JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью данного протокола является описание доклинической животной модели хориоамнионита, индуцированного стрептококком группы В (СГБ). Целью исследования является изучение механистических процессов, потенциальных причинно-следственных связей с нарушениями развития и, наконец, разработка трансляционных противовоспалительных плаценто- и нейропротекторных методов лечения.

Аннотация

Стрептококк группы В (СГБ) является одной из наиболее распространенных бактерий, выделяемых во время беременности человека. Это основная причина плацентарной инфекции/воспаления, называемой хориоамнионитом. Хориоамнионит подвергает развивающийся плод высокому риску повреждения органов, перинатальной заболеваемости и смертности, а также пожизненных нейроповеденческих нарушений и других неневрологических проблем развития. Двумя наиболее частыми подтипами изолятов СГБ из тканей матери и плода являются серотипы Ia (13%-23%) и III (25%-53%). Наша лаборатория разработала и охарактеризовала модель хориоамнионита, вызванного СГБ, на крысах для изучения последующих воздействий на центральную нервную систему развивающегося плода и понимания лежащих в ее основе механистических аспектов. В данной статье представлен дизайн, а также использование доклинической модели крысы, которая в точности воспроизводит отличительный признак СГБ-индуцированного хориоамнионита у человека. Цель этой статьи — помочь ученым воспроизвести план эксперимента, а также предоставить поддержку с помощью примеров устранения неполадок. Настоящая модель также может способствовать потенциальным открытиям за счет раскрытия причин, механизмов и новых терапевтических путей, которые остаются нерешенными при многих нарушениях развития, возникающих в результате хориоамнионита. Кроме того, использование этой модели может быть распространено на исследования перинатальных неневрологических общих и тяжелых заболеваний, затрагивающих, например, сетчатку, кишечник, легкие и почки. Основной интерес данного исследования связан с СГБ-индуцированными нарушениями развития нервной системы плода, такими как церебральный паралич (ДЦП), синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и расстройства аутистического спектра (РАС). В данной статье представлено обоснование этой модели, а также процедуры и результаты.

Введение

Материнская иммунная активация (MIA) была описана как один из наиболее важных независимых факторов риска преждевременных родов, смерти плода и пожизненных когнитивных и поведенческих нарушений у потомства 1,2,3,4. Большая часть существующих доклинических исследований о роли гестационного воспаления в плаценте и исходах развития использует компоненты патогенов, такие как липополисахарид (ЛПС) из E. coli и синтетический аналог вирусной двухцепочечной РНК, полиинозиновую: полицитидиловую кислоту (Poly[I: C]), которые имитируют вирусные инфекции. Однако, несмотря на то, что стрептококк группы В (СГБ) является наиболее частой причиной перинатальной инфекции, лишь немногие животные модели рассматривали его роль в воспалительных механизмахи исходах.

СГБ представляет собой инкапсулированный грамположительный кокк, который колонизирует нижние отделы половых путей примерно у 15-30% беременных женщин6. Это приводит к плацентарной инфекции/воспалению, называемому хориоамнионитом 7,8. Из десяти серотипов СГБ два наиболее частых серотипа Ia и III являются основными инфекционными детерминантами повреждений в тканях матери и плода 9,10. Было показано, что инфекция СГБ приводит к более высокой воспалительной реакции в крови плода и плацентарной недостаточности, которые, как предполагается, участвуют в множественных нарушениях развития нервной системы, таких как церебральный паралич (ДЦП), синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и расстройства аутистического спектра (РАС)5,11.

За последние десять лет мы разработали модель СГБ-индуцированного хориоамнионита на крысах, который приводит к различным нарушениям развития у потомства12. Эта доклиническая модель демонстрирует причинно-следственную связь между СГБ-индуцированным воспалением плаценты и рядом специфических для пола нарушений развития нервной системы у потомства 13,14,15. Цель данной статьи – дать читателям представление о разработке доклинической модели инфекции в конце гестационного периода и вызванных ею нейроповеденческих нарушений у потомства. Настоящий протокол направлен на имитацию клинической реальности хориоамнионита, вызванного СГБ.

Результаты этой доклинической модели показывают, что внутрибрюшинная (IP) инокуляция СГБ в конце гестационной беременности (рис. 1) приводит к (i) плацентарной инфекции и воспалению, удовлетворяя диагностическим критериям хориоамнионита16; (ii) массивная апрегуляция IL-1β и последующих воспалительных молекул из пути IL-1 в плаценте12; (iii) нарушения развития нервной системы у потомства12; (iv) половые различия в иммунных реакциях и последующие нейроповеденческие нарушения, такие как признаки СДВГ у взрослых особей, в то время как у потомства мужского пола наблюдаются ранние и длительные черты, подобные РАС; (v) различные нейроповеденческие исходы у потомства в зависимости от серотипа СГБ, используемого для индуцирования хориоамнионита 14,15. В соответствии с этими выводами, основными следующими шагами с использованием этой модели будут проверка, во-первых, роль андрогена в хориоамнионите, вызванном СГБ, и, во-вторых, плацентарная и нейропротекторная роль молекул, нацеленных на конкретные воспалительные пути, в надежде довести некоторые из этих молекул до порога терапевтических клинических испытаний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты были одобрены Научно-исследовательским институтом Центра здоровья Университета Макгилла (RI-MUHC). Все эксперименты проводились в соответствии с данными Канадского совета по уходу за животными.

1. Беременные крысы Льюиса

  1. Получите крыс Льюиса из коммерческих источников на день беременности (G)14. Содержать их в соответствующем помещении для содержания животных (RI-MUHC animal facility) в контролируемой среде при температуре 20-23 °C с 12-часовым циклом света/темноты и доступом к воде и пище в неограниченном количестве.
  2. Ежедневно взвешивайте дамбы, чтобы выявить любые проявления болезни с G14 (т.е. день прибытия) до G22 (т.е. день кесарева сечения)

2. Рост бактерий

  1. На G18 приготовьте две стерильные пробирки с 5 мл стерильного бульона Brain Heart Infusion (BHI). Возьмите небольшую порцию замороженного бактериального запаса (β-гемолитический капсульный серотип Ia в BHI и 15% глицерина14) при температуре -80 °C и добавьте его в пробирки BHI объемом 5 мл (рис. 2).
  2. Поместите трубки в шейкер (240 об/мин) на 18 часов при температуре 37 °C.
  3. На G19 приготовьте 3% раствор GBS в стерильном бульоне BHI, собрав 1,5 мл инкубированного раствора в 48,5 мл стерильного бульона BHI.
  4. Соберите 1,5 мл 3% раствора GBS плюс BHI в кювету. С помощью спектрофотометра запишите начальное поглощение как T0 (оптическая плотность (OD) 600 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для балансировки спектрофотометра каждый раз использовалась заготовка, изготовленная из стерильного бульона BHI.
  5. Поместите 3% раствор в инкубатор при температуре 37 °C и встряхивайте со скоростью 240 об/мин в течение примерно 2 ч. Проверяйте абсорбцию каждые 20 мин через 2 ч до тех пор, пока не будет достигнута мера абсорбции от 0,6 до 0,8 (наружный диаметр600 нм).
  6. После достижения желаемой абсорбции соберите 20 мл 3% раствора GBS плюс BHI и добавьте его в пробирку объемом 50 мл.
  7. Центрифугируйте (1792 x g) образцы при 4 °C в течение 13 мин и дважды промойте осажденный GBS 20 мл 0,9% стерильного физиологического раствора.
  8. Суспендировать осажденный СГБ в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора. Держите эту аликвоту на льду до момента инъекции.
  9. Вводите (внутрибрюшинно) контрольной группе 100 мкл стерильного 0,9% физиологического раствора и группе СГБ 100 мкл β-гемолитического серотипа Ia СГБ, суспендированного в стерильном 0,9% физрастворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводимая доза составляла 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) СГБ или физиологического раствора (для контроля). Инокуляция 108КОЕ хорошо зарекомендовала себя в качестве модели хориоамнионита человека. Инокуляция более высокой дозой СГБ, скорее всего, приведет к гибели самок. Инъекция меньше указанной дозы не будет имитировать инфекцию и воспаление.
  10. Сделайте разведения от 10-5 до 10-10 и нанесите разведения в трех размерах на пластины агара BHI. Чтобы исключить загрязнение, проведите два отрицательных контроля (без добавления вещества), один на агаровой пластине BHI, а другой на агаровой пластине CHROMID Strepto B. Сделайте два положительных контроля, поместив подготовленные бактерии на агаровую пластину BHI и агаровую пластину CHROMID Strepto B. Поместите все тарелки в инкубатор на ночь при температуре 37 °C (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агаровые пластины CHROMID Strepto B являются селективной средой для скрининга СГБ, на котором колонии СГБ выглядят красными.

3. Техника инъекций

  1. На G19 аккуратно выньте крысу из клетки и положите ее на ровную поверхность. Обездвижите крысу, накрыв голову и верхнюю часть тела полотенцем. Поднимите заднюю ногу, чтобы обеспечить легкий доступ к месту инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что подходящая анатомическая область для инъекции находится в нижнем правом квадранте брюшной полости, чтобы избежать прокола таких органов, как мочевой пузырь и слепая кишка (Рисунок 1).
  2. Используйте инсулиновый шприц U-100 с иглой 29 г 1/2 дюйма. Вставьте скос иглы вверх по направлению к головке под углом 40-45° к горизонтали, как показано на рисунке 1. Выполните инъекции GBS один раз для каждой плотины. Обязательно выполняйте инъекции каждые 1 ч, чтобы избежать эффекта времени между привитыми плотинами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции следует варьировать между левой и правой сторонами в дни, когда выполняется более одной инъекции в день.

4. Определение дозы

  1. На G20 проверьте четыре контрольных элемента (шаг 10.2) и подсчитайте колонии бактерий на каждой агаровой пластине BHI.
  2. Рассчитайте среднее количество колоний СГБ для каждого фактора разведения (от 10-5 до 10-10), чтобы определить точную введенную дозу СГБ

5. Кесарево сечение и забор тканей

  1. Выполните кесарево сечение на G22 (через 72 ч после инъекции) и выполняйте последующие операции с интервалом 1 ч между плотинами в зависимости от времени прививки каждой плотины.
  2. Обезболить даму в камере эвтаназии 2% изофлураном и 1,5%О2 для общей анестезии.
  3. Поместите коффердам на грелку, покрытую соответствующей хирургической повязкой, и нанесите офтальмологическую мазь на глаз, чтобы избежать высыхания.
  4. Подготовьте операционную зону, удалив волосы в нижней части живота с помощью лезвия или скальпеля.
  5. Очистите операционную область стерильной марлей, смоченной дезинфицирующим средством.
  6. С помощью стерильного скальпеля и ножниц с тонким наконечником сделайте горизонтальный разрез в нижней части живота крысы. Сделайте вертикальный разрез по обе стороны живота, чтобы выявить нижележащие органы.
  7. Отделите образцы плаценты от плодов. Запишите вес плода, плаценты и соотношение плода и плаценты.
  8. С помощью стерильного скальпеля разрежьте плаценту на две половинки.
    1. Используйте 2-метилбутан для быстрой заморозки половины плаценты и поддерживайте при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется для определения уровня белка с помощью иммуноферментного анализа.
    2. Зафиксировать вторую половину плаценты в 4% буферном формальдегиде для анализа in situ с помощью иммуногистохимии (ИГХ) для изучения экспрессии СГБ и полиморфноядерных клеток (ПМН) в собранных плацентах.
  9. Обезглавливайте для сбора крови из живых плодов и переноса крови в пробирки-сепараторы с гелем лития и гепарина.
  10. Центрифуга (18 928 x g) выводит образцы крови при температуре 4 °C для отделения плазмы и хранит образцы плазмы при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные образцы плазмы крови плода будут использоваться для ИФА для проверки уровня белка различных цитокинов в крови плода.
  11. Соберите хвосты плода для определения пола плода путем амплификации последовательности в гене SRY с использованием следующих праймеров (прямой праймер: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; обратный праймер: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'), как описано ранее18.
  12. С помощью иглы 5 мл 23 G соберите кровь из плотины с помощью пункции сердца, чтобы проверить и сравнить уровни различных цитокинов в крови матери с таковыми в крови плода. Усыпляют плотины методом прокола диафрагмы и обезглавливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Между животными очистите все используемые инструменты стерильной тканью и стерильным физиологическим раствором. Для проведения невропатологических и поведенческих исследований на потомстве, самки естественным образом рожали G23. После усыпления потомства на 80-й день после рождения (ПН) был собран мозг для молекулярных и гистологических исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Инокуляция IP-инфекции СГБ привела к плацентарной инфекции
Иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) (с использованием поликлональных антител, нацеленных на СГБ серотипа Ia) показало, что инфекция СГБ достигла децидуального компартмента плаценты. Инфекция та...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Несколько этапов протокола имеют решающее значение и требуют некоторого контроля качества. Например, существует риск заражения популяции СГБ другими патогенами. Это может быть быстро идентифицировано с помощью соответствующ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов отсутствует финансовый конфликт интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Научно-исследовательским институтом Центра здоровья Университета Макгилла (RI-MUHC), Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR). Это исследование стало возможным благодаря следующим финансирующим агентствам, учреждениям и фондам: Канадскому институту исследований в области здравоохранения (CIHR), Фонду звезд, Фонду исследований Квебека (FRQS), Университету Макгилла и Шербрукскому университету. Большое спасибо доктору Клэр Пойарт из Университета Дени Дидро (Париж VII), Франция, и доктору Мариэле Сегура из Университета Монреаля, Канада, за щедрые пожертвования GBS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL sterile tubeBD Biosciences
50 ml falcon tubesThermo Fisher339652
Blade or scalpelBD Medical371716
Brain Heart Infusion BrothCriterion (Hardy diagnostics)C5141
CHROMID Strepto B agar plateBioMerieux, Saint-Laurent43461
Columbia blood agar 5 % with sheep blood mediumThermo ScientificR01215
Forward primer5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'Sigma
Insulin syringeBecton, Dickinson and Co(BD)324702
Lewis ratsCharles River Laboratories
MethylbutanSigma AldrichM32631
Microtainer blood collection tubesBecton, Dickinson and Co(BD)365965
Reverse primer5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'Sigma
Serological Pipettes 1 MLThermo Fisher170353N
Serological Pipettes 10 MLThermo Fisher170356N
Serological Pipettes 25 MLThermo Fisher170357N
Serological Pipettes 5 MLThermo Fisher170355N
Superfrost Plus Micro Slide, PremiumVWRCA48311-703

Ссылки

  1. Hui, C. W., et al. Prenatal immune challenge in mice leads to partly sex-dependent behavioral, microglial, and molecular abnormalities associated with schizophrenia. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 13(2018).
  2. Costa, A., et al. Activation of the NLRP3 inflammasome by group B streptococci. Journal of Immunology. 188 (4), 1953-1960 (2012).
  3. Gupta, R., et al. RNA and beta-hemolysin of group B Streptococcus induce interleukin-1beta (IL-1beta) by activating NLRP3 inflammasomes in mouse macrophages. Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 13701-13705 (2014).
  4. Henneke, P., et al. Lipoproteins are critical TLR2 activating toxins in group B streptococcal sepsis. Journal of Immunology. 180 (9), 6149-6158 (2008).
  5. Nelson, K. B., Chang, T. Is cerebral palsy preventable. Current Opinion in Neurology. 21 (2), 129-135 (2008).
  6. Larsen, J. W., Sever, J. L. Group B Streptococcus and pregnancy: a review. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (4), 440-448 (2008).
  7. Patras, K. A., Nizet, V. Group B Streptococcal maternal colonization and neonatal disease: molecular mechanisms and preventative approaches. Frontiers in Pediatrics. 6, 27(2018).
  8. Tita, A. T., Andrews, W. W. Diagnosis and management of clinical chorioamnionitis. Clinics in Perinatology. 37 (2), 339-354 (2010).
  9. Teatero, S., et al. Serotype distribution, population structure, and antimicrobial resistance of Group B Streptococcus strains recovered from colonized pregnant women. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 412-422 (2017).
  10. Lu, B., et al. Microbiological and clinical characteristics of Group B Streptococcus isolatescausing materno-neonatal infections: high prevalence of CC17/PI-1 and PI-2b sublineage in neonatal infections. Journal of Medical Microbiology. 67 (11), 1551-1559 (2018).
  11. Limperopoulos, C., et al. Positive screening for autism in ex-preterm infants: prevalence and risk factors. Pediatrics. 121 (4), 758-765 (2008).
  12. Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic-like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Developmental Neuroscience. 35 (6), 504-515 (2013).
  13. Giraud, A., et al. Ampicillin treatment increases placental Interleukin-1 beta concentration and polymorphonuclear infiltration in Group B Streptococcus-induced chorioamnionitis: A preclinical study. Neonatology. 117 (3), 369-373 (2020).
  14. Allard, M. J., et al. A sexually dichotomous, autistic-like phenotype is induced by Group B Streptococcus maternofetal immune activation. Autism Research. 10 (2), 233-245 (2017).
  15. Allard, M. J., Giraud, A., Segura, M., Sebire, G. Sex-specific maternofetal innate immune responses triggered by group B Streptococci. Scientific Reports. 9 (1), 8587(2019).
  16. Allard, M. J., Brochu, M. E., Bergeron, J. D., Segura, M., Sebire, G. Causal role of group B Streptococcus-induced acute chorioamnionitis in intrauterine growth retardation and cerebral palsy-like impairments. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 10 (5), 595-602 (2019).
  17. Girard, S., Tremblay, L., Lepage, M., Sebire, G. IL-1 receptor antagonist protects against placental and neurodevelopmental defects induced by maternal inflammation. Journal of Immunology. 184 (7), 3997-4005 (2010).
  18. Bergeron, J., et al. Activation of the IL-1beta/CXCL1/MMP-10 axis in chorioamnionitis induced by inactivated Group B Streptococcus. Placenta. 47, 116-123 (2016).
  19. Allard, M. J., Brochu, M. E., Bergeron, J. D., Sebire, G. Hyperactive behavior in female rats in utero-exposed to group B Streptococcus-induced inflammation. International Journal of Developmental Neuroscience. 69, 17-22 (2018).
  20. Shuster, K. A., et al. Naturally occurring disseminated group B streptococcus infections in postnatal rats. Comparative Medicine. 63 (1), 55-61 (2013).
  21. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  22. Noble, K., et al. Group B Streptococcus cpsE is required for Serotype V capsule production and aids in biofilm formation and ascending infection of the reproductive tract during pregnancy. ACS Infectious Diseases. 7 (9), 2686-2696 (2021).
  23. Kim, C. J., et al. Acute chorioamnionitis and funisitis: definition, pathologic features, and clinical significance. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213, 29-52 (2015).
  24. Becker, K. J. Strain-related differences in the immune response: Relevance to human stroke. Translational Stroke Research. 7 (4), 303-312 (2016).
  25. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  26. Fernandez de Cossio, L., Guzman, A., vander Veldt, S., Luheshi, G. N. Prenatal infection leads to ASD-like behavior and altered synaptic pruning in the mouse offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 88-98 (2017).
  27. Shi, L., Fatemi, S. H., Sidwell, R. W., Patterson, P. H. Maternal influenza infection causes marked behavioral and pharmacological changes in the offspring. The Journal of Neuroscience. 23 (1), 297-302 (2003).
  28. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  29. Girard, S., Kadhim, H., Beaudet, N., Sarret, P., Sebire, G. Developmental motor deficits induced by combined fetal exposure to lipopolysaccharide and early neonatal hypoxia/ischemia: a novel animal model for cerebral palsy in very premature infants. Neuroscience. 158 (2), 673-682 (2009).
  30. Meyer, U., Feldon, J. To poly(I:C) or not to poly(I:C): advancing preclinical schizophrenia research through the use of prenatal immune activation models. Neuropharmacology. 62 (3), 1308-1321 (2012).
  31. Lammert, C. R., Lukens, J. R. Modeling autism-related disorders in mice with Maternal Immune Activation (MIA). Methods. Journal of Molecular Biology. 1960, 227-236 (2019).
  32. Gundling, W. E., Wildman, D. E. A review of inter- and intraspecific variation in the eutherian placenta. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 370 (1663), 20140072(2015).
  33. Harrell, M. I., et al. Exploring the pregnant guinea pig as a model for Group B Streptococcus intrauterine infection. The Journal of Infectious Diseases. 2 (2), (2017).
  34. Redline, R. W. Classification of placental lesions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213, 21-28 (2015).
  35. Erez, O., et al. Differential expression pattern of genes encoding for anti-microbial peptides in the fetal membranes of patients with spontaneous preterm labor and intact membranes and those with preterm prelabor rupture of the membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 22 (12), 1103-1115 (2009).
  36. Burns, C., Hall, S. T., Smith, R., Blackwell, C. Cytokine levels in late pregnancy: Are female infants better protected against inflammation. Frontiers in Immunology. 6, 318(2015).
  37. Elsmen, E., Ley, D., Cilio, C. M., Hansen-Pupp, I., Hellstrom-Westas, L. Umbilical cord levels of interleukin-1 receptor antagonist and neonatal outcome. Biology of the Neonate. 89 (4), 220-226 (2006).
  38. Chuang, K. H., et al. Neutropenia with impaired host defense against microbial infection in mice lacking androgen receptor. Journal of Experimental Medicine. 206 (5), 1181-1199 (2009).
  39. Mantalaris, A., et al. Localization of androgen receptor expression in human bone marrow. The Journal of Pathology. 193 (3), 361-366 (2001).
  40. Rasmussen, J. M., et al. Maternal Interleukin-6 concentration during pregnancy is associated with variation in frontolimbic white matter and cognitive development in early life. Neuroimage. 185, 825-835 (2019).
  41. Dozmorov, M. G., et al. Associations between maternal cytokine levels during gestation and measures of child cognitive abilities and executive functioning. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 390-397 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены