На месте Визуализация роста аксонов и динамики конуса роста в культурах эмбриональных срезов мозга Ex vivo

Резюме

Этот протокол демонстрирует простой и надежный метод изучения роста аксона in situ и динамики конуса роста. Он описывает, как подготовить ex vivo физиологически значимые острые срезы мозга и предоставляет удобный для пользователя конвейер анализа.

Аннотация

Во время развития нейронов аксоны перемещаются по корковой среде, чтобы достичь своих конечных пунктов назначения и установить синаптические связи. Ростовые конусы - сенсорные структуры, расположенные на дистальных кончиках развивающихся аксонов - выполняют этот процесс. Изучение структуры и динамики конуса роста имеет решающее значение для понимания аксонального развития и взаимодействий с окружающей центральной нервной системой (ЦНС), которые позволяют ей формировать нейронные цепи. Это важно при разработке методов реинтеграции аксонов в нейронные цепи после травмы в фундаментальных исследованиях и доклинических контекстах. До сих пор общее понимание динамики конуса роста в первую очередь основано на исследованиях нейронов, культивируемых в двух измерениях (2D). Хотя 2D-исследования, несомненно, имеют основополагающее значение для современных знаний о структурной динамике конуса роста и реакции на стимулы, они искажают физиологическую трехмерную (3D) среду, с которой сталкиваются конусы роста нейронов в неповрежденной ткани ЦНС. Совсем недавно коллагеновые гели были использованы для преодоления некоторых из этих ограничений, что позволило исследовать развитие нейронов в 3D. Тем не менее, как синтетические 2D, так и 3D-среды не имеют сигнальных сигналов в ткани ЦНС, которые направляют расширение и поиск пути развивающихся аксонов. Этот протокол обеспечивает метод изучения аксонов и колбочек роста с использованием органотипических срезов мозга, где развивающиеся аксоны сталкиваются с физиологически значимыми физическими и химическими сигналами. Сочетая тонко настроенную внутриутробную и внеутробную электропорацию для редкой доставки флуоресцентных репортеров вместе с микроскопией со сверхвысоким разрешением, этот протокол представляет собой методологический конвейер для визуализации динамики аксона и конуса роста in situ. Кроме того, включено подробное описание анализа данных визуализации долгосрочных и живых клеток.

Введение

Нейроны представляют собой сильно поляризованные клетки, которые представляют собой основную вычислительную единицу в нервной системе. Они получают и излучают информацию, которая опирается на разделение входных и выходных участков: дендритов и аксонов, соответственно¹. Во время разработки аксоны расширяются, ориентируясь в невероятной сложной среде, чтобы достичь места назначения. Аксонная навигация направляется конусом роста, сенсорной структурой, расположенной на кончике развивающегося аксона. Конус роста отвечает за обнаружение сигналов окружающей среды и перевод их в динамическую пространственную реорганизацию своего цитоскелета ^2,3. Полученные морфомеханические реакции инструктируют конус роста расширяться или втягиваться от триггерного сигнала, что приводит к специфическим маневрам аксона.

Современное понимание динамики расширения и роста конуса аксона проистекает из исследований, оценивающих рост аксонов над двумерными (2D) субстратами 2,4,5,6,7. Эти новаторские исследования выявили сложное взаимодействие между колбочками роста и субстратами роста и выявили поразительные различия, зависящие от характеристик субстрата, таких как адгезивность и жесткость ^8,9. Во главе с этими выводами были выдвинуты гипотезы о том, что внеклеточные сигналы окружающей среды диктуют рост аксонов, причем цитоскелет конуса роста выполняет этот рост 2,10,11,12. Примечательно, что нейроны могут расширять аксоны в неадгезивных субстратах (например, полилизин, полиорнитин)¹³. Кроме того, жесткость подложки может влиять на скорость роста аксона независимо от клеточных адгезивных комплексов⁸. Следовательно, изучение динамики конуса роста в 2D-субстратах само по себе не может точно смоделировать баланс сил, возникающий в результате взаимодействия конусов роста аксонов с физиологически значимыми трехмерными (3D) средами, такими как те, которые обнаружены in vivo.

Для преодоления ограничений 2D-анализов в 3D-матрицах ^8,9 были изучены рост аксонов и динамика конуса роста. Эти матрицы представляют собой более физиологический контекст, но позволяют изучать клеточные механизмы роста аксонов. Это позволяет исследовать конус роста одноклеточным способом в различных условиях и фармакологических методах лечения⁹. В таких 3D-средах аксоны демонстрировали отчетливую динамику цитоскелета и росли быстрее, чем те, которые наблюдались в 2D-культивируемых нейронах⁹. Эти изящные исследования продемонстрировали влияние дополнительного измерения на реорганизацию цитоскелета ростового конуса и, следовательно, на его поведение.

Несмотря на очевидные преимущества, предоставляемые 3D-матрицами по сравнению с 2D-поверхностями в поддержке развития нейронов и роста аксонов, они остаются упрощенным синтетическим каркасом, который не может отражать сложность динамики, наблюдаемой в ткани центральной нервной системы (ЦНС). Здесь доставка репортерных плазмид ex utero и in utero электропорация сочеталась с органотипической культурой среза мозга и визуализацией in situ с живым сверхвысоким разрешением для анализа динамики конуса роста в физиологическом контексте. Данная методика позволяет визуализировать развивающиеся аксоны при ощущении 3-мерности среды in vivo и сложности ее физико-химического состава. Наконец, описаны удобные для пользователя процедуры измерения роста аксонов и динамики конуса роста с использованием общелицензионного и общедоступного программного обеспечения.

протокол

Эксперименты на животных должны соответствовать соответствующим институциональным и федеральным правилам. Эмбриональный день 15,5 и 12,5 (E15.5 и E12.5) беременных самок мышей C57BL/6JRj был использован в этом протоколе. Эксперименты проводились в соответствии с Законом о благополучии животных Государственного агентства по охране окружающей среды Северной Рейн-Вестфалии (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).

1. Подготовка плазмид к инъекциям

1. Изолируйте ДНК с помощью набора Maxiprep без эндотоксинов в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
2. Смешайте выбранную ДНК в желаемой концентрации (таблица 1) и 10% раствор Fast Green (см. Таблицу материалов) для визуализации доставки смеси ДНК в желудочки мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Специфические плазмиды использовались для разреженной маркировки корковых нейронов (рисунок 1A), нитевидных актиновых (F-актиновых) структур в конусе роста (рисунок 1B) и двойной маркировки ростовых колбочек в одной коре (рисунок 1C). Все плазмиды (таблица 1), используемые в этом протоколе, были депонированы в Addgene (см. Таблицу материалов).
3. Подготовьте стеклянные капилляры с помощью набора капиллярного электродного съемника в соответствии со следующей программой: давление: 500, тепло: 800, тяга: 30 и скорость: 40.
4. Загрузите 15 мкл смеси ДНК / Fast Green в каждый стеклянный капилляр с помощью наконечников пипетки микрозагрузчика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пузырьки не образуются.
5. Храните заполненные ДНК капилляры в 10-сантиметровой посуде с кусочком моделирующей глины по всему диаметру тарелки. Капилляры можно загружать и хранить при 4 °C за день до эксперимента. Запечатайте заднюю часть капилляра гибкой пленкой для предотвращения высыхания.

2. Приготовление растворов

1. Приготовьте раствор буферной соли Хэнка, дополненный глюкозой (HBSS-G).
   1. Добавьте 0,5% от 20% запаса глюкозы во флакон 1x HBSS. Хорошо перемешать и хранить при 4 °C до 2 недель. Для извлечения эмбриона пузырьковый раствор HBSS-G с карбогеном (95% O₂ и 5% CO₂) используют пузырьковый камень незадолго до сбора эмбрионов.
2. Решение для монтажных носителей
   1. Приготовьте свежие срезы, содержащие нейробазаль 1x, 5% конскую сыворотку, 5% икроножную сыворотку плода, добавку B27 1:50, добавку L-глутамина 1:400, пенициллин-стрептомицин 1:200 и добавку Neuropan-2 1:100 (при рН = 7,3), в стерильных условиях (см. Таблицу материалов).
   2. Приготовьте 3 см блюдо по 1 мл ломтика в каждой. Поместите в инкубатор при 35 °C с 5% CO₂ в течение, по меньшей мере, 1 ч до эксперимента, чтобы уравновесить рН среды посредством газообмена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание pH среды вызвано подкислением среды CO₂ из инкубатора. Срезы могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
3. Раствор агарозы с низкой температурой плавления (3%)
   1. Взвесьте нужное количество порошка агарозы с низкой температурой плавления и растворите в соответствующем объеме 1x HBSS-G в стеклянной бутылке. Требуется примерно 7 мл раствора агарозы на мозг.
   2. Поместите флакон в микроволновую печь на 2-3 мин, свободно поставив колпачок, и встряхивайте каждые 10-20 с.
   3. Как только порошок полностью растворится, поместите бутылку на водяную баню или бисериновую ванну, установленную на 37 °C, по крайней мере, за 1 ч до начала эксперимента, чтобы агароза остыла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется нагревать агарозу дважды в течение 15 минут, чтобы убедиться, что порошок агарозы растворен. Это имеет решающее значение для правильной адгезии агарозы к мозговой ткани. Термометр следует использовать для измерения температуры раствора агарозы при встраивании мозга, убедившись, что она находится между 37-40 ° C. Мозг разных возрастных животных имеет разную жесткость. Рекомендуется проверить диапазон концентраций агарозы, чтобы найти однородность между тканью и агарозой.
   4. Приготовьте фосфатный буферизованный физиологический раствор с 0,3% тритона X-100 (PBS-T).
   5. Приготовьте фосфатный буферизованный физиологический раствор с 0,2% азида натрия (PBS-NaN₃).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, описанные на этапах 2.4-2.5, предназначены для использования на более поздней стадии иммуногистохимии.

3. Подготовка хирургического отделения

1. Очистите операционную станцию 70%-96% этанолом и поместите операционную подложку на поверхность станции.
2. Стерилизуйте хирургические инструменты путем промывки 70-96% этанолом, а затем сухой стерилизацией в горячем стерилизаторе.
3. Очистите платиновые электроды пинцета (см. Таблицу материалов) с 70%-96% этанолом перед подключением к генератору импульсов.
4. Вставьте заполненный ДНК/Fast Green стеклянный капилляр в капиллярный держатель. Непосредственно перед использованием аккуратно отломите кончик капилляра тонкими ножницами и проведите тестовый раствор внутри микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл, заполненной предварительно нагретым физиологическим раствором или водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2A, B показана установка хирургической станции и инструменты, используемые для электропорации ex utero (EUE) и внутриутробной электропорации (IUE).
5. Для МСЭ разогреть солевой раствор до 37 °C на водяной бане.

4. Извлечение эмбриона

1. Поместите беременную мышь в индукторную камеру анестезии с 5% изофлураном до тех пор, пока мышь не будет глубоко обезболена. Подтверждают анестезию отсутствием рефлекса снятия педали.
2. Переведите мышь на операционную подложку и выдержите изофлуран на уровне 1,5%-2% через носовой конус.
3. Нанесите мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы.
4. Побрейте брюшко мыши, а затем используйте 70-96% пропитанную этанолом марлю для удаления бритых волос. Очистите область бетадином.
5. Используя стерильные небольшие хирургические ножницы, сделайте разрез кожи 2 см вдоль средней линии живота, а затем разрез мышцы 1,5 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер разреза зависит от размера эмбриона. Действительно, более крупные эмбрионы потребуют большего разреза для размещения их извлечения.
6. Вырежьте отверстие в середине марли достаточно широко, чтобы поместиться в разрезе кожи (~ 2 см в диаметре), замочите его теплым физиологическим раствором и поместите вокруг брюшного отверстия.
7. Вытащите оба рога матки с помощью ватной палочки, смоченной в теплом физиологическом растворе или с помощью щипцов, осторожно захватывая промежутки между эмбрионами, чтобы вытащить их. Поместите эмбрионы на влажную марлю (рисунок 2С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже небольшое повреждение кровеносных сосудов и капилляров вокруг рогов матки, скорее всего, приведет к обильному кровотечению. Поэтому избегайте прямого обращения с этими васкуляризированными областями в любое время.
8. Разрежьте маточный мешок и удалите каждый эмбрион (рисунок 2D).
9. Усыпляют каждый эмбрион сразу после экстракции с помощью нисходящего диагонального разреза, обеспечивая полную трансекцию спинного мозга (рисунок 2E).
10. Поместите эмбрионы в 10-сантиметровую посуду, содержащую HBSS-G на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегается обезглавливание эмбриона, чтобы предотвратить утечку смеси ДНК / Fast Green из мозга и облегчить позиционирование эмбриона в держателе (см. электропорация ex utero , этап 5).
11. Жертвуют матерью сразу после извлечения эмбрионов, выполняя вывих шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мать подвергается эвтаназии под наркозом, чтобы избавить ее от любых дальнейших боли или страданий после процедуры в соответствии с протоколом, утвержденным Законом о благополучии животных Государственного агентства по охране окружающей среды Северной Рейн-Вестфалии (LANUV).

5. Внематочная электропорация (EUE)

1. Возьмите эмбрион и поместите его в держатель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезанный наконечник пипетки объемом 1 мл, прикрепленный к концу клеточного скребка, используется в качестве держателя эмбрионов. Во время процедуры важно держать руки эмбрионов вне кончика, чтобы предотвратить их скольжение в кончик (рисунок 2F-I). Диаметр наконечника пипетки легко регулируется для размещения эмбрионов различных размеров. Вырежьте второй наконечник по длине, где диаметр наконечника соответствует размеру эмбриона, и используйте его в качестве переходной вставки к держателю, упомянутому выше.
2. Осторожно вставьте ЗАПОЛНЕННЫЙ ДНК/Fast Green стеклянный капилляр через череп эмбриона в боковой желудочек и введите 2-3 мкл плазмидной смеси ДНК (Рисунок 1A,B; Таблица 1) в каждый желудочек (рисунок 2F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте лямбдоидальные и сагиттальные швы в качестве руководства по месту инъекции ДНК. Лямбдоидальные и сагиттальные швы представляют собой фиброзные суставы, соединяющие костную пластину черепа. Первый соединяет теменную кость с затылочной костью, а второй соединяет две теменные кости.
3. Держите голову эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на желаемую область мозга (угол 60° в данном случае), катодом, обращенным к области, где предназначен перенос ДНК (рисунок 2G-H).
4. Примените пять импульсов при 30 мВ с интервалом 1 с и длительностью 50 мс с помощью генератора импульсов квадратной волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что мозг в EUE испытывает более эффективное электрическое поле, чем в IUE. Следовательно, при данной концентрации ДНК EUE приводит к более высокой эффективности переноса ДНК, чем IUE, и концентрации ДНК должны быть соответствующим образом скорректированы.
5. Если требуется двусторонняя электропорация, повторите шаги 5.3-5.4 с катодом и анодом, отражающими предыдущее положение, чтобы нацелиться на контралатеральную кору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку обоим желудочкам вводили ДНК, кора обоих полушарий была нацелена.
6. Поместите электропорированный эмбрион в 6-сантиметровую посуду, содержащую холодный HBSS-G. Повторите шаги 5.1-5.6 для всех необходимых эмбрионов.

6. Внутриутробная электропорация (МСЭ)

1. Вводят беременной мыши анальгетик; 50 мкл бупренорфина (0,1 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно, за 20 мин до процедуры.
2. Выполните шаги 4.1-4.8 из секции извлечения эмбриона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте оставлять эмбрионы без необходимости, покрывая их стерильной марлей, смоченной в теплом физиологическом растворе.
3. Кончиками пальцев осторожно поворачивайте эмбрион внутри матки до тех пор, пока не будут расположены лямбдоидальные и сагиттальные швы (рисунок 2J). Осторожно вставьте днк / быстрый зеленый стеклянный капилляр через стенку матки и череп эмбриона в боковой желудочек и введите 2-3 мкл плазмидной смеси ДНК (рисунок 1A, C) в один или оба желудочка по желанию (рисунок 2K-L).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное давление пальцев на рога матки может привести к коллапсу амниотического мешка.
4. Держите головку эмбриона между платиновыми электродами пинцета под соответствующим углом, чтобы нацелиться на желаемую область мозга (угол 60 ° в данном случае), катодом, обращенным к области, где предназначен перенос ДНК. Избегайте сдавливания матки, так как это может вызвать коллапс амниотического мешка (рисунок 2M).
5. Подайте пять импульсов на 35 мВ с интервалом 600 мс и длительностью 50 мс с помощью генератора импульсов квадратной волны.
6. Если были введены оба боковых желудочка, повторите шаги 6,5-6,6 с катодом и анодом, отражающими предыдущее положение, чтобы нацелиться на контралатеральную кору.
7. Повторите шаги 6.3-6.6 для всех необходимых эмбрионов.
8. После того, как все необходимые эмбрионы будут электропорированы, используйте пропитанную физиологическим раствором ватную палочку, чтобы аккуратно поместить рога матки обратно в брюшную полость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление физиологического раствора в брюшинную полость поможет маточным рогам вернуться в исходное положение.
9. Шовные разрезы мышц и кожи с использованием 5-0 шовного материала. Используйте шовные клипсы для закрепления раны и дезинфекции шовной раны, опрыскивая ее бетадином (рисунок 2N-P).
10. Вводят мышам 200 мкл 5% глюкозы подкожно.
11. Вводят мышам антибиотик; 50 мкл энрофлоксацина (5 мг/кг) подкожно (см. Таблицу материалов).
12. Поместите мышь обратно в восстановительную клетку и поддерживайте тепло с помощью дальнего инфракрасного согревающего света или грелки в течение не менее 20 минут после процедуры (рисунок 2Q).
13. Ежедневно контролируйте мышь и вводите мелоксикам после процедуры обезболивания в соответствии с институциональными и федеральными рекомендациями.
14. Извлеките эмбрионы через 2 дня после процедуры (т.е. E17.5) после шага 4.

7. Извлечение и встраивание мозга в агарозу

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять следующие шаги под рассеченным микроскопом для лучшей точности. Предотвращение повреждения мозга имеет решающее значение для успеха процедуры.

1. Установите инструменты экстракции в стерильном рабочем пространстве под вытяжкой (рисунок 3A).
2. Отделите головку эмбриона от остальной части тела с помощью ножниц для рассечения.
3. Зафиксируйте голову, как показано на рисунке 3C, а затем удалите кожу и череп, разрезав вдоль средней линии, начиная от основания головы к носу (рисунок 3D).
4. Очистите кожу и череп сбоку, создав достаточно большой зазор (~ 1 см) для иссечения мозга.
5. Чтобы удалить мозг, вставьте закрытый наконечник стерильных ножниц для рассечения, начиная с обонятельной луковицы, двигаясь в сторону ствола мозга (рисунок 3E).
6. Отрежьте ствол мозга и обрежьте любые свободные куски мозговых оболочек вокруг мозга (рисунок 3F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рыхлые мозговые оболочки часто приводят к тому, что срезы остаются прикрепленными к блоку агарозы после разрезания, что приводит к отделению ткани от агарозы во время сбора срезов.
7. Повторите шаги 7.1-7.6 для всех эмбрионов и держите мозг на льду (в идеале не дольше 30 минут) до этапа встраивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги 7.7.1-7.7.4 относятся к извлечению мозгом E12.5.
   1. Изолируйте верхнюю часть головы чуть ниже глаза, как показано на рисунке 3G.
   2. Вырежьте кожу и череп поверх ствола мозга, следуя пунктирной линии, как показано на рисунке 3H, без удаления ствола мозга.
   3. Сделайте 2 мм разрез кожи-черепа в затылке, как показано на рисунке 3I (см. рисунки для ясности).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез обеспечивает начальные точки захвата для отслаивания слоев кожи и черепа. Как правило, они отрываются в виде одного слоя. Типичный размер разреза составляет 2 мм, что соответствует длине режущей кромки используемых ножниц микропрупил.
   4. Начните отслаивать слои кожи и черепа, закрепляя одну сторону разреза и осторожно вытягивая другую. С такой же осторожностью завершайте, отслаивая основание головы до освобождения мозга (рисунок 3J).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано с большой осторожностью, наблюдая, что мозг не тянется вдоль тканевых слоев. Чередуйте стороны для удаления ткани, покрывающей мозг.
8. Теплую агарозу (при 37-40 °С) вылить в посуду 3 см.
9. Поднимите мозг с помощью перфорированной ложки и удалите лишнюю жидкость, обмакнув дно ложки в сухую папиросную бумагу. Поместите мозг в блюдо из агарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше жидкости со всего мозга, чтобы обеспечить лучшую адгезию агарозы к ткани.
10. Положите блюдо с жидкой агарозой на лед. Используя меньшую ложку, смешайте агарозу в течение 10 с для равномерного охлаждения. Маневрируйте мозгом до середины тарелки. Поместите мозг горизонтально в чашку спинной стороной вверх, убедившись, что она полностью покрыта агарозой со всех сторон (рисунок 3K).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг часто опускается на дно блюда после того, как его помещают в агарозу; поднимать мозг с помощью небольшой ложки до тех пор, пока не будет установлена щель в 1-2 мм под мозгом.
11. Повторите шаги 7.8-7.10 для всех мозгов.
12. Как только агароза полимеризуется, добавьте 500 мкл HBSS-G поверх блока агарозы, чтобы предотвратить высыхание. Затем накройте блюдо льдом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образец на льду в течение 5 минут перед разделением, чтобы температура мозга достигла 4 ° C.

8. Органотипическая срезовая культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите вибратом и окружающие поверхности 70%-96% этанолом, чтобы избежать загрязнения срезов. Настройка рабочей станции вибратома (см. Таблицу материалов) показана на рисунке 3B.

1. Наполните буферный лоток вибратома холодным HBSS-G, а внешний лоток льдом, чтобы поддерживать HBSS-G холодным на протяжении всей процедуры.
2. Непрерывная подача HBSS-G в буферный лоток с карбогеном с помощью пузырящегося камня.
3. Используя свежее лезвие, сделайте большой разрез (~ 2 х 2 см) вокруг мозга и удалите блок агарозы, содержащий мозг, с достаточным количеством окружающей агарозы, чтобы обрезать агарозу в небольшой прямоугольный блок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет отрегулировать угол блока таким образом, чтобы сагиттальная ось мозга была перпендикулярна пластине вибратома, а корональная ось выравнивалась параллельно лезвию. Оставьте около 5 мм агарозы на спинной стороне мозга для легкой обработки ломтиков.
4. Поместите небольшую каплю суперклея без растворителя в середину держателя образца и распределите в область, которая покроет дно блока агарозы.
5. Аккуратно поднимите блок агарозы и высушите дно, обмакнув папиросную бумагу. Поместите блок на склеенную область держателя образца, ростральной стороной мозга вверх. Положите держатель образца на лед и дайте клею высохнуть в течение 1 мин.
6. Как только клей высохнет, поместите держатель образца в буферный лоток.
7. Разрежьте мозг корональными срезами под углом 15°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина срезов может варьироваться в зависимости от применения. Здесь мозги были разрезаны на толщину 150 мкм. Установите скорость вибратома на 1,0-1,5 мм/с для обрезки избытка агарозы сверху и обрезки обонятельных луковиц. Уменьшите скорость резания до 0,5 мм/с для сбора кортикальных срезов для анализа. Большинство вибратомов можно приостановить, чтобы собрать каждый кусочек. Если наблюдается снижение качества срезов или отсоединение ткани от агарозы, может помочь снижение скорости резания или замена лезвия вибратома.
8. Используя чистые шпатели, соберите срезы мозга и поместите их на мембрану политетрафторэтилена (PTFE), иммобилизованную в 35-миллиметровую стеклянную посуду с использованием парафина (до пяти мозговых срезов / мембраны) (рисунок 3L-M).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепите мембрану из PTFE внутри 35-миллиметровой тарелки со стеклянным дном с использованием воска. Это стабилизирует мембрану при добавлении культуральной среды среза, а также во время визуализации.
9. Используя пипетку объемом 200 мкл, удалите избыток HBSS-G вокруг ломтиков на мембране из PTFE, оставив ломтики полусухими.
10. Добавьте 500 мкл среза (предварительно нагретого до 35 °C) непосредственно в пространство под мембраной из PTFE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении среды под мембраной не должно образовываться пузырьки. Это оставит целые или частичные фрагменты без обмена медиа. Заменяйте 200 мкл носителя каждые 2 дня в культуре или после каждого сеанса визуализации.
11. Инкубировать ломтики при 35 °C с 5% CO₂.

9. Иммуногистохимия

1. Зафиксируйте ломтики с 1 мл 4% параформальдегида (PFA) с добавлением 4% сахарозы на блюдо. Инкубировать в RT в течение 30 мин.
   ВНИМАНИЕ: При работе с PFA надевайте лабораторный халат и перчатки. Выполните этапы фиксации под химическим капотом и утилизируйте отходы PFA соответствующим образом.
2. Вымойте ломтики дважды с 300 мкл PBS в течение 5 мин. Переложите ломтики на 24-луночную тарелку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен. Добавьте PBS-NaN₃ в ломтики и храните при температуре 4 °C. NaN₃ является токсичным соединением; при обращении с растворами с ним надевайте лабораторное пальто и перчатки. Шаги 9.3-9.10 должны выполняться в орбитальном шейкере.
3. Закаляйте ломтики 300 мкл 0,1 М глицина при 4 °C в течение ночи.
4. Промыть глицин PBS при RT 3x в течение 10 мин.
5. Пермеабилизируйте ломтики 300 мкл PBS-T при RT в течение 2 ч.
6. Блокируют с использованием 10% козьей сыворотки в PBS-T при RT в течение 2 ч.
7. Добавьте 300 мкл первичного антитела (анти-виментиновое антитело в разведении 1:200; см. Таблицу материалов), разведенного в 10% козьей сыворотке в растворе PBS-T при 4 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 9.8-9.12 срезы были защищены светом для предотвращения потери флуоресценции.
8. Промывайте первичное антитело PBS при RT 3x в течение 20 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS использовался вместо PBS-T для промывки Triton X-100.
9. Добавьте 300 мкл вторичного антитела (либо Alexa Fluor 488, либо 647 в разведении 1:400; см. Таблицу материалов) в PBS при RT в течение 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI добавляют сразу после удаления вторичного антитела в разведении 1:10 000 в течение 5 мин.
10. Промыть вторичное антитело PBS при RT 3x в течение 20 мин. Промыть дистиллированной водой 2x в течение 1 мин.
11. Переложите ломтики на стеклянную горку мелкой кистью, а затем высушите при 30 °C в течение 20 минут.
12. Смонтируйте срезы с помощью водного монтажного носителя. Держите слайды на RT в течение ночи, чтобы монтажный носитель мог быть курирован.

10. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от подхода к доставке ДНК (IUE или EUE), срезы анализировались в одном и том же возрастном диапазоне развития (E17.5-E18.5). IUE позволяет нейронным прародителям делиться и развиваться в течение еще двух дней in vivo. EUE, с другой стороны, позволяет отслеживать события раннего развития.

1. Включите камерный инкубатор и установите его на 35 °C с 5% CO₂ - в идеале за 4 часа до визуализации - чтобы компоненты микроскопа уравновешивались при 35 °C.
2. Для глубокой визуализации срезов используйте цели погружения в воду, чтобы уменьшить несоответствие показателя преломления между тканью и объективом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался режим изображения со сверхвысоким разрешением. Визуализация через мембрану из PTFE требует объектива с большим рабочим расстоянием (~ 1 мм). Если цель на большом рабочем расстоянии недоступна, ломтики могут быть перенесены в блюдо со стеклянным дном из 8 лунок. Чтобы перенести срезы, добавьте 1 мл среза среды в верхнюю часть мембраны, а затем используйте шпатель, чтобы поднять срез и перенести его в скважину, содержащую 200 мкл среды. Удалите лишнюю среду с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл, оставив ломтики полусухими.
3. Для визуализации роста аксона найдите область коры с низкой и средней плотностью клеток. Для визуализации динамики ростовых конусов найдите конус роста в промежуточной зоне коры или субвентрикулярной зоне.
4. Определите размер z-стека в программном обеспечении для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Для роста аксона в большом z-стеке установите размер шага 2 мкм. Для ростовых конусов в меньшем z-стеке установите размер шага 1 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда учитывайте потенциальное движение конуса роста и аксона через плоскости x, y и z. Аксоны растут гораздо более высокими темпами в оловотипических культурах, чем в культурах in vitro . Здесь z-стек около 80 мкм для изображения роста аксона был достаточным. Для динамики конуса роста z-стек ~6 мкм был достаточным.
5. Для визуализации роста аксонов нейронов на большей площади определите сканирование плитки.
6. Используйте самую низкую возможную мощность лазера, чтобы свести к минимуму вероятность обесцвечивания ростовых колбочек во время приобретения.
7. Для визуализации роста аксонов приобретайте таймлапсы в течение 2 ч с интервалом 5 мин. Для визуализации динамики роста конуса приобретают таймлапсы в течение 2-5 мин с интервалом 2,5-3 с.

11. Анализ данных

1. Измерение скорости роста аксонов с помощью кимографов
   1. Откройте файл изображения в Fiji¹⁴ через файл > Открыть и выберите изображение.
   2. Получите проекцию максимальной интенсивности замедленной съемки с помощью стеков > изображения > Z-проекции > проекции максимальной интенсивности.
   3. Пройдите таймлапс и найдите растущий аксон.
   4. Оказавшись на месте, проведите линию через растущий аксон. Начните с кончика аксона в первом кадре и следуйте за аксоном на протяжении всего таймлапса.
   5. Сгенерируйте кимограф с помощью плагина KymoResliceWide.
   6. Установите масштаб кимографа, перейдя в раздел Свойства > изображения. Установите расстояние в мкм в поле Ширина в пикселях и установите время в s или min в Пиксельной высоте.
   7. Перейдите в раздел Анализ > меры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будет указан угол относительно оси X.
   8. Рассчитайте скорость роста аксона, подставив угол в следующем уравнении: SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) в электронной таблице.
2. Измерьте объем конуса роста с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
   1. Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений через файл > Открыть и выберите интересующий файл.
   2. Выберите мастер добавления новых поверхностей .
      ПРИМЕЧАНИЕ: В левом нижнем углу появится раздел с шестью шагами для ручного редактирования.
   3. На шаге 1 в разделе Настройки алгоритма выберите Сегментировать только интересующую область. На шаге 2 обрежьте рамку, чтобы она соответствовала всему конусу роста во всех кадрах.
   4. На шаге 3 установите пороговое значение абсолютной интенсивности и убедитесь, что на шаге 4 достигнут пороговый уровень всей области конуса роста.
   5. На шаге 5 выберите Количество вокселей lmg = 1 в разделе Тип фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На последнем шаге может быть создано несколько наборов измерений. Здесь было создано только одно измерение для объема.
   6. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы выполнить все шаги создания и завершить работу мастера добавления новых поверхностей.
   7. На вкладке Статистика в верхней части окна мастера выберите Конкретные значения и том на вкладке Подробно .

Результаты

Показаны репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода рабочего процесса. Мыши E15.5 были использованы в настоящей демонстрации, хотя этот протокол легко адаптируется практически ко всем эмбриональным возрастам, начиная от E11 до позднего E17. В этом протоколе либо ex utero electroporation (EUE; Рисунок 2А, 2С-I) или внутриутробная электропорация (МСЭ; Рисунок 2B, C и 2J-Q) использовались для доставки плазмид в нейроны-предшественники, выстилающие боковые желудочки. Эти предшественники являются источником будущих кортикальных проецирующих нейронов (CPN)^15,16. Плазмидные смеси были подготовлены для управления разреженной нейрон-специфической экспрессией либо мембранно-целевого (Lyn)-mNeonGreen (Рисунок 1A), либо LifeAct-enhanced (E)GFP (Рисунок 1B) для оценки общего поведения и динамики актина в колбочках роста, соответственно. Кроме того, была включена плазмидная смесь, предназначенная для маркировки отдельных нейронов либо турбо(t)-RFP, либо зеленым флуоресцентным белком zoanthus sp. (Zs) (ZsGreen) (рисунок 1C). Это облегчает мониторинг поведения конуса роста от независимых соседних нейронов.

Вскрытие мозга из электропорированных эмбрионов является решающим шагом, который необходимо тщательно выполнить, чтобы получить высококачественные срезы, сохраняющие нативную структуру мозга. Инструменты для рассечения и вибратом готовили заранее и тщательно стерилизовали этанолом (рисунок 3А,В). Далее были тщательно рассечены головки электропорированных эмбрионов и извлечен мозг. Здесь показано репрезентативное рассечение мозга эмбрионов, подвергшихся воздействию EUE на E15 (рисунок 3C-F) и E12.5 (рисунок 3G-J). Мозг немедленно заключают в агарозную матрицу, нарезают и помещают на мембранные вставки из PTFE в нижней стеклянной чашке для инкубации (рисунок 3K-M).

Состояние здоровья срезов мозга является важным моментом для контроля для обеспечения надежных результатов. Ежедневно проводился визуальный осмотр на предмет каких-либо загрязнений. Кроме того, как только культура была завершена, срезы мозга фиксируются и подвергаются иммуногистохимии. Здесь,4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) использовался для контроля общей клеточной организации и окрашивания виментина для выявления глиальной организации; в частности, радиальные глиевые (RG) каркасы. Как правило, успешно культивируемые срезы мозга, полученные из IUE или EUE, показывают нормальное клеточное распределение, выявленное DAPI и несколько организованным массивом RG с апикально ориентированными пиально-контактными процессами¹⁷ (рисунок 4A, B соответственно). Иногда наблюдаются заметные нарушения в строительных лесах RG в культивируемых срезах мозга, особенно в тех, которые получены в результате электропорации EUE (рисунок 4C). Срезы мозга с крайне дезорганизованным каркасом RG показывают нарушение миграции нейронов и дефектный рост аксонов (не показаны). Следовательно, управление каркасом RG является простым посткультурным методом сортировки данных, полученных из надежных срезов мозга.

Срезы мозга, полученные из IUE или EUE с Lyn-mNeonGreen-экспрессирующей плазмидной смесью, приводят к аналогичной разреженной маркировке нейронов. В качестве примера показана репрезентативная пирамидальная КПН, выражающая Lyn-mNeonGreen и динамическое поведение ее конуса роста (рисунок 5A и дополнительное видео 1, вверху слева). Кроме того, нейроны были помечены с помощью плазмиды, экспрессирующей актиновый зонд, для анализа динамики актина аксональных колбочек роста in situ (рисунок 5B и дополнительное видео 1, внизу слева). Эксперименты in situ также проводились с двойным Cre/Dre флуорофор-экспрессирующим дизайном плазмиды (рисунок 1C и дополнительное видео 1, справа). Флуорофоры tRFP или ZsGreen в этой плазмиде могут быть специфически и индивидуально активированы рекомбиназами Dre или Cre соответственно в соседних нейронах (рисунок 5C). Эта экспериментальная линейка позволяет параллельно анализировать колбочки роста от контрольных нейронов с соседними модифицированными нейронами (любая данная потеря или усиление функции). Это позволяет обойти изменчивость, возникающую в результате использования различных срезов для тестирования контрольных и экспериментальных условий.

Были проанализированы кимографы, полученные из записанного фильма, из которых можно легко получить динамические параметры роста, такие как протрузивная активность с течением времени и длина роста (рисунок 6А). Обратите внимание, что простая регулировка временного разрешения замедленной съемки позволяет измерять скорость удлинения аксона в течение 2 ч (рисунок 6А). Кроме того, изменение объема конуса роста с течением времени - мера общей динамической активности конуса роста - может быть легко получено, в данном случае с помощью лицензионного программного обеспечения (рисунок 6B и рисунок 6E, F). Это может быть использовано для оценки скорости беговой дорожки актина и баланса филоподий / ламеллиподий во время активности исследования конуса роста.

Рисунок 1: Схемы плазмид, используемых в протоколе. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Соответствующая информация о плазмидных компонентах и происхождении флуорофора находится в коробках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Рабочий процесс внеутробной и внутриутробной электропорации мышей E15.5. (A) Создание хирургической станции для внеутробной электропорации. (B) Создание хирургической станции для внутриутробной электропорации. (C) Рога матки, вытянутые за пределы брюшной полости анестезированной мыши. (D) Извлечение эмбриона из маточного мешка. e) жертвоприношение эмбриона путем полной трансекции спинного мозга с помощью диагонального разреза; обратите внимание, что обезглавливания удалось избежать. (F) Помещение эмбриона в держатель и введение смеси ДНК/Fast Green в левый боковой желудочек. (Г,Ч) Расположите головку эмбриона между платиновыми электродами пинцета катодом (красная стрелка) над корой под углом 60°. (I) Размещение рук эмбриона (черные стрелки) вне держателя для предотвращения скольжения эмбриона во время процедуры. (J) Вращение эмбриона внутри маточного мешка для обнажения головы. (К,Л) Инъекция смеси ДНК/Fast Green в боковые желудочки эмбриона через стенку матки. (M) Расположите головку эмбриона между платиновыми электродами пинцета катодом (красная стрелка) над корой под углом 60°. (N) Ушной разрез мышц с помощью скользящего стопорного шва. (O) Ушной разрез кожи прерванным швом. (P) Закрепление раны с помощью хирургических раневых зажимов и дезинфекция с использованием бетадина. (Q) Помещение мыши в восстановительную клетку с дальним инфракрасным теплым светом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Экстракция мозга Е15.5 и Е12.5 и процедура культуры органотипического среза. (A) Инструменты, используемые для процедуры извлечения мозга. (B) Создание станции органотипической культуры. (С-Ф) Экстракция мозга Е15.5. (Г-Дж) Извлечение мозга Е12.5. Пунктирные линии выделяют расположение разрезов. Красные стрелки указывают направление вытягивания щипцами. (K) Встраивание мозга в 3-сантиметровую чашку, содержащую 3% агарозы с низким содержанием расплава, оставляя разрыв между агарозами 1-2 мм под мозгом. (L) Коллекция 150 мкм мозгового среза. (M) Размещение срезов мозга на мембранных вставках из PTFE, обездвиженных в 35-миллиметровой чашке с использованием парафиновой пленки (синяя стрелка). Красная звездная маркировка указывает на данный набор срезов мозга из вибратома (L) и его перенос на мембрану PTFE (M). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Сохраненная радиальная глиальная клеточная структура в здоровых органотипических срезах. Конфокальные изображения срезов мозга E17.5, показывающие массив RG (виментин; зеленый) и общую организацию клеток (DAPI; пурпурный) после IUE (A) и EUE (B, C). Обратите внимание на сильные возмущения в массиве RG, которые могут иногда возникать в результате EUE (C). Увеличения соответствуют красным пунктирным рамкам на главном рисунке: шкала, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Визуализация in situ динамики конуса роста в острых оловоорганических срезах. (А,Б) Нейроны и соответствующие им конусы роста помечены Lyn-mNeonGreen и LifeAct-GFP соответственно. Красная звезда отмечает рост конуса экспрессирующего нейрона Lyn-mNeonGreen. Синяя звездочка, отмечающая рост конуса экспрессирующего нейрона LifeAct-GFP. (C) Соседние нейроны, помеченные двойной плазмидной системой, содержащей tRFP (пурпурный) и ZsGreen (зеленый) и соответствующие им колбочки роста. Изображенные на снимке конусы роста (справа) находились за пределами захваченного кадра (слева), полученного вскоре после приобретения такого времени конуса роста; шкала, 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Анализ скорости роста аксона и объема конуса роста. (A) Трассировка аксона на нейроне, экспрессирующем Lyn-mNeonGreen (вверху) и соответствующем ему кимографе (внизу), сгенерированном с помощью ImageJ. (B) Реконструкция z-стекового видео конуса роста с использованием программного обеспечения для анализа изображений (вверху) и того же конуса роста, выделенного с помощью инструмента измерения поверхностей (ниже). (C) Графики, показывающие изменения скорости роста с течением времени для нескольких аксонов. (D) Средняя скорость роста аксонов измеряется в (C). E) График, показывающий изменения объема конуса роста с течением времени. F) средний объем ростовых конусов количественно оценивается в пункте (E); шкала, 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Радиальная миграция и поляризация нейронов пирамидных корковых нейронов. Диаграмма, иллюстрирующая развивающиеся пирамидальные корковые нейроны (розовый), мигрирующие радиально из зародышевой желудочковой зоны (VZ) к поверхности пиа. Руководствуясь радиальными глиальными процессами (серыми), мигрирующие поляризованные нейроны устанавливают ведущий процесс, будущий дендррит, и замыкающий процесс, будущий аксон, которые продолжают простираться вниз к промежуточной зоне (IZ). Пунктирные красные поля представляют собой кортикальные области, где были изображены конусы роста. В частности, в ИЗ, субвентрикулярной зоне (SVZ) или присоединяющихся пучках аксонов (зеленый). Иллюстрация была создана с помощью веб-инструмента BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Плазмидные	Концентрация (мкг/мкл)	Целевое использование
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen	0.25	Маркировка мембранно-целевого белка (Lyn)
+	+
p-Tub-альфа-1-iCre	0.08
p-Tub-альфа-1-LifeAct-GFP	0.125	Маркировка филаментозного актина (F-актина) в колбочках роста
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen	1	Независимая маркировка двух популяций соседних нейронов
+	+
p-Tub-альфа-1-iCre	0.004
+	+
p-Tub-alpha-1-Dre	0.2

Таблица 1: Перечень плазмид, используемых в Протоколе. Название, концентрация и предполагаемое использование каждой используемой плазмиды.

Дополнительное видео 1: Визуализация in situ динамики конуса роста в острых оловоорганических срезах. Динамика роста конусов обозначена Lyn-mNeonGreen (вверху слева) и LifeAct-GFP (внизу слева). Соседние колбочки роста дифференциально помечены двойной плазмидной системой, содержащей tRFP (пурпурный; вверху справа) и ZsGreen (зеленый; внизу справа). Интервал визуализации, 2,5 с. Шкала, 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Как растущие конусы чувствуют и реагируют на окружающую их среду, чтобы координировать одновременное расширение аксона и руководство, все еще является предметом споров ^3,18. Новаторские исследования в области 2D-субстратов дали представление о фундаментальных молекулярных механизмах, генерирующих силы, которые управляют динамикой конуса роста во время формирования аксонов, роста и навигации 2,10,11,12,19. Совсем недавно исследования в 3D-матрицах показали, какое влияние третье измерение оказывает на поведение конуса роста и, следовательно, на рост аксона ^8,9. Тем не менее, сложные механизмы, инструктирующие динамику конуса роста in vivo, еще предстоит тщательно изучить.

Получение оловоорганических культур срезов из мозга IUE или EUE широко используется и хорошо документировано. Он стал золотым стандартом, позволяющим ученым получить представление о развитии и поведении нейронов в живой мозговой ткани^20,21. Действительно, этот метод был успешно использован в сочетании с различными методами визуализации с высоким разрешением для визуализации конкретных молекулярных процессов и морфологических событий in situ. Такие исследования включают, но не ограничиваются ими, образование и расширение аксонов^19,22, миграцию корковых нейронов 19,22,23,24, динамику центросом ^25,26, динамику микротрубочек²⁷, а также функциональную динамику пре- и постсинаптических компартментов^28,29.

Этот протокол устраняет пробел в экспериментальной нейробиологии, визуализируя динамику конуса роста развития корковых нейронов in situ, in ex vivo острых культур среза мозга и инструменты для анализа полученных данных.

Для создания этого протокола использовались культуры острых срезов мозга, потому что они (1) с некоторой практикой легко генерируются; (2) представлять доступную систему для изучения колбочек роста, встроенных в квази-полностью физиологическую среду, но достаточно прозрачную, чтобы обеспечить визуализацию живых клеток с высоким разрешением; (3) может быть расширен для его использования с помощью множества трансгенных линий мыши; (4) в сочетании с IUE или EUE обеспечивают практически неограниченный потенциал для предоставления молекулярных инструментов для оценки производительности ростовых конусов и аксонов in vivo при потере/усилении функциональных режимов, наряду с флуоресцентными репортерами и зондами цитоскелета.

Эта методология была описана в контексте как EUE, так и IUE. Несмотря на то, что EUE по-прежнему является высоконадежным методом, он привел к увеличению частоты срезов мозга, показывающих дезорганизованную сеть RG по сравнению с теми, которые были получены с помощью IUE в качестве метода доставки (рисунок 4C). Нарушения в массиве RG сильно влияют на миграцию нейронов и характер удлинения аксона^30,31. Это ключевые параметры, которые предсказывают, где найти аксоны для анализа в данный момент времени и тип среды, в которой они ориентируются. Срезы мозга со значительно нарушенной сетью RG обычно имеют нарушенную стратификацию корковых нейронов. Это, в свою очередь, производит аксоны с хаотичными траекториями. Поэтому настоятельно рекомендуется контролировать структурную целостность сети RG. Интересно, что плохая структурная целостность коррелирует с увеличением возраста эмбрионального мозга. Действительно, такие эффекты у молодых эмбрионов E12.5-E13.5 обычно не наблюдались¹⁹.

Настоящий протокол является тщательным и простым. Тем не менее, есть несколько критических шагов, где необходимо проявлять особую осторожность и внимание для получения оптимальных результатов. Они были четко отмечены в протоколе и включают (1) настройку количества ДНК, используемой в электропорации, для получения разреженной маркировки; (2) предотвращение повреждений во время извлечения мозга; (3) контроль температуры агарозы во время оболочки мозга; (4) устранение идеального процента агарозы для мозга данного возраста; и 5) отбор флуорофоров, опыт которых следует. Во время оптимизации протокола была проверена производительность нескольких флуорофоров в визуализации живых клеток in situ. Для этого протокола были выбраны мономерные варианты GFP EGFP и NeonGreen для получения плазмид, помеченных LifeAct и Lyn (рисунок 5A,B). Кроме того, был протестирован вариант RFP mScarlet, который был признан очень подходящим для этой установки (данные не показаны). Также были протестированы многомерные tRFP (димер) и ZsGreen (тетрамер) (рисунок 5C и дополнительное видео 1, справа). Эти быстро складывающиеся сверхяркие флуорофоры рекомендуются, когда метод требует быстрой генерации флуоресцентного сигнала после доставки ДНК.

Обычной практикой в использовании культур срезов является использование срезов из разных мозгов для тестирования контрольных и экспериментальных условий. Это представляет собой неотъемлемый источник нежелательной изменчивости. Здесь была использована система экспрессии, позволяющая независимо модифицировать соседние нейроны и экспрессию репортеров для идентификации. Обратите внимание, что в этой демонстрации (рисунок 5C) не было различий между нейронами, экспрессирующими любой из флуорофоров. Однако, например, такая плазмидная смесь в сочетании с трансгенной линией мыши, содержащей Cre-чувствительный ген, будет маркироваться нейронами tRFP (Dre-sensitive), которые остались диким типом. Напротив, ZsGreen (также Cre-чувствительный) будет маркировать рекомбинированные нейроны. Следовательно, ростовые колбочки двух разных генотипов и, вероятно, также фенотипов могут быть изучены бок о бок одновременно в одном и том же срезе мозга.

Локализация аксонов и конусов роста для анализа является важным соображением. Корковые нейроны поляризуются, радиально мигрируя из желудочковой зоны (VZ) к кортикальной пластине (CP). Во время этого процесса нейроны образуют ведущий процесс (будущий дендррит) и замыкающий процесс, который станет аксоном, в конечном итоге присоединяясь к новаторским аксонам в промежуточной зоне (IZ), создавая аксонные тракты³². Поэтому для захвата аксональных конусов роста проводилась визуализация аксональных волокон в ИЗ, включая аксоны, выходящие из CP, и рано сгенерированные аксоны, уже связанные с аксональными пучками; или, в конце концов, в волокнах, которые пересекают ИЗ и простираются под ним (рисунок 7).

Этот протокол позволяет выполнять визуализацию нейронов сверхвысокого разрешения в органотипических срезах. Исторически сложилось так, что рассеяние света было значительной проблемой, с которой сталкивались при визуализации толстых образцов. За последние два десятилетия обширные достижения в области оптических технологий сделали возможным получение изображений толстых образцов. Здесь цель на большом рабочем расстоянии использовалась для лучшей визуализации небольших структур, таких как конусы роста. Неизбежно, этот протокол не фиксирует более подробные события, такие как ретроградный поток актина или динамика микротрубочек. Объектив большого рабочего расстояния, который требует более низкой числовой апертуры (NA), сохраняет информацию из толстых срезов. Однако этот протокол также можно было адаптировать для использования с целью сокращения рабочего расстояния. Для этого требовалась плавная переноска ломтиков в блюдо со стеклянным дном для сохранения структурной целостности. Однако использование этого метода привело к более короткой выживаемости - ~ 15 ч - из-за потери газообмена (данные не показаны). В отличие от 2D-культур, ростовые конусы в 3D занимают больший объем и требуют компенсации движения-артефакта по оси Z. Чтобы повысить способность к детальному изображению событий, необходимо использовать современные конфокальные технологии. Поэтому рекомендуется использовать быстро сканирующий z-стековый двигатель, такой как z-Galvo, доступный на высокочувствительных конфокальных микроскопах³³.

Следует отметить, что этот протокол представляет собой три основных ограничения. Во-первых, часто бывает сложно контролировать уровни экспрессии / количество экспрессирующих клеток любой данной плазмиды in vivo. Это приводит к изменчивости между всеми срезами даже при поддержании одинаковой концентрации плазмид. Поэтому выбор регуляторных элементов в используемых векторах выражений должен быть предопределен с осторожностью. Во-вторых, визуализация подробных событий с помощью мембранных вставок в настоящее время невозможна. Это второе ограничение может быть преодолено с помощью методологических обновлений, предложенных в предыдущем пункте. Наконец, ростовые конусы очень светочувствительны и могут быстро стать фотоотбеленными. Поэтому частая визуализация колбочек роста в течение всего 5 минут с помощью лазерных сканирующих микроскопов часто может разрушить колбочки роста. В связи с этим новые достижения в устройствах, генерируемых световой микроскопией, могут быть адаптированы для долгосрочной визуализации срезов мозга³⁴.

Подобные протоколы предназначены для открытия новых исследовательских направлений, позволяя лучше понять, что требуется для того, чтобы конус роста считывал и реагировал на сложную среду in vivo , и, что более важно, разгадывал механику этого сложного взаимодействия.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202	Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin antibody	sigma-Aldrich	V2258-.2ML	Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Betadine	B. Braun	3864154
Biozym Sieve GP Agarose	Biozyme	850080
Braunol, Sprühflasche	B. Braun	3864073
Buprenorphine (Temgesic)	GEHE Pharma	345928
DAPI	sigma-Aldrich	D9542
DMZ unevirsal electrode puller	Zeitz	NA
Electric razor	Andes	NA	ProClip UltraEdge Super 2-Speed model
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer	3543238	2,5% (wt/vol)
Eppendorf microloader pipette tips	FischerScientific	10289651
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	Dye content ≥ 85 %
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10500064
Fiji 2.1.0	NIH	NA	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09	ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD5040-100
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	sigma-Aldrich	F4680-25ML
Glucose	MedPex	3705391	5%
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
HBSS	Life Technologies	14025092	calcium, magnesium, no phenol red
Horse serum	Pan-Biotech	P30-0711
Imaris 9.7.2	Bitplane	NA	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
Isoflurane	Virbac	NA
Isotonic saline solution	B. Braun	8609261	0.90%
Leica VT1200 S vibratome	Leica	14048142066
LSM 880 with Airyscan	Zeiss	NA
Metacam	Venusberg Apotheke	8890217	5 mg/ml
Mice	Janvier Labs	NA	C57BL/6JRj
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	11018-12
Micropipette Storage Jar	World Precision Instruments	E210	16.16.27
Microsoft Excel	Microsoft	NA	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture Insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm
Moria Perforated Spoons	Fine Science Tools	10370-18
Moria Spoon	Fine Science Tools	10321-08
Neurobasal Medium, minus phenol red	ThermoFisher Scientific	12348017
Neuropan-2 supplement	Pan-Biotech	P07-11010
Normal goat serum	Abcam	ab138478
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
p-Tub-alpha-1-Dre	Addgene	133925
p-Tub-alpha-1-iCre	Addgene	133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP	Addgene	175437
Parafilm	VWR	52858-000
Paraformaldehyde	sigma-Aldrich	P6148
PBS	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen	Addgene	175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen	Addgene	175257
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
PicoNozzle Kit v2	World Precision Instruments	5430-ALL
Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0487	1 mm / 3 mm
QIAGEN Maxi kit	QIAGEN	12162
Reflex wound closure Clip	World Precision Instruments	500344-10	7 mm
Sekundenkleber Pattex Mini Trio	Lyreco	4722659
Square wave electroporation system ECM830	Harvard Apparatus	W3 45-0052
Sterile gauze	Braun Askina	9031216
Sterile lubricant eye ointment	Bayer Vital	PZN1578675
Sterile surgical gloves	Sempermed	14C0451
Sucrose	Roth	4621.2
Supramid 5-0 surgical silk sutures	B. Braun	NA
Thin-wall glass capillaries	World Precision Instruments	TW100-4
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	Ibidi	80827