Генерация ортотопического ксенотрансплантата раковых клеток поджелудочной железы с помощью ультразвуковой инъекции

Резюме

Представлен протокол генерации минимально инвазивной ортотопической модели рака поджелудочной железы путем ультразвуковой инъекции раковых клеток поджелудочной железы человека и последующего мониторинга роста опухоли in vivo с помощью ультразвуковой визуализации.

Аннотация

Рак поджелудочной железы (PCa) представляет собой один из самых смертоносных типов рака во всем мире. Причины злокачественности PCa в основном зависят от ее внутреннего злокачественного поведения и высокой устойчивости к терапевтическому лечению. Действительно, несмотря на многие усилия, как стандартная химиотерапия, так и инновационные целевые методы лечения существенно потерпели неудачу при переходе от доклинической оценки к клиническим условиям. В этом сценарии разработка доклинических мышиных моделей, лучше имитирующих in vivo характеристики PCa, срочно необходима для тестирования недавно разработанных препаратов. Настоящий протокол описывает способ генерации мышиной модели PCa, представленной ортотопическим ксенотрансплантатом, полученным путем ультразвуковой инъекции опухолевых клеток поджелудочной железы человека. Используя такой надежный и минимально инвазивный протокол, мы также предоставляем доказательства приживления in vivo и развития опухолевых масс, которые можно контролировать с помощью ультразвуковой (УЗИ) визуализации. Примечательным аспектом модели PCa, описанной здесь, является медленное развитие опухолевых масс с течением времени, что позволяет точно определить отправную точку для фармакологического лечения и лучше контролировать эффекты терапевтических вмешательств. Кроме того, описанная здесь методика является примером реализации принципов 3R, поскольку она минимизирует боль и страдания и непосредственно улучшает благополучие животных в исследованиях.

Введение

PCa и его наиболее распространенная форма, аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC), является одной из наиболее распространенных причин смерти, связанной с раком, с 1-летней выживаемостью ниже 20% и 5-летней выживаемостью 8%, независимо от стадии ^1,2. Заболевание почти всегда приводит к летальному исходу, и прогнозируется, что его заболеваемость будет непрерывно расти в ближайшие годы, в отличие от других видов рака, заболеваемость которым снижается^{на 3}. Такие факторы, как позднее выявление рака, тенденция быстрого прогрессирования и отсутствие специфических методов лечения, приводят к плохому прогнозу PCa⁴. Большие успехи в исследованиях рака были получены благодаря разработке более точных доклинических моделей мышей. Модели обеспечили соответствующее понимание понимания молекулярного механизма, лежащего в основе рака, и разработки новых методов лечения⁵. Эти достижения плохо применимы к PCa, который, несмотря на большие усилия в последнее время, остается устойчивым к современным химиотерапевтическим методам лечения¹. По этим причинам разработка новых подходов к улучшению перспектив пациентов является обязательной.

На протяжении многих лет было разработано много моделей мышей PCa, в том числе ксенотрансплантаты, которые являются наиболее широко используемыми моделями в настоящее время⁵. Модели ксенотрансплантатов классифицируются как подкожные гетеротопные и ортотопные, в зависимости от расположения имплантированных опухолевых клеток. Подкожные гетеротопные ксенотрансплантаты легче и дешевле выполнять, но упускают некоторые характерные особенности PCa (т.е. своеобразное опухолевое микроокружение, характеризующееся накоплением фиброзной ткани, гипоксией, кислотностью и ангиогенезом)^6,7. Это объясняет, почему подкожные ксенотрансплантаты часто не могут предоставить надежные данные для терапевтического лечения, что приводит к сбоям при переводе в клинические условия⁸. С другой стороны, ортотопические ксенотрансплантаты больше напоминают микроокружение опухоли, что приводит к лучшему имитированию естественного развития заболевания. Кроме того, ортотопические ксенотрансплантаты больше подходят для изучения метастатического процесса и инвазивных особенностей ПКа, которые почти не встречаются в подкожных моделях⁹. В целом, ортотопические ксенотрансплантатные мышиные модели в настоящее время предпочтительны для выполнения доклинического тестирования лекарств ^9,10. Ортотопические ксенотрансплантаты обычно полагаются на хирургические процедуры для имплантации либо клеток, либо очень маленьких кусочков опухолевой ткани в поджелудочную железу. Действительно, несколько статей, основанных на хирургических моделях PCa, были опубликованы за последние несколько десятилетий¹¹. Однако качество и результат хирургической процедуры по установлению ортотопической модели опухоли сильно зависят от технического мастерства оператора. Другим ключевым моментом для успешного ортотопического ксенотрансплантата PCa для трансляционного клинического подхода является возможность установления локализованного заболевания с предсказуемой кинетикой роста.

Чтобы решить эти проблемы, здесь мы описываем инновационную процедуру получения ортотопического ксенотрансплантата PCa, использующего ультразвуковую (УЗИ) инъекцию клеток PCa человека в хвост поджелудочной железы у иммунодефицитных мышей. Эта процедура создает надежную модель мыши PCa. Рост опухоли отслеживается in vivo с помощью УЗИ-визуализации.

протокол

Настоящий протокол получил одобрение Министерства здравоохранения Италии с номером авторизации 843/2020-PR. Чтобы обеспечить асептические условия, животные содержались внутри барьерной комнаты вивария исследуемых животных (Ce.S.A.L.) Флорентийского университета. Все процедуры проводились в том же помещении, где мышей размещали на объекте LIGeMA Флорентийского университета (Италия).

1. Клеточная подготовка

1. Культивируйте клетки PCa из клеточной линии PCa в 100-миллиметровой чашке Петри, содержащей модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), дополненную 2% L-глутамином и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
2. Инкубируют клетки в нормоксии при 37 °C с 5% CO₂.
3. Отделите клетки трипсином. Подсчитайте и повторно суспендируйте 1 х 10⁶ клеток в 20 мкл PBS за 1 ч до инокуляции.

2. Подготовка мыши к ультразвуковой инъекции (US-GI)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы были выполнены в стерильных условиях. Вся процедура инъекции под руководством УЗИ, от начала анестезии до удаления мыши с платформы животного, занимает около 10-12 мин плюс 5 мин для полного выздоровления мыши.

1. Непосредственно перед вмешательством вводят карпрофен (НПВП) подкожно (s.c.) в конечной дозе 5 мг/кг или трамадол в конечной дозе 5 мг/кг с использованием туберкулинового шприца с иглой 27 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего протокола было использовано 20 атипичных мышей Nude-Foxn^1nu . Мышам было 8 недель и они весили 20-22 г.
2. Включите тепловизор и выберите Мышь (Маленькая) Брюшная в меню приложения на панели преобразователя. Убедитесь, что отображается окно изображения B-Mode (Режим яркости), и система готова к получению данных B-Mode.
   ПРИМЕЧАНИЕ: B-Mode - это режим создания образов системы по умолчанию. Система отображает эхо в двумерном (2D) представлении, назначая уровень яркости на основе амплитуды эхо-сигнала. B-Mode является наиболее эффективным режимом для обнаружения анатомических структур.
   1. Перейдите в учебный браузер.
   2. Выберите Новое исследование и введите название и информацию об исследовании, т.е. дату исследования и т.д.
   3. Заполните всю необходимую информацию в названии серии, т.е. штамм животного, удостоверение личности, дату рождения и т.д.
   4. Нажмите Готово; программа готова к созданию образов в B-режиме.
3. Обезболивают мышь в индукционной камере анестезии с использованием 4% изофлурана с расходом газа 2 л/мин O₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 4 минуты достаточно для правильной анестезии (дыхание около 50-60 вдохов в минуту).
4. Как только мышь будет обезболена, измените соединение анестезиологической машины, чтобы направить изофлуран к столу обработки мыши.
5. Поместите обезболенную мышь на правый бок на стол для обработки (нагретый при 37 °C) мордой в носовом конусе, чтобы мышь была обезболена с использованием 2% изофлурана с расходом газа 0,8 л /мин O₂ (рисунок 1A).
6. Нанесите каплю искусственных слез на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
7. Плотно приклейте правую руку, правую ногу и хвост к электродным подушечкам на платформе животного клейкой марлей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания мыши и электрокардиограмма (ЭКГ) регистрируются через электродные прокладки.

3. Инъекция клеток PANC1 в поджелудочную железу методом US-GI

1. Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом и держите кожу левого бока растянутой с помощью клеевой марли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение растяжения кожи важно для снижения сопротивления введению иглы и предотвращения деформаций иглы.
2. Нанесите ультразвуковой гель на живот и левый бок мыши с помощью шприца 20 мл (без иглы).
3. Используя ручку управления высотой американского преобразователя, опустите датчик, чтобы коснуться левого фланга мыши и поместите его поперечно к телу животного.
4. Переместите датчик для визуализации поджелудочной железы на дисплее преобразователя с помощью визуализации B-Mode (рисунок 1B).
5. Подготовьте шприц Гамильтона объемом 50 мкл, содержащий 1 х 10⁶ клеток PANC1, взвешенных в 20 мкл PBS, с иглой 30 мм 28 G и поместите шприц на соответствующий держатель (рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием продезинфицируйте иглу шприца с 70% этанолом в течение 5-10 минут.
6. Используя держатель микроманипулятора, опустите шприц к коже мыши, сконуком иглы лицевой стороной вверх и в той же плоскости, что и ультразвуковой преобразователь, образуя угол 45° с датчиком (рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, продолжайте следить за изображением США на дисплее.
7. Используя микроманипулятор, перфорируйте кожу и вставьте иглу шприца в поджелудочную железу и наблюдайте за изображением США на дисплее, чтобы проследить его траекторию (рисунок 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией возьмите хвост поджелудочной железы в качестве эталона, который расположен за селезенкой и близко к левой почке.
8. После того, как игла введена в поджелудочную железу, введите болюс 20 мкл, содержащий клетки, непосредственно в поджелудочную железу, оказывая постоянное давление на плунжер шприца (рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная процедура инъекции проверяется наличием небольшого пузырька в поджелудочной железе и потоком гипоэхогенной жидкости, которая едва видна с кончика иглы.
9. Оставьте иглу на месте на 5-10 с после введения всего болюса, а затем медленно втягивайте ее.
10. Извлеките американский датчик, очистите гель с бока и поместите мышь в одну в новую клетку. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.

4.3D визуализация США для мониторинга опухолей поджелудочной железы у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка развития опухоли проводилась начиная с 8 дней после инъекции клетки, с использованием того же инструмента, который использовался для инъекции под руководством УЗИ (указан в Таблице материалов). Следовательно, некоторые процедуры, такие как системное зажигание (этап 2.2.), анестезия (этапы 2.3. - 2.6.) и размещение мыши на платформе животного (этап 2.7.), полностью соответствуют тому, что было описано выше в протоколе.

1. Перед запуском визуализации США настройте рабочую станцию, как показано на рисунке 2A.
2. Закрепите преобразователь на системе 3D-двигателя (рисунок 2A).
3. Включите тепловизор и выберите Новое исследование в учебном браузере.
4. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии (4% изофлурана).
5. Поместите обезболенную мышь на правый бок на стол для обработки, нагретый при 37 °C мордой в анестезирующую трубку, и уменьшите изофлуран до 2% (рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы мышь была помещена в то же положение, что и инъекция под руководством США, чтобы поддерживать те же анатомические ссылки.
6. Нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши.
7. Нанесите слой ультразвукового геля на живот мыши и левый бок.
8. Расположите датчик 55 МГц в поперечной ориентации, чтобы коснуться кожи левого фланга таким образом, чтобы поджелудочная железа была приблизительно центрирована (рисунок 2C).
9. Используйте 3D-двигатель для получения изображений всей поджелудочной железы в поперечной ориентации, в идеале собирая 90-100 кадров за одно приобретение (количество кадров может варьироваться в зависимости от личного выбора).
   1. Выберите положение 3D-двигателя на сенсорной панели тепловизора.
   2. Укажите расстояние сканирования, переместив курсор для получения изображений всей поджелудочной железы с обеих конечностей.
   3. Выберите Сканировать кадры и начните 3D-сбор.
10. После того, как 3D-визуализация сделана, извлеките датчик, очистите гель с кожи и поместите мышь в одну в новую клетку для восстановления. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.

Результаты

Следуя протоколу, описанному выше, мышей сначала анестезировали в изофлурановой камере и помещали на платформу животных (рисунок 1А). Поджелудочную железу визуализировали с помощью ультразвуковой визуализации (рисунок 1B). Шприц Гамильтона объемом 50 мкл ...

Обсуждение

Хотя использование визуализации США широко распространено в клинике, развитие опухоли во многих доклинических моделях мышей обычно описывается с использованием биолюминесцентной визуализации¹¹. Последний является косвенным способом оценки приживления и расширения опу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157