Модифицированная хирургическая модель нейропатической боли у мышей при повреждении щадящего нерва

Резюме

Модифицированная хирургия представляет собой упрощенный метод для модели повреждения нерва мышью или крысой, который требует только одной перевязки и одного разреза для повреждения как общих малоберцовых, так и икроножных нервов.

Аннотация

Повреждение пощадного нерва (SNI) — это животная модель, которая имитирует основные симптомы повреждения периферических нервов для изучения молекулярного и клеточного механизма нейропатической боли у мышей и крыс. В настоящее время существует два типа модели SNI: один для разрезания и перевязки общего малоберцового и большеберцового нервов с интактным икроножным нервом, который определяется как SNI в этом исследовании, а другой для разрезания и перевязки общего малоберцового и икроножного нервов с интактным большеберцовым нервом, который в этом исследовании определяется как SNIt. Поскольку икроножный нерв является чисто сенсорным, в то время как большеберцовый нерв содержит как моторные, так и сенсорные волокна, модель SNIt имеет гораздо меньший двигательный дефицит, чем модель SNI. В традиционной модели мыши SNIt общий малоберцовый и икроножный нервы разрезаются и перевязываются отдельно. Здесь описан модифицированный метод хирургии SNIt для повреждения как общих малоберцовых, так и икроножных нервов с помощью всего одной перевязки и одного разреза с более коротким временем процедуры, что легче выполнить и снижает потенциальный риск растяжения седалищного или большеберцового нервов, а также вызывает такую же механическую гиперчувствительность, как и традиционная модель SNIt.

Введение

Нейропатическая боль, вызванная повреждением нерва после операции или травмы, имеет значительное экономическое бремя, которое ухудшает качество жизни. Для изучения молекулярного и клеточного механизма развития седалищного нерва было успешно разработано множество моделей повреждения нервов, включая лигирование спинномозгового нерва (SNL)¹, хроническое сужительное повреждение (CCI)² седалищного нерва, частичное лигирование седалищного нерва (pSNL)³, транзакцию седалищного нерва (SNT)⁴ и повреждение щадящего нерва (SNI)5,6,7,8. нейропатическая боль 6,7,8,9,10. Тем не менее, каждая хирургическая модель имеет свои преимущества и ограничения, поэтому особое внимание следует уделить изучению и разработке хирургических моделей^.

Модель SNI у грызунов вызывает долгосрочную гиперчувствительность к механической стимуляции. Тем не менее, это несколько сбивает с толку, потому что существуют две разные модели SNI. Первоначальная модель SNI была разработана в лаборатории Вулфа, в которой были повреждены общий малоберцовый и большеберцовый нервы, в результате чего икроножный нерв остался нетронутым ^5,6. Вторая модель SNI была разработана в лаборатории Басбаума, в которой были повреждены общий малоберцовый и икроножный нервы, в результате чего большеберцовый нерв остался нетронутым ^7,8. Первоначальная модель Вульфа здесь определена как SNI, потому что икроножный нерв остается нетронутым, а модель Басбаума здесь определена как SNIt, потому что большеберцовый нерв остается нетронутым. Поскольку икроножный нерв является чисто сенсорным, в то время как большеберцовый нерв содержит как моторные, так и сенсорные волокна, модель SNIt имеет гораздо меньший двигательный дефицит, чем модель SNI. Однако, в отличие от модели SNIs, у мышей в модели SNIt не развивается тепловая гиперчувствительность, но механическая гиперчувствительность развивается в обеих моделях. Несмотря на то, что модель SNIt является относительно простой процедурой, она требует перевязки икроножного и общего малоберцовых нервов отдельно с потенциальным риском растяжения седалищного или большеберцового нервов 6,7,8,9.

Общие малоберцовый, большеберцовый и икроножный нервы представляют собой три ветви седалищного нерва и могут быть четко идентифицированы на верхнем крае икроножной мышцы (рис. 1): большеберцовый нерв проходит под икроножной мышцей, а общий малоберцовый (головная сторона) и икроножный нерв (каудальная сторона) находятся над икроножной мышцей¹¹. Основываясь на его анатомических особенностях, была разработана модифицированная хирургическая процедура мыши для перевязки общих малоберцовых и икроножных нервов вместе с одной лигацией нерва и одним перерезанием нерва, что приводит к сокращению времени процедуры.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию и проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. В данном исследовании использовались взрослые мыши C57BL/6 с массой тела 20-30 г. Оценка фон Фрея проводилась в период с 13:00 до 15:00.

1. Анестезия и подготовка мышей

1. Поместите мышь в пластиковую камеру, заполненную 2% изофлураном в_О2 со скоростью потока 1,0 л/мин, до полного обезболивания.
2. Нанесите на глаза офтальмологическую мазь с помощью ватного аппликатора.
3. Поместите морду мыши в гибкий носовой конус с потоком изофлурана 2% на протяжении всей хирургической процедуры.
4. Поместите мышь в правильное боковое положение. Держите левую ногу вверх, сгибая колено, и закрепите ее клейкой лентой.
5. Удалите волосы в области бедер и колен с помощью электробритвы и крема для удаления волос. Продезинфицируйте кожу 2% хлоргексидином и 70% спиртом.
6. Обеспечьте достаточную глубину анестезии перед операцией, проверив отсутствие реакции на щипковый стимул на задней конечности или хвосте с помощью пинцета в стандартной комплектации. Обеспечьте тепловую поддержку мыши.
   Примечание: До и после выполнения модели SNIt не использовались местные анестетики или НПВП, поскольку местный анестетик и НПВП значительно снижают нейропатическое болевое поведение после SNIt¹².

2. Модифицированная хирургия SNIt

1. Сделайте скальпелем разрез длиной 1 см, начиная с первой 1/3 горизонтальной линии, пересекающей колено под углом примерно 30° от вертикальной линии (рисунок 2А).
2. После отделения разреза кожи под двуглавой мышцей бедра (BFM) можно визуализировать две белые линии, при этом медиальная (цефаладная) толстая линия является бедренной костью, а боковая (каудальная) тонкая линия — седалищным нервом (рис. 2B).
3. Тупым образом рассеките BFM вдоль каудальной белой линии изогнутыми микрощипцами и микроножницами, чтобы обнажить седалищный нерв. Избегайте повреждения кровеносных сосудов при тупом рассечении. Если произошло случайное повреждение сосуда, используйте стерильные ватные тампоны для впитывания крови и приложите надлежащее давление, чтобы остановить кровотечение.
4. Дифференцируйте три ветви седалищного нерва на верхнем крае икроножной мышцы. Большеберцовый нерв имеет наибольший диаметр, проходящий под икроножной мышцей, в то время как икроножные нервы (латеральные, наименьшего диаметра) и общий малоберцовый нерв (медиальный) проходят над икроножной мышцей (рис. 2C и рис. 3A).
5. В зависимости от того, как рассекается и вскрывается BFM, визуализируйте общий малоберцовый нерв как латеральный (рисунок 2C) или медиальный (рисунок 3A) по отношению к большеберцовому нерву.
6. Отделите общий малоберцовый и икроножный нервы от соседних тканей с помощью изогнутых микрощипцов.
7. Перевязать общие малоберцовый и икроножный нервы вместе с помощью шва 6-0, так как оба нерва проходят над икроножной мышцей, а большеберцовый нерв проходит под икроножной мышцей (Рисунок 2D и Рисунок 3B,C). Наблюдайте за сокращением конечности после тугой лигатуры. При традиционном методе перевязка общих малоберцовых и икроножных нервов проводится отдельно.
8. Разрежьте нерв в дистальном отделе в пределах 2-4 мм от перевязки с помощью микроножниц. Следите за тем, чтобы большеберцовый нерв оставался нетронутым в течение всей процедуры. При традиционном методе перережьте общие малоберцовые и икроножные нервы в дистальной части в пределах 2-4 мм от лигирования и удалите участок длиной 2 мм отдельно.
9. Закройте мышечный слой шелковым швом 6-0, а разрез кожи - зажимами для раны.
10. После операции верните мышей в помещение для животных до полного восстановления после анестезии. Ежедневно проверяйте наличие неповрежденных разрезов, нормального приема пищи, потребления воды, общего состояния тела, регулярных движений и ухода за собой. Снимите зажимы для раны через 7-14 дней после операции.

3. Оценка фон Фрея для механического порога

1. Акклиматизируйте мышей в течение 6 дней к условиям испытательной комнаты и тестовым материалам для проведения оценки по фон Фрею. Поместите мышей в прозрачные пластиковые цилиндры на приподнятую сетку из проволочной сетки на 1 час привыкания. Поместите белую бумагу между каждым цилиндром, чтобы предотвратить какие-либо визуальные подсказки от каждого испытуемого животного.
2. В течение этого периода проводите привыкание каждые 2 дня и измеряйте базовую линию мононитей фон Фрея под серединой подошвенной задней лапы после последнего привыкания.
3. Выполните оценку по методу фон Фрея с помощью слепого тестера. Стимулируйте середину подошвенной части задней лапы нитями фон Фрея, используя парадигму «вверх-вниз»¹³. Нанесите нить фон Фрея на подошвенную поверхность перпендикулярно приложенной силой, чтобы вызвать легкое скручивание.
4. Проверяйте положительные реакции, такие как внезапное отдергивание лапы, внезапное вздрагивание или внезапное облизывание лапы. Прикладывайте следующий раздражитель с интервалом в 5 с, чтобы избежать влияния предыдущего раздражителя.
5. Подтвердите механический порог на лапу, проведя в среднем 3 сеанса.
6. Основываясь на 50% пороге отведения задней лапы, определенном методом вверх-вниз, используйте метод процентной реакции с нитью 0,16 г для дальнейшей оценки разницы.
7. Запишите процент положительных реакций после 10 стимулов по 0,16 г нити, нанесенных на середину подошвенной части задней лапы, независимо от ответов.
8. Выполняйте оценку по методу фон Фрея в 1-й день до операции и после операции в 1, 3, 5, 7 и 14 дни.

4. Статистический анализ

1. Вывод нормально распределенных непрерывных данных в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM). Анализируйте непрерывные данные с помощью 2-хвостового t-критерия или двустороннего повторного измерения ANOVA. Обрабатывайте все данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа, со статистической значимостью на уровне p < 0,05.

Результаты

Сравнение времени процедуры между модифицированными и традиционными методами.
Время процедуры от начала разреза кожи до конца смыкания кожи регистрировалось у 5 мышей при модифицированном подходе и у 5 мышей при традиционном подходе соответственно. Для по...

Обсуждение

По сравнению с традиционным методом SNIt мыши, который лигирует общий малоберцовый нерв и икроножный нерв отдельно 6,7,8,9, модифицированная модель SNIt имеет три преимущества: (1) она имеет меньший риск сокращения или растяжения седалищного или большебер?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 suture	Henry Schein	9007482	Nerve ligation and close the muscular layer
Iris Scissors	Integra Miltex	12460598	Cut muscle and fascia
Mayo dissecting scissors	Fisherbrand	895120	Cut skin incision
Micro forcep	Fisherbrand	16100110	Blunt dissection biceps femoris muscle
Micro Scissors	Excelta	17467496	Cut nerve
Microdissection Forceps	Fisherbrand	16100123	Separate the common peroneal and the sural nerves from the neighboring tissues
Needle Holder	Fisherbrand	8966	Hold 6-0 needle
Prism software	Graph Pad	version 8.0	Statistical analysis software
Wound clips	Roboz Surgical	NC1878744	Close skin incision