Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон

Резюме

Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.

Аннотация

Эластичность имеет важное значение для функции тканей, таких как кровеносные сосуды, мышцы и легкие. Это свойство получено в основном из внеклеточного матрикса (ECM), белковой сетки, которая связывает клетки и ткани вместе. Как упругие свойства сети ECM связаны с ее составом, и играют ли релаксационные свойства ECM физиологическую роль, являются вопросами, которые еще предстоит полностью решить. Часть проблемы заключается в сложной архитектуре большинства ECM-систем и сложности изоляции компонентов ECM без ущерба для их структуры. Одним из исключений является зонула, система ECM, обнаруженная в глазу позвоночных. Зонула содержит волокна длиной от сотен до тысяч микрометров, которые охватывают бесклеточное пространство между линзой и глазной стенкой. В этом отчете мы описываем механический метод, который использует преимущества высокоорганизованной структуры зонулы для количественной оценки ее вязкоупругих свойств и определения вклада отдельных белковых компонентов. Метод включает в себя рассечение фиксированного глаза для обнажения хрусталика и зонулы и использует технику подтягивания, которая растягивает зонулярные волокна одинаково, пока контролируется их натяжение. Метод относительно недорогой, но достаточно чувствительный, чтобы обнаружить изменения в вязкоупругих свойствах зонулярных волокон у мышей, у которых отсутствуют специфические зонулярные белки или при старении. Хотя метод, представленный здесь, предназначен в первую очередь для изучения глазного развития и заболеваний, он также может служить экспериментальной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся вязкоупругих свойств упругих ECM и роли внешних факторов, таких как концентрация ионов, температура и взаимодействия с сигнальными молекулами.

Введение

Глаз позвоночного содержит живую оптическую линзу, которая помогает фокусировать изображения на сетчатке1. Линза подвешена на оптической оси системой тонких, радиально ориентированных волокон, как показано на рисунке 1А. На одном конце волокна прикрепляются к экватору хрусталика, а на другом — к поверхности цилиарного тела. Их длина охватывает расстояния от 150 мкм у мышей до 1 мм у людей. В совокупности эти волокна известны как зонула ^Zinn2, цилиарная зону или просто зонула. Глазная травма, заболевание и некоторые генетические нарушения могут повлиять на целостность зонулярных ^{волокон3}, что приводит к их возможному отказу и сопутствующей потере зрения. У мышей волокна имеют ядро, состоящее в основном из белка фибриллина-2, окруженного мантией, богатой фибриллином-14. Хотя зональные волокна уникальны для глаза, они имеют много общего с волокнами ECM на основе эластина, обнаруженными в других частях тела. Последние покрыты мантией фибриллина-15 и имеют размеры, аналогичные зональным ^{волокнам6}. Другие белки, такие как латентно-трансформирующий фактор роста β-связывающие белки (LTBPs) и микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1 (MAGP-1), встречаются в ассоциации с обоими типами волокон7,8,9,10,11. Модуль упругости зональных волокон находится в диапазоне 0,18-1,50 МПа12,13,14,15,16, что сопоставимо с модулем волокон на основе эластина (0,3-1,2 МПа)¹⁷. Эти архитектурные и механические сходства заставляют нас полагать, что любое понимание ролей зонул-ассоциированных белков может помочь прояснить их роль в других эластических волокнах ECM.

Основная цель разработки метода, описанного здесь, заключается в том, чтобы получить представление о роли специфических зонулярных белков в прогрессировании наследственного заболевания глаз. Общий подход заключается в сравнении вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей дикого типа с свойствами мышей, несущих целевые мутации в генах, кодирующих зонулярные белки. Хотя ранее для измерения эластомеханических свойств зональных волокон использовалось несколько методов, все они были разработаны для глаз гораздо более крупных животных12,13,14,15,16. Поскольку такие модели генетически не поддаются обработке; мы стремились разработать экспериментальный метод, который лучше подходил бы для маленьких и нежных глаз мышей.

Метод, который мы разработали для оценки вязкоупругости зональных волокон мыши, представляет собой метод, который мы называем анализом подтягивания4,18, который обобщен визуально на рисунке 1. Подробное описание метода подтягивания и анализ результатов приводится ниже. Начнем с описания конструкции аппарата, включая трехмерные (3D)-печатные детали, используемые в проекте. Далее мы подробно описываем протокол, используемый для получения и подготовки глаз к эксперименту. Наконец, мы предоставляем пошаговые инструкции о том, как получить данные для определения вязкоупругих свойств зональных волокон. В разделе «Репрезентативные результаты» мы делимся ранее неопубликованными данными, полученными с помощью нашего метода, о вязкоупругих свойствах зональных волокон у мышей, лишенных ^MAGP-119, а также контрольным набором, полученным от животных дикого типа, соответствующих возрасту. Наконец, мы завершаем общими замечаниями о преимуществах и ограничениях метода, а также предложениями для потенциальных экспериментов, которые могут прояснить, как экологические и биохимические факторы влияют на вязкоупругие свойства волокон ECM.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по изучению животных Вашингтонского университета и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Изготовление специализированных деталей и конструирование аппаратов

1. Изготовление специализированных деталей
   1. Изготовление зонда. Держите стеклянный капилляр под углом, как показано на левой панели рисунка 2A. Поместите пламя от прикуривателя примерно в 2 см от одного конца и держите его там до тех пор, пока конец не согнется на 90°, как показано на правой панели рисунка 2А.
   2. Пример изготовления платформы. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте платформу размером 30 x 30 x 5 мм и содержащую полусферические отступы диаметром 2,0, 2,5 и 3,0 мм, как показано на рисунке 2B.
   3. Изготовление держателя зонда. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте крепление, удерживающее капиллярный зонд, и прикрепите его к микроманипулятору (см. Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец 3D-файла для изготовления платформы и держателя зонда в формате STL доступен по запросу от соответствующего автора.
   4. Отрицательная сборка линзы. Поместите отрицательную цилиндрическую линзу (-75 мм по фокусному расстоянию и примерно 50 мм по высоте и длине), как показано на рисунке 1C и рисунке 1D , чтобы исправить искажение, вызванное добавлением жидкости в чашку Петри (добавление жидкости искажает вид рассеченного глаза при изображении сбоку).
   5. Приклейте негативную линзу к одному из 2-щелевых оснований (см. Рисунок 2D для позиционирования объектива на основании).
   6. Соберите оставшиеся детали, как показано на рисунке 2D.
   7. Отрегулируйте высоту стойки так, чтобы объектив едва нависал над шкалой и затяните винт в держателе.
2. Конструкция аппарата
   1. Установите на компьютер программу регистрации, поставляемую с весами, программное обеспечение камеры микроскопа и приложение контроллера моторизованного микрометра.
   2. Подключите моторизованный микрометр к контроллеру серводвигателя, а последний к компьютеру. Запустите приложение контроллера двигателя и отредактируйте настройки двигателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигательные настройки, которые перечислены ниже, были выбраны после предварительных экспериментов, которые показали, что напряжения расслабляются на временной шкале 10-20 с. Основываясь на этом определении, мы выбрали скорость и ускорение, которые позволили двигателю выполнить смещение на 50 мкм за время, меньшее, чем время релаксации, но не слишком короткое, чтобы избежать встряхивания образца. Здесь мы выбрали время смещения около 5-10 с.
   3. Установите максимальную скорость 0,01 мм/с, а ускорение 0,005 мм/^с2.
   4. Установите камеру в инспекционный микроскоп и протестируйте программное обеспечение для визуализации камеры.
   5. Поместите весы на скамейку, отведенную под аппарат.
   6. Приклейте 3D-печатную платформу (из шага 1.1.2) на чашку Петри и добавьте стеклянную бусину 2-3 мм в одну из скважин. Поместите чашку Петри на весы так, чтобы шарик располагался вблизи центра кастрюли.
   7. Замените ручной микрометр с микроманипулятора на моторизованный.
   8. Вкрутите два винта по 4-40 в держатель зонда. Прикрепите держатель зонда к манипулятору, как показано на рисунке 1С.
   9. Подготовьте зонд, как показано на рисунке 2А, поместите его внутрь держателя зонда изогнутой частью вниз и затяните винты.
   10. Расположите микроманипулятор на столе так, чтобы кончик зонда находился над шариком на платформе. Прикрепите микроманипулятор к столу, чтобы предотвратить случайное движение во время эксперимента.
   11. Расположите боковой микроскоп на столе так, чтобы шарик находился в центре поля его зрения и в фокусе.

2. Подготовка образцов и сбор данных

1. Фиксация и рассечение глаз
   1. Поддерживайте мышей дикого типа и животных Magp1-null на идентичном фоне C57/BL6J. Усыпляйте 1-месячных или 1-летних мышей путем вдыхания _CO2 .
   2. Удалите глаза тонкими щипцами и зафиксируйте энуклеированные глобусы при 4 °C в течение ночи в 4% параформальдегиде /фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, pH 7,4). Поддерживать положительное давление 15-20 мм рт.ст. в глазу во время процесса фиксации, как ^{описано6}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводятся на самцах мышей, чтобы контролировать возможные половые различия в размерах глазного шара. Положительное давление гарантирует, что земной шар остается раздутым, сохраняя зазор между хрусталиком и стенкой глаза, охватываемый зональными волокнами.
   3. Промывайте глаза в течение 10 мин в PBS. Используя офтальмологические хирургические ножницы и работая под стереомикроскопом, сделайте разрез полной толщины в стенке глаза возле головки зрительного нерва.
   4. Вытяните разрез вперед к экватору, а затем вокруг экваториальной окружности глаза. Позаботьтесь о том, чтобы сохранить деликатные цилиарные процессы и связанные с ними зональные волокна.
   5. Снимите заднюю часть земного шара, обнажив заднюю поверхность хрусталика.
   6. Используйте щипцы, чтобы удалить рассеченный глаз из буферного раствора и поместить его на сухую салфетку с роговицей вниз. Осторожно перетащите роговицу по поверхности салфетки, чтобы высушить ее.
   7. Добавьте 3 мкл мгновенного клея в колодцы платформы, которые будут вмещать глаз в чашку Петри.
   8. Поместите блюдо на сценическую пластину стереомикроскопа так, чтобы колодец с клеем был в поле зрения.
   9. Перенесите глаз от салфетки к краю лунки, содержащей клей. Затем осторожно перетащите глаз в колодец и быстро отрегулируйте его ориентацию так, чтобы задняя часть объектива была самой верхней.
   10. Высушите открытую сторону хрусталика, аккуратно промокав ее уголком сухой салфетки.
   11. Нанесите мазок мгновенного клея на дно 50-миллиметровой чашки Петри и зацементируйте к ней платформу.
2. Измерение зонального вязкоупругого отклика
   1. Включите шкалу, запустите программу регистрации масштаба и программное обеспечение камеры. Убедитесь, что программа ведения журнала может получать данные в течение 30 минут, так как некоторые испытания могут длиться так долго.
   2. Включите контроллер серводвигателя и запустите приложение контроллера на компьютере. Убедитесь, что контроллер настроен на перемещение с шагом 50 мкм, используя параметры движения, аналогичные тем, которые описаны в ПРИМЕЧАНИИ на шаге 1.2.2.
   3. Создайте изгиб на 90° в капиллярном стержне, как описано в шаге 1.1.1.
   4. Вставьте изогнутый капилляр в держатель капиллярного зонда и затяните крепежные винты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму обезвоживание образца, мы рекомендуем выполнить шаги 1-4 до или во время рассечения глаз.
   5. Добавьте небольшой (~1 мм) шарик УФ-отверждающего клея к кончику капилляра.
   6. Используя ручные регулировки на манипуляторе, переместите наконечник капиллярного зонда так, чтобы он находился непосредственно над центром линзы. Проверьте, кажется ли нижняя часть УФ-клея центрированной над верхней частью объектива при взгляде спереди (визуальным осмотром) и сбоку (через камеру микроскопа).
   7. Глядя через камеру, опустите наконечник зонда до тех пор, пока ультрафиолетовый клей не вступит в контакт с объективом и не покроет от одной трети до половины его верхней поверхности.
   8. Используйте низкоинтенсивный (~ 1 мВт), направленный, почти видимый УФ-источник света (380-400 нм) для отверждения клея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этих спецификаций достаточно, чтобы вылечить клей за несколько секунд, сводя к минимуму возможность индуцирования сшивки белка. Источники ультрафиолетового света, поставляемые с коммерческими УФ-клеевыми ручками, соответствуют этим спецификациям.
   9. Добавьте раствор PBS в блюдо до тех пор, пока глаз не будет покрыт жидкостью на глубину не менее 2 мм.
   10. Поместите цилиндрическую линзу перед смотровым микроскопом и как можно ближе к чашке Петри, не прикасаясь к ней.
   11. Одновременно запустите программу ведения журнала и программу таймера. Сделайте снимок глаза/зонда с помощью камеры.
   12. Через 60 с инициируют еще одно смещение на 50 мкм, а затем каждые 60 с до завершения эксперимента, т. е. до тех пор, пока все волокна не будут разорваны. Обратите внимание, что сигнал не вернется к исходным уровням из-за буферного испарения во время эксперимента. Исправьте последующий дрейф показаний во время анализа данных, как показано на этапе 2.2.14.
   13. По завершении выполнения сохраните данные журналирования масштаба и экспортируйте их в формат, совместимый с электронной таблицей, например, формат .csv. Сохраните снимки объектива, которые были собраны во время пробега.
   14. Импорт данных в электронную таблицу. Используйте первое и последнее показание шкалы для интерполяции дрейфа в фоновом чтении с течением времени из-за испарения (см. Рисунок 3). Вычтите интерполированное чтение из показаний в каждой точке времени.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электронной таблицы интерполяцию можно выполнить автоматически, введя формулу = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 в ячейку справа от первого чтения шкалы, затем переместив курсор в правый-нижний угол ячейки и перетащив его вниз к последнему значению данных. Формула предполагает, что данные организованы в столбец с первой точкой данных, появляющейся в ячейке B2. При желании данные, обработанные на этапе 2.2.14, могут быть проанализированы с помощью квазиупругой вязкоупругой модели, разработанной одним из соавторов, доктором Мэтью ^Райли4.

Результаты

Описанный здесь метод подтягивания обеспечивает простой подход к определению вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей. Короче говоря, глаз мыши сначала сохраняется путем инъекции фиксатора при физиологическом внутриглазном давлении. Этот подход поддерживает естественную инф?...

Обсуждение

Зонула представляет собой необычную систему ECM, где волокна расположены симметрично и ими можно манипулировать идентично, смещая глазную линзу вдоль оптической оси. Пространство также может быть легко доступно без клеточного разрушения, что позволяет изучать волокна в среде, близкой ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon