JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод инъекции клеток с помощью безигольчатой водоструйной технологии в сочетании с продолжением послеродовых исследований с точки зрения измерения клеточной жизнеспособности, пролиферации и эластичности.

Аннотация

Недержание мочи (UI) является широко распространенным состоянием, характеризующимся дефицитом мышцы уретрального сфинктера. Отрасли регенеративной медицины, особенно клеточная терапия, являются новыми подходами к улучшению и восстановлению функции уретрального сфинктера. Несмотря на то, что инъекция активных функциональных клеток обычно выполняется в клинических условиях с помощью иглы и шприца, эти подходы имеют значительные недостатки и ограничения. В этом контексте технология безигольчатой гидроабразивной струи (WJ) является осуществимым и инновационным методом, который может вводить жизнеспособные клетки с помощью визуальной цистоскопии в уретральный сфинктер. В настоящем исследовании мы использовали WJ для доставки стромальных клеток (pADSC), полученных из жировой ткани свиней, в трупную уретральную ткань и впоследствии исследовали влияние доставки WJ на выход и жизнеспособность клеток. Мы также оценили биомеханические характеристики (т.е. эластичность) с помощью измерений атомно-силовой микроскопии (AFM). Мы показали, что pADSC, доставленные WJ, были значительно снижены в их клеточной эластичности. Жизнеспособность была значительно ниже по сравнению с контрольной группой, но все еще выше 80%.

Введение

Недержание мочи (UI) является широко распространенным расстройством с распространенностью 1,8 - 30,5% в европейских популяциях1 и характеризуется в первую очередь неисправностью уретрального сфинктера. С клинической точки зрения хирургическое лечение часто предлагается пациентам, когда консервативная терапия или физиотерапия не могут решить и облегчить возникающие симптомы.

Клеточная терапия потенциальной регенеративной репарации сфинктерного комплекса возникает как авангардный подход к лечению патологииUI 2,3. Его основными целями являются замена, восстановление и восстановление биологической функциональности поврежденной ткани. На животных моделях для пользовательского интерфейса трансплантация стволовых клеток показала многообещающие результаты в уродинамических исходах 2,4,5. Стволовые клетки возникают как оптимальные клеточные кандидаты, поскольку они обладают способностью подвергаться самообновлению и мультипотентной дифференцировке, таким образом, способствуя регенерации пораженной ткани6. Несмотря на предстоящий регенеративный потенциал, практическое использование клеточной терапии остается затрудненным, поскольку минимально инвазивная доставка клеток по-прежнему сталкивается с рядом проблем, касающихся точности инъекций и охвата мишени. Несмотря на то, что текущий подход, используемый для доставки клеток, представляет собой инъекцию через систему иглы-шприца7, он обычно приводит к общему дефициту жизнеспособных клеток, при этом заявленные жизнеспособности составляют всего 1%-31% после трансплантации8. Кроме того, было также показано, что доставка клеток с помощью инъекции иглы влияет на размещение, скорость удержания, а также на распределение трансплантированных клеток в целевой ткани 9,10,11. Осуществимым, новым подходом, который преодолевает вышеупомянутое ограничение, является доставка клеток без игл с помощью водоструйной технологии.

Технология Waterjet (WJ) становится новым подходом, который обеспечивает высокую пропускную способность доставки клеток цистоскопом под визуальным контролем в уретральном сфинктере12,13. WJ обеспечивает доставку ячеек при различных давлениях (E = эффекты в барах) в диапазоне от E5 до E8013. В первой фазе (фазе проникновения в ткани) изотонический раствор наносят с высоким давлением (т.е. Е60 или Е80) с целью ослабления внеклеточного матрикса, окружающего ткани-мишень, и открытия небольших соединительных микролакунов. Во второй фазе (фазе инъекции) давление понижается в течение миллисекунд (т.е. до Е10), чтобы мягко доставить клетки в ткани-мишени. После этого двухэтапного применения клетки не подвергаются дополнительному давлению на ткань при выбросе, а плавают в потоке низкого давления в заполненную жидкостью кавернозную область13. В условиях модели ex vivo, где стволовые клетки вводились через WJ в трупную ткань уретры, жизнеспособные клетки могли быть впоследствии аспирированы и извлечены из ткани и дополнительно расширены in vitro13. Хотя исследование 2020 года Weber et al. продемонстрировало осуществимость и применимость WJ для доставки кардиомиоцитов без следов в миокард14, следует иметь в виду, что технология WJ все еще находится на стадии прототипа.

Следующий протокол описывает, как подготовить и маркировать стромальные клетки, полученные из жировой ткани свиней (pADSC), и как доставить их в улавливающую жидкость и трупную ткань с помощью технологии WJ и игл цистоскопии Уильямса (WN). После клеточной инъекции оценивается клеточная жизнеспособность и эластичность с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Посредством пошаговых инструкций протокол дает четкий и лаконичный подход к получению достоверных данных. В дискуссионном разделе представлены и описаны основные преимущества, ограничения и будущие перспективы методики. Доставка WJ клеток, а также анализы sequela post translation, о которых сообщается здесь, заменяют стандартную инъекцию иглы и обеспечивают прочную основу для доставки клеток для регенеративного заживления ткани-мишени. В наших недавних исследованиях мы предоставили доказательства того, что WJ доставлял клетки более точно и, по крайней мере, с сопоставимой жизнеспособностью по сравнению с инъекциями иглы15,16.

протокол

Образцы жировой ткани свиней были получены из Института экспериментальной хирургии при Университете Тюбингена. Все процедуры были одобрены местными органами по защите животных под номером эксперимента на животных CU1/16.

1. Выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани свиней

  1. Используйте жировую ткань свиней, доставленную из Института экспериментальной хирургии в центрифужной трубке объемом 50 мл в лабораторию.
  2. Переложить ткань на стерильную чашку Петри под стерильной скамьей и измельчить ее двумя скальпелями (No10) до мелких фрагментов и кашицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ножницы также можно использовать для получения небольших фрагментов. Чем меньше фрагменты, тем лучше для последующего пищеварения.
    1. Переложите мелкие фрагменты/кашицу в центрифужную трубку объемом 50 мл и инкубируйте ее с 5 мл раствора гомогенизатора в течение 30 мин при 37 °C на шейкере. Раствор гомогенизатора представляет собой PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (стоковый раствор: 1 % (мас./об.) BSA в PBS) и 0,1% коллагеназой типа I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте раствор гомогенизатора свежим. Шейкер имеет круговое встряхивающее движение на медленной скорости 25-500 об/мин.
  3. Чтобы остановить инкубацию, добавьте 10 мл питательной среды [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - низкий уровень глюкозы (DMEM-LG), 2,5% раствор натриевой соли HEPES (1 М), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина (200 мМ), 1% пенициллина-стрептомицина (10000 Ед/мл пенициллина; 10 000 мкг/мл стрептомицина) и 1% амфотерицина B (250 мкг/мл)].
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные среды могут быть подготовлены заранее. Антибиотики и противогрибковые препараты необходимы при приготовлении питательных сред для клеточной культуры для защиты клеток от загрязнений.
  4. Инкубировать трубки центрифуги в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Аспирировать фракцию с адипоцитами, которая легче и поэтому плавает поверх жидкости, пипеткой 10 мл и выбросить ее.
  6. Фильтруйте оставшуюся стромальную фракцию через клеточное сито 100 мкм с полиэтилентерефталатной (ПЭТ) мембраной, свободной от тяжелых металлов, чтобы удерживать фрагменты жировой ткани и извлекать только клеточную суспензию.
  7. Центрифугируйте фильтрованную клеточную суспензию в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
  8. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 2 мл PBS, чтобы промыть клетки один раз.
  9. Центрифугируйте клеточную суспензию снова в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
  10. После центрифугирования и повторной суспензии клеточной гранулы в 10 мл питательной среды на колбу, семенные клетки в 75см2 колбы для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера ячейки гранулы после стадии промывки PBS, семенные ячейки в одной-четырех колбах.

2. Культивирование стромальных клеток жировой ткани свиней

  1. Сбор и прохождение клеток, когда они достигают 70% слияния.
  2. Промыть ячейки 10 мл PBS дважды и аспирировать PBS полностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления оставшихся питательных сред, которые дополняются 10% FBS. FBS имеет несколько ингибиторов протеазы, которые могут препятствовать функции последующей трипсинизации.
  3. Добавьте 3 мл 0,05%-трипсина-ЭДТА на колбу для отделения клеток.
  4. Инкубировать колбы в течение 3 мин при 37 °C.
  5. Проверьте под микроскопом, если клетки отсоединены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда требуется еще некоторое время, чтобы отсоединить ячейки. В этом случае инкубировать колбы в течение максимум 5 мин при 37 °C.
  6. Чтобы остановить процесс инкубации и отсоединения, добавьте 3 мл питательных сред.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечалось выше, среда роста дополняется 10% FBS, который содержит ингибиторы протеазы.
  7. Переложите отсоединенные ячейки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
  8. Повторно суспендируют клетки в 10 мл питательных сред и подсчитывают их гемоцитометром.
  9. Семенные клетки с плотностью инокуляции 3 х 105 клеток на колбу 75см2 .

3. Маркировка клеток кальцеином-АМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупные ткани, окрашиваются зелено-флуоресцентным мембранопроницаемым живым клеточным пятном и красно-флуоресцентным индикатором непроницаемой мембраны, чтобы убедиться, что извлеченные клетки совпадают с введенными клетками, а не фрагментами тканей уретры.

  1. Дважды промывайте ячейки 10 мл PBS.
  2. Добавьте 5 мл раствора красителя на 75см2 колбы. Раствор красителя состоит из питательной среды с 2 мкМ зелено-флуоресцентного мембранопроницаемого красителя живых клеток и 4 мкМ красно-флуоресцентного мембранно-непроницаемого показателя жизнеспособности.
  3. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в темное время суток.
  4. Аспирировать и выбросить раствор красителя.
  5. Дважды промыть клетки 10 мл PBS.
  6. Добавьте питательные среды и задокументируйте зеленый и красный флуоресцентный сигнал с помощью флуоресцентной микроскопии.
    1. Поместите колбу размером 75см2 на стол микроскопа, используйте объектив 10x, выберите отсутствие флуоресцентного фильтра и убедитесь, что проходящий световой путь активен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти шаги выполняются вручную на микроскопе.
    2. Параллельно с шагом 3.6.1 откройте программное обеспечение.
    3. Нажмите кнопку Live на вкладке Locate , чтобы получить живое изображение ячеек в колбе на столе и сфокусироваться на них с помощью грубых и тонких регулировочных дисков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На правом прицеле живое изображение появится после активации кнопки Live .
    4. В подвкладке Компоненты микроскопа выберите правильный объектив (10x).
    5. На подвкладке Камера установите флажок Автоматическая экспозиция.
    6. Нажмите кнопку Snap , чтобы сделать первый снимок с проходящим светом.
    7. Вставьте шкалу масштабирования, используя вкладку Графика в строке меню и выбрав Масштабная шкала.
    8. Сохраните изображение, используя вкладку Файлы в строке меню и выбрав Сохранить как czi.
    9. Для флуоресцентных снимков измените фильтр на фильтр, специфичный для зеленой или красной флуоресценции, и выберите траекторию отраженного света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изменения должны быть сделаны вручную на микроскопе.
    10. Нажмите еще раз кнопку Live на вкладке Locate , чтобы получить динамическое изображение ячеек.
    11. Нажмите кнопку Snap , чтобы сделать второй снимок с зеленой или красной флуоресценцией.
    12. Вставьте шкалу масштабирования, используя вкладку Графика в строке меню и выбрав Масштабная шкала.
    13. Сохраните изображение, используя вкладку Файлы в строке меню и выбрав Сохранить как czi.
    14. Повторите шаги 3.6.9-3.6.13 с другим флуоресцентным каналом.

4. Подготовьте образцы ткани уретры к инъекциям

  1. Рассекните уретру и соединительный мочевой пузырь из свиньи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов использовались образцы ткани уретры из свежих трупных образцов взрослых самок свиней ландраса.
  2. Транспортируйте его в лабораторию в мешках на мокром льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы следует оставить на льду до дальнейшей обработки. Никаких добавок в образцы не добавлялось.
  3. Поместите уретру с мочевым пузырем на губку, которая имитирует эластичность нижнего тазового дна.
    1. Используйте мочевой пузырь для определения ориентации (проксимальной, дистальной, дорсальной и вентральной) уретры. Это возможно благодаря локализации мочеточников и трех связок, которые фиксируют мочевой пузырь в брюшной и тазовой полости. Три связки представляют собой две связки vesicae lateralia по бокам мочевого пузыря и vesicae medianum, которая возникает из вентральной поверхности мочевого пузыря (рисунок 1).
  4. Разрежьте уретру продольно с дорсальной стороны с помощью катетера.
  5. Введите клетки в открытую уретру, как описано в следующих главах.

5. Инъекции клеток с помощью иглы Уильямса в жидкости и образцы тканей

  1. Соберите клетки, как описано в шаге 2.
  2. В отличие от шага 2.9, отрегулируйте плотность клеток для инъекций до 2,4 х 106 клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций в образцы тканей маркируют клетки зелено-флуоресцентной мембранопроницаемой живой клеткой.
  3. Аспирируйте клеточную суспензию шприцем и нанесите на нее цистоскопическую инъекционную иглу Уильямса (WN).
  4. Либо держите иглу вскоре над 2 мл питательной среды в центрифугирующей трубке объемом 15 мл, либо вставьте иглу в открытую ткань уретры. В обоих случаях вводят 250 мкл клеток вручную.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупную уретру, образуют инъекционный купол.
  5. Собирают клетки, вводимые в среду непосредственно путем центрифугирования в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
  6. Для клеток, введенных в трупную уретру, аспирируйте их из купола инъекции иглой 18G, нанесенной на шприц.
  7. Перекладывают введенные и аспирированные клетки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре по сравнению с клетками, вводимыми в среду.
  8. После центрифугирования повторно суспендируют клетки в 4 мл ростовых сред в обоих случаях.
  9. Определение выхода и жизнеспособности клеток с помощью исключения красителя трипан синего с помощью гемоцитометра.
    1. Тщательно смешайте 20 мкл клеточной суспензии с 20 мкл трипана синего.
    2. Заполните 10 мкл этой смеси в каждой камере гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе камеры заполняются и подсчитываются для получения статистической оптимизации путем удвоения выборки.
    3. Под микроскопом подсчитайте клетки во всех четырех угловых квадратах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте клетки, сияющие белым цветом (неокрашенными), как жизнеспособные клетки, тогда как клетки, сияющие синим цветом (окрашенные), считаются мертвыми клетками.
    4. Чтобы вычислить число ячеек на мл, вычислите среднее из двух камер, разделите это число на два и умножьте его на 104.

6. Инъекции клеток с помощью Waterjet в жидкости и образцы тканей

  1. Соберите клетки, как описано в шаге 2.
  2. В отличие от шагов 2.9 и 5.2, отрегулируйте плотность клеток для инъекций до 6 х 106 клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций в образцы тканей используют клетки, помеченные зелено-флуоресцентной мембранопроницаемой живой клеткой.
  3. Заполните клеточную суспензию в дозирующий блок устройства WJ.
  4. Либо держите инъекционную насадку вблизи 2 мл питательной среды в центрифугированной трубке объемом 15 мл или вскоре над открытой тканью уретры.
  5. В обоих случаях вводят 100 мкл клеток устройством с использованием высокого давления для проникновения в ткани с последующей фазой низкого давления для инъекций клеток. Используйте настройки давления Е60-10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, вводимые в трупную уретру, образуют инъекционный купол.
  6. Собирают клетки, вводимые в среду непосредственно путем центрифугирования в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре.
  7. Для клеток, введенных в трупную уретру, аспирируйте их из купола инъекции иглой 18G, нанесенной на шприц.
  8. Перекладывают введенные и аспирированные клетки в центрифугированную трубку и центрифугу в течение 7 мин при 630 х г при комнатной температуре по сравнению с клетками, вводимыми в среду.
  9. После центрифугирования повторно суспендируют клетки в 4 мл питательной среды в обоих случаях.
  10. Определение выхода и жизнеспособности клеток с помощью исключения красителя трипанового синего с помощью гемоцитометра, как подробно описано в 5.10.

7. Биомеханическая оценка клеточной эластичности методом атомно-силовой микроскопии (АСМ)

  1. Подготовка образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановленные клетки после инъекции теперь подлежат дальнейшему анализу AFM. Кроме того, клетки, которые не были введены, используются в качестве контроля.
    1. Семена клеток в тканевой культуре посуды плотностью 5 х 105 клеток на блюдо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Посейте по одному блюду для культивирования тканей в каждом состоянии. Условиями являются контроль, ADSC, вводимые WJ или WN в среду, и ADSC, вводимые WJ или WN в трупную ткань.
    2. Инкубировать клетки в чашках для культивирования тканей в течение 3 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать дисперсий из-за клеток в фазе G1 и во время митоза, мы выполнили измерения AFM через 3 ч после стадии посева клеток.
    3. Непосредственно перед измерением с помощью AFM замените среду роста 3 мл среды L-15 Лейбовица без L-глутамина.
    4. Поместите чашку для культивирования тканей в держатель для образцов устройства AFM и включите нагреватель чашки Петри при температуре 37 °C.
  2. Подготовка АСМ и консольной калибровки
    1. Используйте стеклянный блок, предназначенный для измерений в жидкостях, и отрегулируйте его на держателе AFM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя поверхность стеклоблока должна быть прямой и параллельно держателю AFM.
    2. Аккуратно поместите консоль на поверхность стеклоблока. Наконечник А должен лежать над полированной оптической плоскостью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не царапайте полированную оптическую поверхность стеклоблока, так как царапины могут привести к помехам в измерениях. Наконечник А должен выступать над полированной оптической плоскостью, поскольку в противном случае отражение лазера АСМ к фотоприемнику невозможно.
    3. Чтобы стабилизировать консоль на стеклоблоке, добавьте металлическую пружину с помощью пинцета.
    4. Когда консоль закреплена на стеклоблоке, поместите блок на головку AFM и заблокируйте встроенный запирающий механизм.
    5. Установите головку AFM на устройство AFM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пружина должна быть обращена в левую сторону, чтобы быть правильно размещенной. Если это не так, исправьте положение стеклянного блока и снова отрегулируйте головку AFM.
    6. Инициализируйте настройку программного обеспечения и откройте программное обеспечение вместе с окном лазерного выравнивания и настройками параметров подхода. Дополнительно включите шаговый двигатель, лазерный свет и ПЗС-камеру.
    7. Определите консольный наконечник А с помощью ПЗС-камеры.
    8. Опустите консоль до тех пор, пока она полностью не будет погружена в среду. Используйте функцию шагового двигателя для достижения этой цели.
    9. Как только консоль полностью покрыта средой, лазер выравнивается поверх консольного кантилевера с помощью регулировочных винтов. Отраженный луч должен упасть на центр фотоприемника, а сумма сигналов должна составлять 1 В или выше. Боковые и вертикальные прогибы должны быть близки к 0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если центр достигнут, можно контролировать в функции лазерного выравнивания, а также значения сигнала. Если значения сигнала неверны, необходимы дальнейшие корректировки.
    10. Запустите сейчас сканер Approach с параметрами подхода (таблица 1).
    11. Втяните консоль на 100 мкм, как только она достигнет дна, нажав кнопку Втянуть .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ни одна ячейка не прикреплена к этому полю, если подход выполнен, потому что это сфальсифицирует калибровку.
    12. Настройте параметры Run в соответствии со следующими спецификациями: Заданное значение 1 В, Длина вытягивания 90 мкм, Скорость: 5 мкм/с, Частота дискретизации: 2000 Гц и в режиме задержки: Постоянная сила.
    13. Запустите измерение калибровочной кривой силы-расстояния, нажав кнопку Run.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии кнопки «Выполнить» в программном обеспечении получается кривая силы-расстояния.
    14. Выберите область линейной подгонки втягивающейся кривой в программном обеспечении на полученной калибровочной кривой сила-расстояние. Рассчитайте измерение постоянной пружины с помощью программного обеспечения.
    15. Калибруйте консоль, следуя точным параметрам и шагам, описанным Danalache et al.17.
  3. Измерение эластичности отдельных клеток
    1. Визуально определите клетку и сосредоточьтесь на ней. Поместите компьютерную мышь в середину ячейки. Чтобы повысить точность измерений, расположите наконечник AFM непосредственно над ядром клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерная мышь используется в качестве визуального маркера для идентификации целевого сайта отступа.
    2. Теперь сосредоточьтесь на консольном устройстве и переместите его на компьютерную мышь.
    3. Начните измерение с Run с параметрами, приведенными в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используются параметр заданного значения, полученный при калибровке консольного аппарата. Кроме того, одна клетка измеряется три раза. Измерьте не менее 50 клеток.
  4. Обработка данных
    1. Обрабатывайте данные, следуя точным шагам и параметрам, как описано ранее в Danalache17.
    2. Сохраните и экспортируйте файл.

8. Статистический анализ

  1. Откройте статистическое программное обеспечение.
  2. Выберите выбрать Новый набор данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Открываются два файла. Одним из них является "DataSet", а другим - файл "Output".
  3. Выберите файл DataSet и откройте вкладку Представление переменных .
  4. Вставьте числовые переменные для инъекции в месте (захват жидкости или трупной ткани), категории (контроль, инъекция WJ, инъекция WN) и эластичности.
  5. Вставьте измеренные данные об эластичности с соответствующей инъекцией сайта и номером категории на вкладке Представление данных .
  6. Проанализируйте данные, выбрав вкладку в строке меню Анализ | Описательная статистика и выберите Исследовательский анализ данных.
  7. В качестве зависимой переменной выберите Эластичность , а в списке факторов выберите Категория.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в файле "Output", включая график поля, который используется для раздела результатов.
  8. Чтобы выполнить статистический тест, выберите Независимые выборки в непараметрическом тесте на вкладке в строке меню Анализ.
  9. В новом открытом файле сохраните настройки на вкладке Цель и Настройки.
  10. Откройте вкладку Поля и выберите Эластичность в качестве тестовых полей и Категория в качестве групп.
  11. Нажмите кнопку Выполнить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отображаются в файле "Output". Для этих анализов проводится тест Манна-У-Уитни.
  12. Включите результат непараметрического теста в прямоугольный график анализа исследовательских данных.
  13. Сохраните файлы, выбрав Файл в строке меню и выбрав Сохранить.

Результаты

После доставки клеток с помощью двух подходов жизнеспособность клеток, доставленных через WN (97,2 ± 2%, n = 10, p<0,002), была выше по сравнению с инъекциями WJ с использованием настроек E60-10 (85,9 ± 0,16%, n = 12) (рисунок 2). Результаты биомеханической оценки показали, что: инъекции ВН клетка...

Обсуждение

В настоящем исследовании мы продемонстрировали и представили пошаговый подход к процедуре доставки WJ-клеток и использовали продолжение количественных исследований для оценки влияния доставки WJ на клеточные характеристики: жизнеспособность клеток и биомеханические особенности (т.е....

Раскрытие информации

Авторам J.K., M.D, T.A., A.S., W.K.A. нечего раскрывать. Авторы W.L. и M.D.E. являются сотрудниками ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, производителя ERBEJet2 и прототипа WJ, используемого в этом исследовании.

Благодарности

Мы благодарим наших соавторов из оригинальных публикаций за помощь и поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

Ссылки

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены