JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются мощным инструментом в трансляционных исследованиях рака, отражая как генетическую, так и фенотипическую гетерогенность заболевания и реакцию на персонализированную противораковую терапию. Здесь подробно описан консолидированный протокол для генерации первичных PDO рака мочевого пузыря человека в рамках подготовки к оценке фенотипических анализов и ответов на лекарства.

Аннотация

Современные платформы терапевтического тестирования in vitro не имеют отношения к патофизиологии опухолей, обычно используя линии раковых клеток, установленные как двумерные (2D) культуры на пластике тканевых культур. Существует острая потребность в более репрезентативных моделях сложности опухоли, которые могут точно предсказать терапевтический ответ и чувствительность. Разработка трехмерной (3D) культуры ex vivo органоидов пациента (PDO), полученных из свежих опухолевых тканей, направлена на устранение этих недостатков. Органоидные культуры могут использоваться в качестве суррогатов опухолей параллельно с рутинным клиническим лечением для информирования о терапевтических решениях путем выявления потенциальных эффективных вмешательств и указания методов лечения, которые могут быть бесполезными. Здесь эта процедура направлена на описание стратегий и подробного пошагового протокола для установления PDO рака мочевого пузыря из свежей, жизнеспособной клинической ткани. Наши устоявшиеся, оптимизированные протоколы практичны для создания 3D-культур для экспериментов с использованием ограниченного и разнообразного исходного материала непосредственно от пациентов или опухолевого материала ксенотрансплантата (PDX). Эта процедура также может быть использована большинством лабораторий, оснащенных стандартным оборудованием для посева тканей. Органоиды, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы в качестве суррогатов ex vivo для понимания как молекулярных механизмов, лежащих в основе урологической патологии рака, так и для оценки методов лечения для информирования клинического руководства.

Введение

Рак мочевого пузыря является наиболее распространенным раком мочевыводящих путей и десятым наиболее распространенным злокачественным новообразованием человека во всем мире1. Он охватывает генетически разнообразный и фенотипически сложный спектр заболевания2. Уротелиальные немышечно-инвазивные формы рака мочевого пузыря (NMIBC) являются наиболее распространенными диагнозами рака мочевого пузыря (70%-80%), и эти виды рака демонстрируют значительную биологическую гетерогенность и переменные клинические исходы 2,3,4. Пациенты с NMIBC обычно испытывают высокий риск рецидива заболевания (50-70%), и одна треть раковых заболеваний прогрессирует и развивается в значительно более агрессивный мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (MIBC)2. Хотя 5-летняя выживаемость для NMIBC высока (>90%), эти пациенты должны проходить долгосрочное клиническое лечение5. С другой стороны, локально развитая (неоперабельная) или метастатическая MIBC обычно считается неизлечимой6. Следовательно, рак мочевого пузыря имеет одну из самых высоких затрат на пожизненное лечение в рамках лечения рака и является значительным бременем как для человека, так и для системы здравоохранения 3,7. Лежащие в основе генетические аберрации при прогрессирующем заболевании делают терапевтическое лечение рака мочевого пузыря клинической проблемой, а терапевтические варианты инвазивных уротелиальных опухолей только недавно улучшились с момента одобрения иммунотерапии как для прогрессирующего, так и для высокого риска NMIBC 8,9. В настоящее время принятие клинических решений руководствуется традиционными клиническими и гистопатологическими особенностями, несмотря на то, что отдельные опухоли рака мочевого пузыря демонстрируют большие различия в агрессивности заболевания и реакции на терапию10. Существует острая необходимость в ускорении исследований клинически полезных моделей для улучшения прогнозирования индивидуального прогноза пациента и определения эффективных методов лечения.

Трехмерные (3D) органоиды демонстрируют большой потенциал в качестве опухолевых моделей из-за их способности самоорганизовываться и рекапитулировать внутреннюю архитектуру in vivo и фармакогеномный профиль исходной опухоли, а также их способность отражать нативную клеточную функциональность исходной ткани, из которой они были получены 11,12,13 . Хотя установленные клеточные линии рака мочевого пузыря легко доступны, относительно экономичны, масштабируемы и просты в манипулировании, клеточные линии in vitro в значительной степени не могут имитировать спектр разнообразных генетических и эпигенетических изменений, наблюдаемых при клиническом раке мочевого пузыря12,14, и все они были установлены и поддерживались в условиях 2D, адгезивной культуры. Кроме того, клеточные линии, полученные из первичных и метастатических опухолей мочевого пузыря, имеют значительное генетическое расхождение с исходным опухолевым материалом. 8,15.

Альтернативным подходом является использование генетически модифицированных и канцерогенных моделей мышей. Однако, хотя эти модели повторяют некоторые из естественных онкогенных каскадов, участвующих в неоплазии человека (рассмотренных в ссылках 16,17,18), они не имеют гетерогенности опухоли, являются дорогостоящими, плохо представляют собой инвазивный и метастатический рак мочевого пузыря и не жизнеспособны для быстрого тестирования на наркотики, поскольку опухоли могут занять много месяцев для развития14,19 . Модели рака, полученные от пациентов (включая органоиды, условно перепрограммированные первичные клеточные культуры и ксенотрансплантаты), предоставляют бесценные возможности для понимания эффектов медикаментозного лечения до клинического лечения20. Несмотря на это, немногие группы обычно используют эти проксимальные модели пациента из-за ограниченного доступа к свежей первичной ткани пациента и обширной оптимизации, необходимой для воспроизводимого создания условий культуры органоидов пациента (PDO). В условиях in vivo онкогенные клетки могут взаимодействовать и взаимодействовать с различными композициями окружающих компонентов, включая стромальные клетки, ткани, инфильтрирующие иммунные клетки, и матрицу12. Аналогичным образом, для PDO, выращенных в 3D-формате, сложность сотовой / матричной может быть настроена для включения других соответствующих компонентов. PDO могут быть быстро сгенерированы и часто могут быть широко пройдены или криоконсервированы для последующего использования, несмотря на то, что имеют конечную продолжительность жизни 21,22,23. Фармакодинамика (т.е. реакция на лекарственное средство) может быть оценена с использованием множественных показаний, включая жизнеспособность и морфологию органоидов, а также характеристику мишеней иммуногистохимии или транскрипционных изменений.

Здесь описаны процедуры установления органоидов рака мочевого пузыря из материала пациента, собранного из трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря (TURBT) или хирургического удаления мочевого пузыря (радикальная цистэктомия). Метод создания PDO проиллюстрирован с использованием легкодоступных влажных лабораторных материалов и инструментов. Конечные точки включают изменения в морфологических характеристиках и жизнеспособности клеток. Они были измерены с использованием флуоресцентной микроскопии, анализов жизнеспособности in vitro (метаболической и целостности клеточных мембран) и гистопатологического анализа. На рисунке 1 показан рабочий процесс установления PDO рака мочевого пузыря человека из клинического материала, полученного во время плановой хирургии.

протокол

Пациенты согласились на это исследование после их поступления в группу урологов в больнице принцессы Александры, Брисбен, Австралия. Данное исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и в рамках этических и институциональных руководящих принципов (этический номер HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве критерия приемлемости пациенты были в возрасте ≥ 18 лет с раком и могли понять и предоставить согласие. Те, кто не смог дать информированное согласие, были исключены. Те, у кого был основной язык, отличный от английского, были исключены, поскольку предоставление устных переводчиков было невозможно из-за материально-технических и бюджетных соображений. Также были исключены пациенты, опухоли которых были недоступны для биопсии или вряд ли были доступны в достаточном количестве после рутинной патологии.

1. Подготовка органоидной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда рака мочевого пузыря человека требует факторов роста, которые помогают в выживании, росте и непрерывном расширении органоидов, полученных из диссоциированного клинического материала (таблица 1). Для получения полной информации о каждой добавке, используемой в этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов.

  1. Разморозьте замороженные ингредиенты на льду или в холодильнике при 2-8 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания/оттаивания и работайте с замороженными аликвотами (хранятся при -20 °C).
  2. Базальная среда: Подготовьте базальную среду, дополнив усовершенствованный модифицированный орлиный медиум Dulbecco/Ham's F-12 (adDMEM/F12) HEPES (10 мМ) и глютамин (2 мМ). Это также используется как транспортная среда, так и во время этапов органоидного промывания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Усовершенствованный DMEM/F-12 используется в качестве базальной среды для помощи в расширении органоидов в присутствии ограниченной сыворотки; однако он требует добавок с HEPES и L-глютамином.
  3. Кратко центрифугируйте фактор роста фибробластов 10 (FGF-10), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), эпителиальный фактор роста (EGF), SB202190, простагландин E2 (PGE2) и A 83-01 перед открытием, чтобы убедиться, что компоненты находятся на дне флакона.
  4. Полная органоидная среда: Дополните базальную среду человеческими ноггин- и R-спондин-кондиционированными средами в конечной концентрации 5% v/v, человеческим EGF (50 нг/мл), человеческим FGF-2 (5 нг/мл), человеческим FGF-10 (20 нг/мл), A 83-01 (500 нМ), SB202190 (10 мкМ), B27 (1x), никотинамидом (10 мМ), N-ацетилцистеином (1,25 мМ), Y-27632 (10 мкМ), PGE2 (1 мкМ) и образованием антибиотиков широкого спектра действия в концентрации, указанной производителем.
  5. Храните органоидные среды при 4 °C в темноте и используйте их в течение 2 недель (не более 1 месяца). Не замораживать. Избегайте длительного воздействия источников света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда готовится без сыворотки; однако сыворотка и пенициллин/стрептомицин могут быть дополнены на основе взаимодействия между пользователями по мере необходимости.

2. За день до процедуры, описанной в 3

  1. Фактор роста оттаивания снижает базальную мембрану (BME; см. Таблицу материалов) в течение ночи в течение не менее 12 ч перед использованием в холодильнике с температурой 4 °C или в холодильной камере. При необходимости дозируйте BME в 1 мл аликвот в одноразовой полипропиленовой трубке объемом 1,5 мл, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.
  2. Поместите фильтрованные наконечники пипеток в холодильник с температурой 4 °C или в холодную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел относится к наконечникам пипеток, которые будут использоваться при обработке BME для предотвращения преждевременной полимеризации и уменьшения покрытия BME на поверхности наконечников.
  3. Стерилизуйте все хирургическое оборудование, необходимое для процедуры.

3. Генерация органоидов опухоли мочевого пузыря

ПРИМЕЧАНИЕ: Это начальный этап для установления ПДО из опухолей первичного пациента. Эта процедура адаптирована для тканей рака мочевого пузыря из методов, установленных Gao et al.24.

  1. Используйте капюшон биологической опасности класса II для подготовки образца. Извлеките сухой и влажный лед и распечатайте лист обработки образцов пациента (дополнительный файл).
  2. Вызовите исследовательский персонал в операционную, когда хирургическая резекция близка к завершению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, что пациент соответствует критериям приемлемости и подписал форму согласия участника. Ткань предоставляется для исследования только при превышении требований к клинической гистопатологической оценке.
  3. Соберите свежий макроскопически жизнеспособный образец опухоли после операции. Убедитесь, что образец погружен в транспортную среду (либо 1x adDMEM/F12, либо 1x фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS)) в стерильную коническую трубку объемом 50 мл или банку для образцов мочи во время транспортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых клинических центрах ткань может потребоваться транспортировать в лабораторию патологии для выделения для исследования. В этих условиях рекомендуется добавлять в транспортную среду антибиотики и антимикотики. Ткань может храниться при 4 °C в базальной среде до 24 часов после операции и по-прежнему генерировать жизнеспособные органоидные культуры.
  4. Запишите детали образца, включая вес ткани (г или мг), описание образца и сведения о любых образцах крови и мочи в листе обработки образцов пациента (дополнительный файл).
  5. Осторожно удалите транспортную среду и замените ее 10 мл базальной среды. Позвольте опухолевой ткани осесть под действием силы тяжести.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортная среда считается клиническими отходами и должна быть собрана в надлежащим образом маркированный контейнер для отходов в соответствующем количестве дезактивационного раствора. После того, как жидкость была химически обеззаражена, она может быть утилизирована в соответствии с институциональными руководящими принципами для опасных отходов.
  6. Удалить опухолевую ткань щипцами и поместить ее в стерильную 90-миллиметровую чашку Петри (рисунок 2А). Запишите вес ткани в мг или г на листе обработки клинического образца и сетке рассечения (рисунок 2B).
  7. Удалите нераковую ткань (включая жировую ткань) и макроскопически видимые некротические области с помощью стерильных щипцов и одноразовых лезвий скальпеля, установленных на рукоятке скальпеля (рисунок 2C). Промыть опухолевые кусочки 1-2 раза холодным 1x DPBS. Соберите кусочки опухоли и перенесите их в новую стерильную 90 мм чашку Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лезвия скальпеля острые, будьте осторожны при ручной нарезке. Прилегающая к опухоли жировая ткань может быть идентифицирована по отчетливо мягким, желатиновым, бледным участкам, непосредственно прилегающим к визуальному периметру опухоли. Макроскопическая жировая ткань и очаговые темные области, представляющие области некроза, потребуют личного суждения при рассечении биопсии опухоли эксцизионного мочевого пузыря.
  8. Сделайте фотографию, нарисуйте диаграмму ткани и спланируйте рассечение ткани на сетке клинической обработки (рисунок 2B и рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вести визуальный учет и приблизительный набросок отдельных макроскопических характеристик опухоли и рассечения для каждого конкретного случая.
  9. Рассечение кусочков опухолевой ткани и выделение для гистопатологического (рисунок 2D) и молекулярного анализов (рисунок 2E).
    1. Для гистологического анализа: Поместите приблизительно 50 мг опухолевой ткани в меченую одноразовую пластиковую гистологическую кассету (рисунок 2D). Погрузите гистологическую кассету в контейнер с объемом от 5 до 10% нейтрального буферизованного формалина (NBF). Инкубируйте на ночь в RT.
    2. Удалить 10% NBF и заменить 70% (мас./мас.) этанолом на следующий день для хранения при 4 °C до тех пор, пока ткань не будет обработана с использованием обычного протокола обработки тканей
    3. Для молекулярного анализа: Заморозить по меньшей мере один кусок опухолиразмером 1-3 мм3 в криовиале без РНКазы/ДНКазы 1,5 мл с использованием жидкого азота и хранить при -80 °C (рисунок 2E).
  10. Дозировать 5 мл органоидной среды (таблица 1) в 90 мм чашку Петри, содержащую оставшийся опухолевый кусок (кусочки).
  11. Механически измельчите ткань как можно тоньше (0,5-1 мм3 штуки или меньше) стерильным лезвием скальпеля No10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более крупным фрагментам или целым кускам ткани (>3 мм3) потребуется значительно больше времени для переваривания и снизит жизнеспособность образца. Опустите вышеуказанный шаг, если ткань дезагрегирована и фрагменты достаточно малы, чтобы пипетку с серологическим наконечником пипетки объемом 5 мл.
  12. Переложите мелко измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 мл и добавьте 4 мл органоидной среды, 1 мл 10-кратной коллагеназы/гиалуронидазы и 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы 1 (ДНКазы 1), чтобы избежать слипания клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фермента должен быть свежеприготовлен каждый раз. Увеличьте объем среды примерно в 10 раз больше видимого количества фрагментов опухоли для больших образцов.
  13. Инкубируют измельченную опухолевую ткань и раствор фермента в течение 1-2 ч на орбитальном шейкере или ротаторе (150 об/мин) в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) для диссоциации фрагментов в клеточную суспензию и разрушения коллагенов. Это можно проверить с помощью гистологического анализа (рисунок 3А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество ткани велико или через 1-1,5 ч наблюдается явная диссоциация, увеличивайте время инкубации, проверяя уровень диссоциации каждые 30 мин. Сроки этого шага зависят от выборки и каждый раз должны определяться эмпирически. Заметно более прозрачный раствор с неразличимыми глазу фрагментами тканей (или очень небольшим количеством фрагментов) свидетельствует об успешном пищеварении.
  14. Прекращают пищеварение добавлением к образцу 2x объема (20 мл) базальной среды.
  15. Центрифугируйте образец при 261 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), аспирируйте и выбросьте супернатант.
  16. Для лизирования загрязняющих эритроцитов (эритроцитов) повторно суспендируют гранулы, полученные на вышеуказанной стадии, в 5 мл аммоний-хлоридно-калийного (ACK) буфера. Инкубируйте трубку на RT в течение 3 мин или до тех пор, пока не будет виден полный лизис эритроцитов (суспензия станет прозрачной).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эритроциты не наблюдаются в виде небольшого красного комка в грануле, этот этап может быть опущен.
  17. Добавьте в пробирку 20 мл базальной среды. Центрифугируйте трубку при 261 х г в течение 5 мин при РТ и аспирируйте супернатант.
  18. На этом этапе поместите 10 мл аликвоты 2x и 1x органоидной среды в водяную баню 37 °C для нагревания.
  19. Отфильтруйте образец через предварительно влажный реверсивный сетчатый фильтр 100 мкм в новую трубку объемом 50 мл для удаления крупного нерастворимого материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большой непереваренный материал (>100 мкм), собранный фильтром, может содержать интересующие клетки и может быть культивирован в 90-миллиметровой чашке Петри или 6-луночной клеточной культуральной пластине в органоидной среде для получения 2D-культур (фиг.1 (этап 5) и фиг.3В).
  20. Фильтруйте элюат через предварительно влажный обратимый сетчатый фильтр 37 мкм для сбора отдельных клеток и небольших кластеров для изоляции одноклеточных и иммунных клеток (трубка 37-1; Рисунок 1 (шаг 6) и рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход опухолевых клеток на этом этапе может быть увеличен путем повторного пропускания фильтрованной клеточной суспензии через ситечко.
  21. Переверните сетчатый фильтр 37 мкм и используйте 10 мл базальных сред для сбора кластеров малого и среднего размера (37-100 мкм) (трубка 70-1; Рисунок 3B).
  22. Доливайте каждую из новых 50 мл трубок (трубки 70-1 и 37-1) DPBS до 40 мл. Центрифугируют суспензию при 261 х г в течение 5 мин при РТ. Аспирируют и выбрасывают супернатант.
  23. Добавьте 10 мл базальной среды в трубку 37-1 и подсчитайте ячейки с помощью красителя трипанового синего исключения и автоматизированного счетчика клеток (в соответствии со спецификациями производителя). Определите количество клеток и жизнеспособность клеток.
  24. Центрифугируют оставшуюся часть образца при 261 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте среду и замените ее клеточным замораживанием раствором или базальной средой, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и 10% диметилсульфоксида (DMSO).
  25. Поместите образцы в криовиалы объемом 1,5 мл и храните их в контейнере для замораживания клеток. Немедленно переложите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C для оптимальной скорости охлаждения. После ночного хранения в морозильной камере при -80 °C переведите криовиалы в криогенную жидкость или хранение воздушной фазы (-196 °C) для длительного хранения.
  26. Повторное суспендирование клеток из трубки 70-1 с 500 мкл предварительно нагретой 2x органоидной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева должна быть высокой для успешного размножения органоидов. Объем органоидной среды и, следовательно, BME должны быть изменены эмпирически на количество клеток, выделенных из стадии фильтрации. Этот шаг обеспечивает соответствующую отправную точку, основанную на исследованиях в нашей лаборатории.
  27. Добавьте BME к клеткам (в соотношении 1:1 с 2x органоидной средой) с помощью ледяных стерильных фильтрующих наконечников пипеток P1000 и осторожно перемешайте, чтобы суспендировать клетки. Быстро и осторожно пипетка 100 мкл восстановленных ячеек/смеси BME в скважины сверхнизкой прикрепленной плоскодонной 96-луночной пластины. Поместите 96-луночную пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 20-30 мин для затвердевания.
  28. Добавьте соотношение 1:2 1x органоидной среды поверх суспензии клеток BME в зависимости от эмпирически оцененного объема. В соответствующей отправной точке добавляют 50 мкл 1x органоидной среды поверх 100 мкл восстановленных клеток/смеси BME.
  29. Поместите 96-луночную пластину в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 20 мин для уравновешивания.
  30. Достаньте пластинку для культивирования клеток из инкубатора и соберите ее на держателе образца на сцене микроскопа. Оцените органоиды визуально в условиях фазового контраста или яркого поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения лучше всего получать с помощью перевернутого фазоконтрастного микроскопа, оснащенного дифференциальной интерференционной (DIC) оптикой, цифровой камерой и связанным с ней программным обеспечением для наблюдения за формированием сферических PDO при подготовке к анализу конечных точек.
    1. Если видны отдельные кластеры, поместите пластину культуры клеток в камеру микроскопа с электронным нагревом на сцене (37 °C, 5% CO2) для визуализации живых клеток в течение первых 24-72 ч.
    2. Убедитесь, что гибкий нагреваемый воротник прикреплен к линзе, чтобы уменьшить тепловой дрейф, а увлажнитель заполнен dH2O.
    3. Выполните начальное изображение с помощью объектива 4x или 10x (N.A. 0.30, W.D. 15.2 мм). Замедленная съемка каждые 5-10 мин на фазоконтрастной установке.
    4. Проверьте успешность изоляции, характеризующейся появлением >10 самоорганизующихся органоидов через 24-72 ч.
    5. Позвольте культурам продолжаться до двух недель, если количество органоидов низкое (рисунок 3C).
  31. Доливайте среду каждые 2-3 дня, используя 50 мкл предварительно подогретой органоидной среды, чтобы восполнить истощенные факторы роста и общий объем.
  32. Получение изображений (как описано в шаге 3.30) в дни 1, 2 и 3 (покадровые ряды) и в дни 5, 7 и 10 перед прохождением (если применимо).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды (наблюдаемые как обычно круглые структуры, где вы не можете видеть края отдельных клеток) обычно проходят через 7-10 дней после установки, в зависимости от успеха изоляции. До или после пассажа органоиды можно лечить цитотоксиками или терапевтическими агентами в течение 6 дней, а реакцию на лекарство измерять с помощью анализов жизнеспособности клеток и цитотоксичности. Альтернативно, органоиды могут быть извлечены из BME (с использованием диспазы 1 мг / мл) и криоконсервированы (биобанк, подготовлены для молекулярного тестирования или внедрены и оценены гистологически (рисунок 4).

Результаты

3D-органоиды были успешно установлены из тканей TURBT и цистэктомии пациента с раком мочевого пузыря человека. Вкратце, этот метод подчеркивает быстрое формирование 3D-многоклеточных структур, которые являются жизнеспособными и подходящими для других анализов конечных точек, таких как ги...

Обсуждение

В то время как 3D-органоидные протоколы, полученные из ткани рака мочевого пузыря, все еще находятся в зачаточном состоянии, они являются областью активных исследований и клинических исследований. Здесь подробно описан оптимизированный протокол для успешного установления PDO рака мочев...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за техническую помощь Института трансляционных исследований гистологии и Фонда биологических ресурсов. Это исследование было поддержано финансированием из премии Исследовательского фонда принцессы Александры (I.V., E.D.W.) и Программы быстрого перевода прикладных исследований Фонда медицинских исследований будущего (MRFF) (Центр персонализированного анализа рака (CPAC; Е.Д.В., И.В.). Институт трансляционных исследований получает поддержку от правительства Австралии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.2 mL cryogenic vialCorning430487
1.5 mL Eppendorf tubesSigma-AldrichT9661-500EApolypropylene single-use tube
100 µM reversible strainerSTEMCELL Technologies#27270
100 mm Petri dishCorning430167
10x Collagenase/ HyaluronidaseSTEMCELL Technologies#07912
37 µM reversible strainerSTEMCELL Technologies#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tubeCorningCLS430829-500EA
6-well plateCorningCLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)Sigma-AldrichCLS3474-24EA
A 83-01BioScientific2939Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis bufferSTEMCELL Technologies#07850
adDMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634028Base medium
Animal-free recombinant EGFSigma-Aldrich518179Growth factor
Automated cell counter (TC20)Bio-rad1450102
B27 additiveGibco17504044Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting SlidesBio-rad1450015
CentrifugeEppendorfEP022628188
Computer system
CryoStor CS10STEMCELL Technologies#07930Cell freezing solution
Dispase II, powderThermofisher17105041To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1STEMCELL Technologies#07900
DPBSThermofisher14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%SigmaHT501128Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)Invitrogen35050061Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPESGibco15630-080All-purpose buffer
Histology cassetteProSciTechRCH44-W
Human FGF-10Peprotech100-26-25Growth factor
Human FGF-2Peprotech100-18B-50Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)In Vitro Technologies356231Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing containerThermoFisher5100-0001cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)SigmaA7250Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
NicotinamideSigmaN0636-100GSIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscopeNikonMFA510BB
NIS-Elements Advanced ResearchNikonMQS31000
Noggin conditioned mediaIn-houseBMP inhibitor
Pipetboy acu 2Integra155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
PrimocinJomar Bioscienceant-pm2Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)Tocris2296support proliferation of cells
Rotary tube mixerRatekRSM7DC
R-spondin 1 conditioned mediaIn-houseWNT signalling regulator
SB202190Jomar Biosciences1077-25mgSelective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handleLivingstoneWBLDHDL03
Scalpels, #11 bladeMedical and Surgical RequisitesEU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste BagsMedical SearchSU09125X16
Urine specimen jar
Y27632Jomar Biosciences1049-10mgSelective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells

Ссылки

  1. Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
  2. Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
  3. Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
  4. Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
  5. Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
  6. Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
  7. Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
  8. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  9. lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
  10. Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
  11. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  12. Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
  13. Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
  14. Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
  15. Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
  16. Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
  17. Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
  18. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  19. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  20. Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
  21. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  22. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  23. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  24. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  25. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  26. Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
  27. Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
  28. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
  29. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  30. Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
  31. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  32. Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
  33. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
  34. Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены