.1-2.2.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует мышиной анестезии и острого лечения агонистом бета-3-рецептора CL-316,243 (см. Таблицу материалов), дающим быструю оценку термогенной способности БА.
   1. Выполните анализ состава тела и взвесьте мышей. Включите CLAMS, установите температуру на 30 °C (термонейтральность) и подождите 2 часа, пока вся система прогреется.
   2. Настройте остальные условия анализа, включая легкие, назначьте идентификатор мыши каждой клетке и добавьте значение массы тела каждой мыши в соответствующей клетке, если между группами не наблюдается различий в массе тела.
   3. Откалибруйте детектор кислорода/_CO2 , как показано на этапах 1.4.2-1.4.7.
   4. Запустите эксперимент в программном обеспечении.
   5. Введите каждой мыши пентобарбитал (60-120 мг/кг) и поместите каждую мышь в назначенную им метаболическую клетку (шаг 2.1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доза пентобарбитала, необходимая для поддержания сна мышей при термонейтральности (30 °C), варьируется в зависимости от штамма мыши и генотипа. Рекомендуется тестировать различные дозы пентобарбитала от 50 до 120 мг/кг и выбирать ту, которая держит мышь под наркозом в течение 2-3 ч при 30 °C. Эффективная анестезия необходима для устранения вклада физической активности в расход энергии.
   6. Чтобы обеспечить анестезию, наблюдайте за мышами после инъекции пентобарбитала до тех пор, пока они полностью не уснут и их сниженные показатели потребления кислорода не станут устойчивыми.
   7. Подождите, чтобы получить по крайней мере 3 стабильных последовательных уровня потребления кислорода перед инъекцией CL-316,243.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В ожидании стабилизации потребления кислорода подготовьте шприцы с CL-316,243 для каждой мыши (1 мг/кг).
   8. Открытая клетка No1 и впрыскивание CL-316,243 подкожно сразу после одного измерения _VO2 и _VCO2 происходило в клетке No1. Верните мышь в клетку No1 сразу после инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения отображаются в режиме реального времени в левом нижнем углу программного обеспечения (рисунок 3B, красный прямоугольник).
   9. Дождитесь измерения клетки No 2 (рисунок 3B, красный прямоугольник), а затем перейдите к шагу 2.1.8 для клетки No 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция CL-316,243 сразу после измерения позволяет поддерживать постоянную временную зависимость между инъекциями. Например, если работает 12 мышей / клеток, с измерениями, собранными в отдельных клетках последовательно, и коллекцией продолжительностью 55 с на клетку, то вы должны вводить одну мышь каждую минуту. При этих скоростях инъекций первое измерение будет происходить через 12 мин после инъекции во всех 12 клетках.
   10. Продолжайте измерения расхода энергии до тех пор, пока значения расхода энергии не станут плато в течение 5-6 последовательных измерений, обычно через 90-180 мин после инъекции.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могли проснуться от анестезии во время экспериментов. Эти мыши должны быть удалены из анализа. Поэтому предварительное тестирование доз пентобарбитала повысит эффективность исследований.
   11. Остановите измерения расхода энергии, но держите мышей в клетках при температуре 30 ° C, пока они не проснутся.
   12. После того, как мыши полностью проснутся, осмотрите здоровье мышей и верните их в свои первоначальные клетки.
   13. Экспортируйте данные каждой мыши в виде CSV-файла с помощью программного обеспечения оборудования, как описано в разделе 1.4.13.
2. Анализ данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных был выполнен Excel или Graphpad
   1. Постройте 3-5 последовательных значений _VO2, _VCO2 и EE, которые являются стабильными и постоянными с течением времени, поскольку это значения, представляющие скорость метаболизма, когда мыши полностью обезболены.
   2. Затем постройте график первого и последующих последовательных _{измерений VO2}, _VCO2 и EE, полученных после инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Абсолютные значения ЭЭ и кратное увеличение ЭЭ, индуцированное инъекцией, указывают на термогенную функцию ^БА7.

Результаты

На рисунке 4 показаны значения _VO2, _VCO2, теплопроизводства/расхода энергии (EE), коэффициента дыхательного обмена (RER) и значения физической активности X, Y, Z, полученные с использованием метаболических клеток системы CLAMS. VO2 и _VCO2, предоставляемые систем?...

Обсуждение

Непрямая калориметрия используется в течение многих лет для оценки расхода энергии всего ^тела4. Этот протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает простой способ измерения базальной скорости метаболизма и определения термогенной способности BA in vivo с исполь?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration