JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает динамику вирусных инфекций с использованием люциферазы и флуоресцентно-экспрессирующих рекомбинантных (r)SARS-CoV-2 и систем визуализации in vivo (IVIS) у трансгенных мышей K18 hACE2 для преодоления необходимости вторичных подходов, необходимых для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo.

Аннотация

Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) была вызвана тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2). На сегодняшний день SARS-CoV-2 является причиной более 242 миллионов инфекций и более 4,9 миллиона смертей во всем мире. Подобно другим вирусам, изучение SARS-CoV-2 требует использования экспериментальных методов для обнаружения присутствия вируса в инфицированных клетках и/или на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюцифераза, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки. Эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2 позволяют отслеживать вирусные инфекции in vitro и in vivo на основе экспрессии генов-репортеров Nluc и Venus. Здесь исследование описывает использование rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus для обнаружения и отслеживания инфекции SARS-CoV-2 в ранее описанной K18 человеческой ангиотензинпревращающей ферменте 2 (hACE2) трансгенной мышиной модели инфекции с использованием систем визуализации in vivo (IVIS). Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus демонстрируют rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность и репликацию вируса in vivo. Важно отметить, что экспрессия Nluc и Venus позволяет нам напрямую отслеживать вирусные инфекции in vivo и ex vivo у инфицированных мышей. Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus представляют собой отличный вариант для изучения биологии SARS-CoV-2 in vivo, понимания вирусной инфекции и связанного с ней заболевания COVID-19 и определения эффективных профилактических и/или терапевтических методов лечения для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2.

Введение

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae 1. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус1. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц2. На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять бета-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома [MERS-CoV] и SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными, вызывая тяжелую инфекцию нижних дыхательных путей7. До появления SARS-CoV-2 было две эпидемические вспышки, вызванные CoVs: SARS-CoV в Провинции Гуандун, Китай, с 2002 по 2003 год, с коэффициентом летальности (CFR) около 9,7%; и БВРС-КоВ на Ближнем Востоке с 2012 г. по настоящее время, при этом CFR составляет около 34%7,8. SARS-CoV-2 имеет общий CFR между 3,4% -49%, при этом базовые условия способствуют более высокому CFR 8,9. С момента своего открытия в декабре 2019 года в Ухане, Китай, SARS-CoV-2 был ответственен за более чем 242 миллиона случаев инфицирования людей и более 4,9 миллиона человеческих смертей во всем мире 7,10,11,12. Примечательно, что с конца 2020 года новые вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 (VoC) и интересующие их варианты (VoI) повлияли на характеристики вируса, включая передачу и антигенность 9,13, а также на общее направление пандемии COVID-19. Для лечения инфекций SARS-CoV-2 в настоящее время существует только один Соединенные Штаты (США). Терапевтический противовирусный препарат Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (ремдесивир) и один препарат с разрешением на экстренное использование (EUA) (барицитиниб, вводимый в комбинации с ремдесивиром)14. Существует также 6 одобренных моноклональных антител EUA: REGEN-COV (казиривимаб и имдевимаб, вводимые вместе), сотровимаб, тоцилизумаб, бамланивимаб и этесевимаб, вводимые вместе 15,16,17,18,19. В настоящее время существует только одна одобренная FDA профилактическая вакцина, Pfizer-BioNTech, и две другие профилактические вакцины (Moderna и Janssen) были одобрены EUA 20,21,22,23,24. Однако при неконтролируемом уровне инфицирования и появлении VoC и VoI SARS-CoV-2 по-прежнему представляет угрозу для здоровья человека. Поэтому срочно необходимы новые подходы для выявления эффективных профилактических и терапевтических средств для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 и все еще продолжающейся пандемией COVID-19.

Изучение SARS-CoV-2 требует трудоемких методов и вторичных подходов для выявления присутствия вируса в инфицированных клетках и / или проверенных животных моделях инфекции. Использование обратной генетики позволило генерации рекомбинантных вирусов ответить на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Например, методы обратной генетики предоставили средства для выявления и понимания механизмов вирусной инфекции, патогенеза и болезни. Аналогичным образом, подходы обратной генетики проложили путь к разработке рекомбинантных вирусов, лишенных вирусных белков, чтобы понять их вклад в вирусный патогенез. Кроме того, методы обратной генетики были использованы для генерации рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены для применения in vitro и in vivo, включая выявление профилактических и/или терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций. Флуоресцентные и биолюминесцентные белки являются наиболее часто используемыми репортерными генами из-за их чувствительности, стабильности и легкости обнаружения на основе совершенствования новых технологий25,26. Было показано, что флуоресцентные белки in vitro служат лучшим вариантом локализации вирусов в инфицированных клетках, в то время как люциферазы более удобны для количественных исследований 27,28,29. In vivo люциферазы предпочтительнее флуоресцентных белков для визуализации целых животных, в то время как флуоресцентные белки предпочтительны для идентификации инфицированных клеток или визуализации ex vivo 30,31,32. Использование репортер-экспрессирующих рекомбинантных вирусов послужило мощным инструментом для изучения вирусов во многих семействах, включая, среди прочего, флавивирусы, энтеровирусы, альфавирусы, лентивирусы, аренавирусы и вирусы гриппа 28,33,34,35,36.

Чтобы преодолеть потребность во вторичных подходах к изучению SARS-CoV-2 и охарактеризовать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo в реальном времени, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюциферазы, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки, используя нашу ранее описанную обратную генетику на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC), которые поддерживаются как единая копия в E. colili с целью минимизации токсичности последовательностей вируса при его размножении в бактериях37,38. Примечательно, что rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus показали rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность in vivo. Высокий уровень экспрессии Венеры от rSARS-CoV-2/Venus позволил обнаружить вирусную инфекцию в легких инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью системы визуализации in vivo (IVIS)39. Уровни экспрессии Венеры хорошо коррелировали с вирусными титрами, обнаруженными в легких, демонстрируя возможность использования экспрессии Венеры в качестве действительного суррогата инфекции SARS-CoV-2. Используя rSARS-CoV-2/Nluc, мы смогли отслеживать динамику вирусной инфекции в режиме реального времени и продольно оценивать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo, используя тот же подход IVIS у трансгенных мышей K18 hACE2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протоколы с участием трансгенных мышей K18 hACE2 были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) Техасского биомедицинского научно-исследовательского института (TBRI) и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все эксперименты проводятся в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом40. При работе с мышами требуется соответствующее средство индивидуальной защиты (СИЗ).

1. Использование трансгенных мышей K18 hACE2

  1. Покупка и содержание 4-6-недельных самок мышей B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (трансгенные мыши K18 hACE2) в учреждении по уходу за животными уровня биобезопасности (BSL)-2 в определенных условиях, свободных от патогенов.
    1. После прибытия на объекты BSL2 позвольте животным акклиматизироваться в течение 7 дней и перенесите их в учреждение для животных BSL-3 для инфекций и других экспериментальных процедур.
    2. Следуя протоколам IACUC, поместите по 4 мышей в клетку. Чтобы убедиться, что животное умерло, после заражения мышей rSARS-CoV-2 и визуализации in vivo усыпляют животных смертельной дозой Fatal-Plus (>100 мг/кг).

2. Биобезопасность

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой рукописи rSARS-CoV-2 генерируется с использованием обратных генетических систем на основе BAC для штамма SARS-CoV-2 США-WA1/2020, как описано ранее37. Все процедуры in vivo , связанные с инфекциями rSARS-CoV-2/Nluc или rSARS-CoV-2/Venus, должны выполняться в кабинете биологической безопасности в условиях BSL-3.

  1. Очистите шкаф биобезопасности 2% вексицидом и 70% этанолом дезинфицирующим средством последовательно до и после выполнения всех экспериментальных процедур, описанных в этой статье.
  2. Стерилизуйте весь материал для рассечения (ножницы, рассекающие щипцы и т.д.) и гомогенизатор до и после каждого использования.
  3. Очистите изоляционную камеру и продезинфицируйте таблетки MB10 до и после каждого использования в соответствии с инструкцией производителя.
  4. Выбросьте весь биологический материал, полученный во время процедур в соответствии с руководящими принципами IBC и IACUC.

3. Характеристика in vivo rSARS-CoV-2

  1. Мышиные инфекции
    1. Поместите самок 4-6-недельных трансгенных мышей K18 hACE2 в меченые клетки, идентифицируйте мышей в каждой клетке с помощью кода удара по уху и поместите 4 мышей на клетку. Используйте группу мышей для массы тела и выживания и другую группу животных для титрования и визуализации вируса.
    2. Перед заражением брейте грудь мышей на вентральной стороне от грудного соска до паховой области соска, чтобы облегчить сигнал биолюминесценции.
    3. Приготовьте инокулятор rSARS-CoV-2 с 105 бляшеобразующими единицами (PFU)/мышью в стерильных условиях в общем объеме 50 мкл с использованием стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте количество rSARS-CoV-2, которое будет использоваться в вирусном разведении с формулой: вирус необходим = (105 PFU на мышь / 50 мкл) x конечный объем) / запас вирусного титра.
    4. Держите вирусный инокулят охлажденным на льду.
    5. Используйте в качестве средств внутреннего контроля фиктивно зараженных (1x PBS) и rSARS-CoV-2/WT-инфицированных мышей. Поместите мышей, инфицированных макетом, в отдельную клетку, чем мышей, инфицированных rSARS-CoV-2.
    6. Обезболивают мышей, используя 5% газообразную седацию изофлурана в анестезиологической камере и поддерживают 3% изофлурана.
    7. Как только постуральная реакция и корректирующий рефлекс будут подтверждены, поместите мышь в положение спинного лежа.
    8. Зажмите шею мыши между указательным и большим пальцами и прижмите хвост к ладони мизинцем, чтобы удержать животное в спинном положении.
    9. Поместите наконечник пипетки, содержащий 50 мкл инокулята вируса, в ноздрю и медленно выталкивайте раствор. Убедитесь, что инокулятив вируса вдыхается и нет рефлюкса, наблюдая, как исчезает капля инокулята.
  2. Мониторинг биолюминесценции K18 hACE2 трансгенных мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 1 и Рисунок 2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент следует схематическому представлению и использует вирусы, показанные на рисунке 1. Прикрепление изофлурановой анестезии требуется для системы визуализации in vivo (IVIS). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о необходимых инструментах и системах.
    1. Запустите программное обеспечение для обработки изображений и настройте параметры, щелкните режим изображения в режиме Биолюминесценция, откройте фильтр и установите время экспозиции на автоматическое.
    2. После инициализации машины IVIS поместите мышей в изоляционную камеру, все еще находясь внутри шкафа биобезопасности. Индуцировать мышей изофлураном в концентрации 5%. Как только потеря постуральной реакции и корректирующего рефлекса подтверждена, поддерживают с 3% изофлураном.
    3. Как только мыши будут обезболены, удалите их из изоляционной камеры и ретроорбитально введите субстрат люциферазы, разбавленный 1:10 в 1x PBS (конечный объем 100 мкл / мышь) с помощью иглы 25 G.
    4. После введения субстрата люциферазы поместите мышей обратно в изоляционную камеру с их грудью вверх и носовой полостью внутри коллекторного конуса, чтобы животное было обезболено во время процедуры визуализации.
    5. Перенесите изоляционную камеру на машину IVIS и сразу после закрытия дверцы тепловизора IVIS выберите Acquire в программном обеспечении для инициализации (рисунок 2A).
    6. Для анализа полученных изображений биолюминесценции используйте инструмент ROI (область интереса) в программном обеспечении для обозначения точного сигнала и измерения потока (рисунок 2B).
    7. Нажмите « Измерить» и позвольте системе начать оценку биолюминесценции в фотонах, чтобы обеспечить абсолютное излучение фотонов, сопоставимое с выходными измерениями, предоставляемыми различными параметрами.
    8. Изображение мышей через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения.
    9. После визуализации поместите мышей обратно в клетку.
  3. Флуоресцентный анализ у трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Venus (Рисунок 3 и Рисунок 4)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент следует схематическому представлению и rSARS-CoV-2, показанному на рисунке 3. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о необходимых инструментах и системах.
    1. Запустите программное обеспечение для обработки изображений и настройте параметры, установите фильтры возбуждения (500 нм) и излучения (530 нм), щелкните режим изображения на Флуоресценция и установите время экспозиции на автоматическое.
    2. Внутрибрюшинно усыпляют мышей, используя смертельную дозу Fatal-Plus (>100 мг/кг). После эвтаназии дезинфицируйте место разреза 70% этанолом.
    3. С помощью пинцета потяните кожу, сделайте разрез от грудины к животу и ножницами срежьте разрез с боков. Отрежьте печеночную вену, чтобы свести к минимуму количество крови в легких и избежать высоких фоновых сигналов во время визуализации.
    4. Ножницами срежьте грудину и откройте грудную клетку. Далее ножницами срезают конец трахеи и удаляют легкие пинцетом.
    5. Поместите иссеченные легкие в 6-луночную пластину, содержащую 2 мл 1x PBS, и промойте, чтобы удалить избыток крови. Свести к минимуму возможность загрязнения между образцами путем дезинфекции и очистки хирургических инструментов между образцами с использованием 70% этанола.
    6. После инициализации аппарата IVIS поместите легкие в черный лоток и отделите ткани друг от друга.
    7. Поместите лоток внутрь изоляционной камеры внутри шкафа биобезопасности, а затем перенесите изоляционную камеру в IVIS. Закройте дверь и нажмите « Получить », чтобы запустить систему визуализации (рисунок 4A).
    8. Чтобы проанализировать флуоресценцию, используйте инструмент ROI и нарисуйте ROI вокруг каждого из отдельных легких. Измерьте каждую рентабельность инвестиций вручную, а затем используйте средние значения эффективности излучения и вычтите их из значений мышей, инфицированных макетом (рисунок 4B).
    9. Как только визуализация будет завершена, поместите ткани на лед для анализа в тот же день или в криотрубу для замораживания сухого льда, чтобы хранить при -80 ° C для последующей обработки.
  4. Визуализация яркого поля легких и оценка патологии трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 2A-C) и rSARS-CoV-2/Venus (Рисунок 4A-C)
    1. После визуализации биолюминесценции мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT и зараженных макетом, возвращают мышей в клетки. Продолжайте эвтаназию и визуализацию ex vivo ярким полем легких мышей (рисунок 2A).
    2. После визуализации флуоресценции ex vivo легких инфицированных мышей, сделайте снимки легких с ярким полем (рисунок 4A).
    3. Проанализируйте грубые поражения на поверхности легкого с помощью ImageJ (рисунки 2C и 4C).
    4. Откройте изображение легких для анализа в ImageJ.
    5. Рассчитайте отношение пикселя к см, используйте инструмент «Прямая » и измерьте фактическую длину изображения.
    6. После выбора нажмите «Анализировать > меру», чтобы рассчитать длину пикселей для длины.
    7. Щелкните Анализ > Установить масштаб и введите числа, рассчитанные из предыдущего шага.
    8. Используйте инструмент «Выделение от руки» и выделите всю поверхность легких. Нажмите « Проанализировать > измерить, чтобы измерить общую площадь легких.
    9. Нажмите «Редактировать > выделение» > «Сделать обратным», чтобы выбрать остальную часть области легких, затем нажмите «Delete» или «Backspace», чтобы удалить фон.
    10. Удалите выбранную область, затем нажмите «Изображение > «Настроить порог цвета >».
    11. Чтобы выбрать область патологического поражения, отрегулируйте яркость до минимума (от 1 до 50) и максимума (от 50 до 200), в зависимости от уровня застойных явлений и кровоизлияний.
    12. После того, как патологические поражения выбраны, нажмите « Выбрать» в нижней части цветовой панели порога, затем нажмите « Анализировать > меру», чтобы измерить патологические области.
    13. Рассчитайте процент грубых поражений по формуле: % от патологической площади = (измерение патологической площади/общей поверхности легких) x 100.
  5. Титрование вирусов (рисунок 2D и рисунок 4D)
    1. После визуализации завершите эвтаназию мышей и соберите легкие, мозг и слизистую оболочку носа.
    2. Поместите легкие, мозг и слизистую оболочку носа в отдельные гомогенизаторы стерильной ткани и добавьте 1 мл холодного 1x PBS.
    3. Гомогенизируйте образцы путем центрифугирования при 21 500 х г в течение 10 мин до обломков гранулированных клеток. Соберите и переложите супернатанты в новую стерильную трубку и выбросьте гранулу.
    4. Если титрование вируса проводится в тот же день, храните супернатанты при 4 °C. Альтернативно, заморозить супернатант гомогенизированных образцов при -80°C до последующей оценки.
    5. Используя супернатанты, полученные из тканевых гомогенатов, производят 10-кратное последовательное разведение и заражают сливающиеся монослои клеток Vero E6 1 мл каждого разведения супернатанта (6-луночный пластинчатый формат, 1,2 × 106 клеток/лунка, трипликаты).
    6. Дайте вирусу адсорбироваться в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном 5% CO2 инкубаторе.
    7. После вирусной адсорбции промыть клетки 1 мл 1x PBS и инкубировать в 2 мл постинфекционных сред, содержащих 1% агара, в увлажненном 5% CO2 инкубаторе при 37 °C в течение 72 ч.
    8. После инкубации инактивируйте пластины в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 ч при 4 °C, убедитесь, что вся пластина погружена.
    9. Выньте пластины из BSL3 и промыть клетки три раза 1 мл 1x PBS и пропитайте 1 мл 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
    10. Блокируют клетки 1 мл 2,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS в течение 1 ч при 37 °C с последующей инкубацией в 1 мл 1 мкг/мл белка SARS-CoV с перекрестно-реактивным моноклональным антителом (1C7C7), разведенным в 2,5% BSA в течение 1 ч при 37 °C.
    11. Промыть клетки три раза 1 мл 1x PBS и разработать бляшки с использованием набора ABC и набора СУБСТРАТА DAB Peroxidase в соответствии с инструкциями производителей.
    12. Рассчитайте вирусные титры как PFU/mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитать по формуле PFU/mL = коэффициент разбавления x количество бляшек x (объем 1 мл/инокулят).
  6. Активность Nluc в тканях трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 2E)
    1. Количественно оценить присутствие Nluc в гомогенатах органов у имитационных, rSARS-CoV-2/WT и rSARS-CoV-2/Nluc инфицированных K18 hACE2 трансгенных мышей с использованием анализа люциферазы в соответствии с инструкциями производителей.
  7. Оценка заболеваемости и смертности (рисунок 2F, G и рисунок 4E, F)
    1. Интраназально инфицировать 4-6-недельную самку трансгенных мышей K18 hACE2 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc или имитированно инфицированных, как описано в разделе 3.1.
    2. Контролируйте и взвешивайте мышей в течение 12 дней одновременно, чтобы свести к минимуму изменение веса из-за приема пищи. Усыплите мышей, которые теряют 25% своей первоначальной массы тела с тех пор, как они достигли гуманной конечной точки, и отметьте этих мышей как поддающихся вирусной инфекции.
    3. Через 12 дней усыпляют мышей, переживших вирусную инфекцию, и рассчитывают % изменения массы тела и выживаемости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Инфекция rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 1 и 2)
На рисунке 1А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций in vivo. На рисунке 1B показана схематиче?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол демонстрирует возможность использования этих rSARS-CoV-2 экспрессирующих репортерных генов для мониторинга вирусных инфекций in vivo. Оба репортер-экспрессирующих рекомбинантных вируса являются отличным инструментом для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo. Описанные систе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии какого-либо коммерческого, финансового и нефинансового или личного конфликта интересов в отношении описываемой работы.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов нашего института (Техасского института биомедицинских исследований) за их усилия по поддержанию наших объектов в полной рабочем состоянии и безопасности во время пандемии COVID-19. Мы также хотели бы поблагодарить наш Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) и Spell (IACUC) за обзор наших протоколов эффективным по времени образом. Мы благодарим доктора Томаса Морана из Медицинской школы Айкана на горе Синай за предоставление моноклонального антитела к протоклональному белку нуклеокапсида (N) sarS-CoV с перекрестным реактивным 1C7C7 (N). Исследования SARS-CoV-2 в лаборатории Мартинеса-Собридо в настоящее время поддерживаются грантами NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 и R43AI165089-01; Министерство обороны (DoD) предоставляет гранты W81XWH2110095 и W81XWH2110103; Партнерство Сан-Антонио по прецизионной терапии; Форум Техасского института биомедицинских исследований; Научный центр здравоохранения Техасского университета в Сан-Антонио; Медицинский фонд Сан-Антонио; и Центром исследований патогенеза и передачи гриппа (CRIPT), финансируемым NIAID Центром передового опыта в области исследований и реагирования на грипп (CEIRR, контракт No 75N93021C00014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07Store at room temperature (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% Formalin solution, neutral bufferedSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one662160
5% Sodium bicarbonateSigma AldrichS-5761
6-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one657160
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0Spectral Instruments ImagingImage analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647Store at 4 °C
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 °C
Anesthesia gas machineVeterinary Anesthesia Systems, Inc.VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic miceThe Jackson Laboratory34860
Graphpad Prism Version 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Store at RT
MARS Data Analysis SoftwareBMG LABTECH
MB10 tabletsQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay ReagentPromegaN1110This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIStore at -20 °C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, PeroxidaseVector LaboratoriesPK-4002ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

Ссылки

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177SARS CoV 2NanoLucin vivoIVISAmi HTK18 hACE2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены