JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Эти протоколы помогут пользователям исследовать энергетический метаболизм митохондрий в 3D-сфероидах, полученных из клеточных линий рака, с использованием анализа внеклеточного потока Seahorse.

Аннотация

Трехмерные (3D) клеточные агрегаты, называемые сфероидами, стали авангардом клеточной культуры in vitro в последние годы. В отличие от культивирования клеток в виде двумерных одноклеточных монослоев (2D-культура), сфероидная клеточная культура способствует, регулирует и поддерживает физиологическую клеточную архитектуру и характеристики, которые существуют in vivo, включая экспрессию белков внеклеточного матрикса, клеточную сигнализацию, экспрессию генов, производство белка, дифференцировку и пролиферацию. Важность 3D-культуры была признана во многих областях исследований, включая онкологию, диабет, биологию стволовых клеток и тканевую инженерию. За последнее десятилетие были разработаны усовершенствованные методы получения сфероидов и оценки их метаболической функции и судьбы.

Анализаторы внеклеточного потока (XF) использовались для изучения митохондриальной функции в 3D-микротизюсах, таких как сфероиды, с использованием либо пластины захвата островков XF24, либо сфероидной микропластины XFe96. Однако отдельные протоколы и оптимизация зондирования митохондриального энергетического обмена у сфероидов с использованием технологии XF подробно не описаны. В данной статье представлены подробные протоколы зондирования митохондриального энергетического обмена в одиночных 3D-сфероидах с использованием сфероидных микропластин с анализатором XFe96 XF. Используя различные линии раковых клеток, технология XF способна различать клеточное дыхание в 3D-сфероидах не только разных размеров, но и разных объемов, количества клеток, содержания и типа ДНК.

Оптимальные концентрации митохондриальных эффекторных соединений олигомицина, БАМ15, ротенона и антимицина А используются для исследования специфических параметров митохондриального энергетического метаболизма в 3D-сфероидах. В этой статье также обсуждаются методы нормализации данных, полученных от сфероидов, и рассматриваются многие соображения, которые следует учитывать при изучении сфероидного метаболизма с использованием технологии XF. Этот протокол поможет стимулировать исследования в передовых сфероидных моделях in vitro .

Введение

Достижения в области моделей in vitro в биологических исследованиях быстро прогрессировали за последние 20 лет. Такие модели теперь включают модальности «орган на чипе», органоиды и 3D-сфероиды микротизю, все из которых стали общим фокусом для улучшения трансляции между исследованиями in vitro и in vivo. Использование передовых моделей in vitro, особенно сфероидов, охватывает несколько областей исследований, включая тканевую инженерию, исследования стволовых клеток, рак и биологию заболеваний 1,2,3,4,5,6,7, и тестирование безопасности, включая генетическую токсикологию 8,9,10, токсикологию наноматериалов11, 12,13,14, и тестирование безопасности и эффективности лекарств 8,15,16,17,18,19.

Нормальная морфология клеток имеет решающее значение для биологического фенотипа и активности. Культивирование клеток в 3D-сфероиды микротизуса позволяет клеткам принимать морфологию, фенотипическую функцию и архитектуру, более похожую на ту, что наблюдается in vivo , но ее трудно захватить с помощью классических методов монослойной клеточной культуры. Как in vivo , так и in vitro клеточная функция напрямую зависит от клеточной микросреды, которая не ограничивается клеточной связью и программированием (например, образования клеточно-клеточных переходов, возможности формирования клеточных ниш); воздействие на клетки гормонов и факторов роста в непосредственной среде (например, воздействие клеточных цитокинов как часть воспалительной реакции); состав физических и химических матриц (например, выращиваются ли клетки в пластической культуре жесткой ткани или в эластичной тканевой среде); и, самое главное, как на клеточный метаболизм влияют питание и доступ к кислороду, а также переработка метаболических отходов, таких как молочная кислота.

Анализ метаболических потоков является мощным способом изучения клеточного метаболизма в определенных системах in vitro . В частности, технология XF позволяет анализировать живые изменения в клеточной биоэнергетике интактных клеток и тканей в режиме реального времени. Учитывая, что многие внутриклеточные метаболические события происходят в течение порядка секунд до минут, функциональные подходы в реальном времени имеют первостепенное значение для понимания изменений клеточного метаболического потока в реальном времени в неповрежденных клетках и тканях in vitro.

В данной статье представлены протоколы культивирования раковых клеточных линий A549 (аденокарцинома легких), HepG2/C3A (гепатоцеллюлярная карцинома), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) и SK-OV-3 (аденокарцинома яичников) в виде 3D-сфероидных моделей in vitro с использованием подходов принудительной агрегации (рисунок 1). В нем также (i) подробно описывается, как исследовать митохондриальный энергетический метаболизм одиночных 3D-сфероидов с помощью анализатора Agilent XFe96 XF, (ii) выделяются способы оптимизации анализов XF с использованием одиночных 3D-сфероидов и (iii) обсуждаются важные соображения и ограничения зондирования метаболизма 3D-сфероидов с использованием этого подхода. Самое главное, в этой статье описывается, как собираются наборы данных, которые позволяют рассчитать скорость потребления кислорода (OCR) для определения окислительного фосфорилирования и, следовательно, митохондриальной функции в клеточных сфероидах. Хотя это не анализируется для этого протокола, скорость внеклеточного подкисления (ECAR) является еще одним параметром, который измеряется вместе с данными OCR в экспериментах XF. Однако ECAR часто плохо или неправильно интерпретируется из наборов данных XF. Мы предоставляем комментарий относительно ограничений расчета ECAR в соответствии с основными подходами производителя технологии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

figure-protocol-68
Рисунок 1: Графический рабочий процесс для генерации клеточных сфероидов, анализа внеклеточного потока и последующих анализов. Четыре линии раковых клеток были селективно культивированы как монослои (А), отделены от колб тканевых культур и засеяны в сверхнизкие прикрепленные 96-луночные микропластины с образованием сфероидов (В). A549 Легочная карцинома, HepGG2/C3A печеночная карцинома, SK-OV-3 аденокарцинома яичников и MCF-7 клетки карциномы молочной железы были посеяны через 1 × 103-8 × 103 клеток / хорошо и выращены до 7 дней для формирования одиночных сфероидов и оптимизации плотности посева сфероидов и времени культивирования путем непрерывного наблюдения и планиметрических измерений. После образования одиночные сфероиды промывали в безсыворочную XF-среду и тщательно сеяли в сфероидные микропластины, предварительно покрытые поли-D-лизином (C). Сфероиды подвергали внеклеточному анализу потока с использованием анализатора XFe96 с использованием нескольких протоколов для решения: (1) оптимального размера сфероида для ответа базального митохондриального дыхания; (2) оптимизированное титрование митохондриальных респираторных ингибиторов; (3) Оптимизация размещения сфероидов в микропластинчатых скважинах. (D) Для нормализации данных и других последующих анализов in vitro использовались анализы после XF, фазоконтрастная микроскопия и количественная оценка сфероидной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Культивирование линий раковых клеток в виде 3D сфероидов in vitro

Клеточная линияОписаниеКультуральная средаИсточник
А549Клеточная линия карциномы легкихРПИ 1640Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур (ECACC)
Пируват натрия (1 мМ)
Пенициллин-Стрептомицин - (100 Ед/мл – 100 мг/мл)
10 % (об/об) FBS
HepG2/C3AКлеточная линия печеночной карциномы, клональное производное родительской клеточной линии HepG2ДМЭМАмериканская коллекция культуры тканей (ATCC)
Пенициллин-Стрептомицин - (100 Ед/мл – 100 мг/мл)
10 % (об/об) FBS
МКФ7Клеточная линия аденокарциномы молочной железыРПИ 1640Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур (ECACC)
Пируват натрия (1 мМ)
Пенициллин-Стрептомицин - (100 Ед/мл – 100 мг/мл)
10 % (об/об) FBS
СК-ОВ-3Клеточная линия аденокарциномы яичниковРПИ 1640Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур (ECACC)
Пируват натрия (1 мМ)
Пенициллин-Стрептомицин - (100 Ед/мл – 100 мг/мл)
10 % (об/об) FBS
КомпонентСреда для анализа RPMI (конечный объем 50 мл)
Базовый среднийAgilent Seahorse XF RPMI, pH 7.4
Глюкоза (1 М стерильного вещества)11 мМ (стоковый раствор 0,55 мл)
L-глютамин (стерильный материал 200 мМ)2 мМ (0,5 мл запасного раствора)
Пируват натрия (стерильный материал 100 мМ)1 мМ (0,5 мл запасного раствора)

Таблица 1: Раковые клеточные линейные среды и композиции XF-сред.

  1. Культивируйте все клеточные линии с использованием стандартной асептической техники культивирования тканей и подтвердите, что они свободны от микоплазмы, используя подходящий набор для анализа.
  2. Культивируйте клеточные линии в колбах для культивирования тканей Т75 или эквиваленте, используя рекомендуемую среду (таблица 1). Культивируйте клеточные линии до 65-80% слияния и проходите их регулярно максимум до 25 проходов.
  3. Промыть колбы клеточной культуры дважды в модифицированном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DBPS).
  4. Отделяют клетки от колб 3 мл клеточного диссоциационного реагента (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при 37 °C и подтверждают отслоение микроскопией.
  5. Аккуратно аспирировать отсоединенную клеточную суспензию, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию и дезактивировать реагент диссоциации клеток 7 мл полной тканевой питательной среды.
  6. Соберите клетки путем центрифугирования при 300 × г в течение 5 мин, выбросьте супернатант и повторно сведите клетки в полную среду.
  7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и титруйте до желаемой плотности клеток, необходимой для посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для посева всей 96-луночной пластины при 100 мкл/лунке при 4 × 103 клетках/лунке клетки следует титровать до 4 × 104 клеток/мл в рекомендуемом объеме 12 мл.
  8. Декантируйте клеточную суспензию в стерильный резервуар и дозируйте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку клеточно-репеллентной микропластины с помощью многоканального пипеттера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только внутренние 60 лунок микропластины должны быть засеяны, а остальные заполнены DPBS. Это сформирует барьер испарения, обеспечит однородность сфероидов по всей пластине и минимизирует эффекты края пластины.
  9. Центрифужные сфероидные микропластины при 300 × г в течение 15 мин для форсирования клеток в рыхлые агрегаты.
  10. Инкубируйте пластины при 37 °C, 5% CO2 в течение минимум 3 дней, чтобы обеспечить образование сфероидов.
  11. Выполняйте фазово-контрастную микроскопию с использованием стандартизированных лабораторных практик для мониторинга роста сфероидов. Пополняйте клеточную культуральную среду каждые 3 дня или два раза в неделю, выполняя обмен средой в половину объема.

2. Зондирование митохондриального энергетического метаболизма одиночных сфероидов с использованием технологии Extracellular Flux (XF)

  1. Подготовка к анализу (за день до этого)
    1. Проверьте жизнеспособность сфероида с помощью инвертированного светового микроскопа с фазовым контрастом при 4-кратном увеличении, чтобы обеспечить неповрежденную сфероидную структуру, морфологию и общую однородность между образцами.
    2. Увлажните картридж датчика.
      1. Аликвота ~20 мл калибранта в коническую трубку.
      2. Поместите коническую трубку, содержащую калибрант, в инкубатор без CO2 37 °C на ночь.
      3. Извлеките содержимое из набора для анализа.
      4. Извлеките картридж датчика из вспомогательной пластины и поместите его вверх ногами на столешницу рядом с вспомогательной пластиной.
      5. Пипетка 200 мкл стерильного ddH2Oв каждую скважину картриджной пластины датчика с помощью многоканальной пипетки P300.
      6. Поместите картридж датчика поверх вспомогательной пластины.
      7. Убедитесь, что уровень воды в каждой скважине достаточно высок, чтобы погрузить датчики.
      8. Перенесите собранный картридж датчика в инкубатор без CO2 37 °C и оставьте на ночь.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может быть выполнен за 12-72 ч до начала анализа.
  2. Микропластина сфероидного анализа покрытия
    1. Используя асептические методы, добавляют 30 мкл/лунку стерильного раствора поли-D-лизина (0,1 мг/мл) к сфероидной микропластине и инкубируют ее в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. Аспирируйте раствор из каждой лунки сфероидной микропластины, переверните пластину и плотно постучите ее по папиросной бумаге, чтобы удалить любой остаточный раствор.
    3. Дважды промыть пластину 200 мкл/лунку стерильным ddH2O.
    4. После окончательной стирки переверните микропластинку и плотно постучите ее на папиросную бумагу, чтобы удалить остаточную воду.
    5. Дайте пластине высохнуть на воздухе в течение 30 минут перед использованием или хранением при температуре 4 °C для будущего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микропластина сфероидного анализа должна быть покрыта молекулярным клеем, чтобы гарантировать, что сфероиды закреплены в нижней части микропластины. Без молекулярного клея сфероиды могут смещаться и мешать результатам анализа. Другие молекулярные клеи также могут быть использованы в качестве альтернативы Poly-D-лизину для пластин предварительного покрытия. Предварительно покрытые пластины могут храниться при температуре 4 °C, но их следует оставить для выравнивания до комнатной температуры до начала анализа.
  3. Подготовка среды для анализа XF
    1. Подготовка среды XF RPMI, как описано в таблице 1, и стерильного фильтра со шприцевым фильтром 0,22 мкм
  4. Подготовка к анализу (за 1 ч до анализа)
    1. Предварительно прогрейте добавленную XF RPMI пробирную среду до 37 °C.
    2. Предварительно прогрейте микропластинку сфероидного анализа с покрытием в инкубаторе безСО2 37 °C или сухой ванне.
    3. Подготовьте картридж датчика.
      1. Извлеките коническую трубку, содержащую калибрант и картридж датчика, из воздушного инкубатора.
      2. Извлеките картридж датчика из вспомогательной пластины и поместите его вверх ногами на рабочую поверхность.
      3. Используя многоканальную пипетку P300, аспирируйте воду с опорной плиты и выбросьте ее.
      4. Залейте раствор калибранта в резервуар для стерильных реагентов и добавьте 200 мкл/лунку предварительного калибранта к вспомогательной пластине с помощью многоканальной пипетки P300.
      5. Возьмите картридж датчика и поместите его обратно на верхнюю часть вспомогательной пластины, чтобы датчики были хорошо погружены в калибр.
      6. Перенесите собранный картридж датчика обратно в инкубатор без CO2 при 37 °C до готовности к загрузке растворов для впрыска в порт.
  5. Промыть сфероиды пробирной средой.
    1. Извлеките пластину для культуры сфероидов из инкубатора 37 °C, 5% CO2 и наблюдайте за сфероидами под микроскопом, чтобы обеспечить их целостность перед этапами переноса сфероидов.
    2. Загрузите все скважины сфероидной пластины 180 мкл/лунку предварительной пробирной среды, включая любые скважины фоновой коррекции.
    3. Частично заполните чашку Петри размером 7 см 3 мл пробирной среды.
    4. Используя многоканальную пипетку, нагруженную широкими наконечниками отверстий пипетки, переведите сфероиды с 96-луночной культуральной пластины в чашки Петри 7 см, установив пипетку на объем аспирации 10-50 мкл.
  6. Семена сфероидов в предварительно покрытую сфероидную микропластину.
    1. Используя микроскоп для рассечения и аппарат лайтбокса, перенесите сфероиды из чашки Петри на микропластину сфероидного анализа, как описано ниже.
      1. Установите объем одноканального пипеттера, оснащенного широким наконечником отверстия пипетки, на 20 мкл и тщательно аспирировать один сфероид. Поместите наконечник непосредственно в центр каждой лунки микропластины сфероидного анализа и позвольте гравитации элюировать один сфероид в центр каждой лунки, т. е. не выталкивайте какую-либо среду из кончика пипетки и позвольте капиллярному действию вывести сфероид из кончика пипетки. Для подтверждения элюирования содержимое пипетатора можно пипетировать обратно в 7 см чашку Петри под микроскопом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гравитационное элюирование одного сфероида обычно занимает 15-30 с в зависимости от размера/плотности сфероида. В течение этого времени пипетку не следует снимать. Любые лунки фоновой коррекции должны быть свободны от сфероидов и содержать только пробирную среду. Под микроскопом подтвердите положение каждого сфероида. Каждый сфероид в идеале должен быть расположен в центре каждой скважины.
      2. После того, как все сфероиды были перенесены на микропластину сфероидного анализа, перенесите пластину в инкубатор без CO2 при 37 °C в течение как минимум 1 ч до анализа.

3. Подготовка и загрузка соединений в картридж датчика для XF анализов

Инъекционная стратегияСоединение (порт)Начальный объем микролунки XFe96 (мкл)Желаемая конечная концентрация скважиныОбъем порта (мкл)Конечный объем микролунки XFe96 после впрыска (мкл)Концентрация рабочего капитала
1Олигомицин (А)1803 мкг/мл2020030 мкг/мл
Ротенон (B)2002 мкМ2022022 мкМ
Антимицин А (В)2002 мкМ2022022 мкМ
2БАМ15 (А)1805 мкМ2020050 мкМ
Ротенон (B)2002 мкМ2022022 мкМ
Антимицин А (В)2002 мкМ2022022 мкМ

Таблица 2: Концентрации митохондриальных соединений для зондирования митохондриального энергетического метаболизма одиночных 3D-сфероидов с помощью анализатора XFe96.

  1. Подготовьте концентрации рабочего материала каждого соединения, как указано в таблице 2 , используя полностью дополненную, предварительно высушенную среду для анализа XF RPMI.
  2. Ориентируйте картриджную пластину (соединенную с полезной пластиной) по колоннам, 1-12 слева направо.
  3. Если используется направляющая заряжания, поместите ее на пластину картриджа в соответствии с процедурой хорошо нагружа, например, если порт А загружается первым, убедитесь, что А виден в левом верхнем углу направляющей.
  4. Перенесите рабочий раствор каждого соединения в подходящий резервуар и, используя калиброванную многоканальную пипетку P100, дозируйте 20 мкл во все соответствующие порты. Повторите для каждого соединения в остальные порты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на пластине картриджа датчика не используются какие-либо порты, их можно оставить пустыми или заполнить пробирной средой. Если используется только выбор определенной буквы порта, убедитесь, что другие порты, соответствующие этой букве, загружены средой анализа; в противном случае воздух будет закачиваться в скважину, что ставит под угрозу результаты в этих скважинах.
  5. После загрузки порта снимите направляющие для загрузки пластин (если они используются) и подготовьте анализатор к загрузке картриджа датчика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ не выполняется сразу после загрузки портов, поместите крышку обратно на картридж датчика и поместите пластину обратно в воздушный инкубатор при температуре 37 °C до тех пор, пока она не будет готова к загрузке в машину.

4. Проектирование анализов, стратегии инъекций и сбор данных

  1. Проведение анализа
    1. Включите анализатор и подключите к контроллеру (компьютеру).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно проверить по состоянию подключения прибора на панели виджетов программного обеспечения Wave Controller.
    2. Перейдите на страницу шаблонов в программном обеспечении WAVE, найдите файл шаблона анализа для эксперимента и дважды щелкните его, чтобы открыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если шаблон анализа не отображается в представлении Шаблоны , импортируйте файл шаблона в папку шаблона с общего сетевого диска или USB-устройства флэш-памяти.
    3. Чтобы начать анализ, перейдите на вкладку Выполнить анализ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если определения групп были правильно распределены на карте пластин, анализ будет готов к выполнению, как указано зеленой галочкой в правой части страницы. На этом этапе любая дополнительная информация может быть введена на странице сводки анализа или на странице, оставленной пустой; перейдите к следующему шагу. В связи с задержкой проникновения митохондриальных модуляторов в 3D-сфероиды микротизов (рисунок 2) используют информацию протокола измерения, описанную в таблице 3.
Период измеренияНомер впрыска и портДетали измеренийПродолжительность периода (ч:мин:с)
КалибровкаНе применимоАнализаторы XF всегда выполняют эту калибровку, чтобы убедиться, что измерения точны00:20:00 (это среднее значение и может варьироваться в зависимости от машины)
УравновешиваниеНе применимоУравновешивание происходит после калибровки и рекомендуется.00:10:00
БазальныйНе применимоЦиклы = 500:30:00
Микс = 3:00
Ожидание = 0:00
Мера = 3:00
Олигомицин / БАМ15Инъекция 1 (порт A)Циклов = 1001:00:00
Микс = 3:00
Ожидание = 0:00
Мера = 3:00
Ротенон + антимицин АИнъекция 2 (порт B)Циклов = 1001:00:00
Микс = 3:00
Ожидание = 0:00
Мера = 3:00
Общее время:03:00:00

Таблица 3: Настройка протокола для зондирования митохондриального энергетического метаболизма одиночных 3D-сфероидов с помощью анализатора XFe96.

  1. Нажмите кнопку Начать запуск , чтобы открыть диалоговое окно расположение сохранения .
  2. Введите место сохранения результирующего файла и поместите собранный картридж датчика в термоотлив, который появляется из дверцы на боковой стороне анализатора. Подождите, пока тепловой лоток откроется автоматически и на экране отобразится сообщение Load Calibrant Utility Plate . Прежде чем следовать подсказкам на экране, убедитесь: i) правильное размещение картриджа датчика на пластине Утилиты, ii) снята крышка с картриджа датчика и iii) правильная ориентация картриджа датчика на вспомогательной пластине.
  3. Следуйте экранным командам, чтобы начать калибровку картриджа датчика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для завершения калибровки, составляет приблизительно 10-20 мин (для анализов при 37 °C).
  4. После калибровки картриджа датчика загрузите сфероидную микропластинку в анализатор, следуя инструкциям на экране на Wave Controller, чтобы инициировать 12-минутный шаг равновесия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленые поля с белыми галочками указывают на «хорошую» калибровку для этого колодца. Если какие-либо скважины не обеспечивают «хорошую» калибровку, они будут обозначены красным прямоугольником и белым крестом. Такие скважины должны быть отмечены и исключены из любого анализа после завершения анализа с использованием вкладки модификационного анализа .
  5. Подождите, пока анализатор автоматически начнет получать базовые измерения после того, как машина завершит этап равновесия (как указано в протоколе прибора).
  6. Чтобы завершить эксперимент, следуйте экранным командам на контроллере WAVE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как сфероидная микропластина была удалена из анализатора, отбросьте картридж датчика и отложите сфероидную пластину для дальнейшего анализа, если это необходимо (например, двухцепочечная (ds) количественная оценка ДНК). Если микропластинка не требуется для дальнейшего анализа, ее можно выбросить вместе с картриджем датчика.
  7. Дождитесь появления диалогового окна анализа и просмотрите результаты или вернитесь в представление шаблонов .

5. Стратегии нормализации и анализа данных - нормализация после анализа и последующие анализы (необязательные шаги)

  1. Нормализация данных
    1. Чтобы нормализовать данные сфероидов, обратитесь к серии протоколов, относящихся к стратегиям нормализации данных для расчета размера и объема сфероидов и количественной оценки dsDNA в сфероидных анализах. Они были включены в качестве дополнительных файлов; см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2.
  2. Анализ данных
    1. Чтобы экспортировать данные в один из генераторов автоматизированного анализа, выполните команды экспорта данных на контроллере WAVE и выберите генератор экспорта, соответствующий типу анализа. Кроме того, можно экспортировать файл данных и загрузить его в аналитику Seahorse.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недостатком генераторов отчетов и аналитики Seahorse является то, что анализ данных ограничен тем, как разработан анализ XF, и не позволяет измерять средние значения по циклам измерения. Ручной экспорт наборов данных из программного обеспечения прибора позволяет использовать предпочтения пользователя в этом отношении. Учитывая, что стратегия инъекций для оценки митохондриального дыхания 3D-сфероидов, вероятно, будет отличаться от типичного теста «MitoStress», была разработана серия шаблонов электронных таблиц, чтобы помочь проанализировать эти наборы данных, специфичные для 3D-клеточных культур, и будет предоставлена по запросу. Эти файлы шаблонов данных предоставят данные о ключевых параметрах митохондриальных дыхательных путей, подробно описанных и объясненных на рисунке 2.
    2. Чтобы проанализировать данные, экспортируйте данные в виде отчета электронной таблицы из программного обеспечения контроллера WAVE и используйте независимый шаблон электронной таблицы для анализа.

figure-protocol-23798
Рисунок 2: Схематические дескрипторы для параметров, полученных в результате анализа данных о внеклеточном потоке. Аббревиатура: OCR = норма потребления кислорода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для получения хорошо сформированных, компактных сфероидов каждую клеточную линию оптимизировали индивидуально по плотности посева и продолжительности культивирования (рисунок 3). Клеточные линии A549, HepG2/C3A и SK-OV-3 первоначально образовывали рыхлые агрегаты, которые не п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Основные выводы и результаты
В этой статье представлен подробный протокол для исследования митохондриального энергетического метаболизма отдельных 3D-сфероидов с использованием серии клеточных линий, полученных из рака, с помощью анализатора XFe96 XF. Разработан и описан спос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

N.J.C был поддержан премией BBSRC MIBTP CASE Award с Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A549ECACC #86012804Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4Agilent Technologies Inc.103576-100XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux AnalyzerAgilent Technologies Inc.-Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin AMerck Life ScienceA8674Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplateGreiner Bio-One655076For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplatesGreiner Bio-One650970Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-LysineR&D Systems a biotechne brand3439-100-01Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-GlucoseMerck Life SciencesG8270Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging SystemThermo Fisher ScientificAMEX1000Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kitBiological Industries20-700-20Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image JAnalysis of collated images
Foetal bovine serumMerck Life ScienceF7524Supplement for cell culture medium
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-GloPromegaJ5021Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution)Merk Life SciencesG7513Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscopeLeica MicrosytemsLEICAM50Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7ECACC#86012803Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-StreptomycinGibco15140122Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInitrogenP7589Analysis of dsDNA in spehroids
RotenoneMerck Life ScienceR8875Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640Gibco21875091Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Build 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mLGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Consumables for cell culture
SK-OV-3ECACC #HTB-77Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution)Merck Life ScienceS8636Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flaskGreiner Bio-One658175Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpressGibco12604-021Cell dissociation reagent
Wave controller softwareAgilent Technologies Inc.-
Wide orifice tipSTARLAB International GmbHE1011-8400Pipette tips with wide opening for spheroid handling

Ссылки

  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511(2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109(2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74(2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548(2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22(2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545(2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279(2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071(2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397(2020).
  26. Chen, S. -Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism - Clinical and Experimental. 117, 154724(2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178(2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673(2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863(2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312(2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076(2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208(2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434(2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192(2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938(2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены