Генерация и расширение первичных, злокачественных опухолевых линий мезотелиомы плевры

Резюме

Целью данного метода является демонстрация надежной и воспроизводимой методологии обогащения, генерации и расширения первичных линий опухолевых клеток из хирургически резецированной мезотелиомы плевры.

Аннотация

Современные методологии расширения линий первичных опухолевых клеток из редких типов опухолей отсутствуют. Этот протокол описывает методы расширения первичных опухолевых клеток из хирургически резецированной злокачественной мезотелиомы плевры (MPM), предоставляя полный обзор процесса от пищеварения до обогащения, расширения, криоконсервации и фенотипической характеристики. Кроме того, этот протокол вводит концепции для генерации опухолей, которые могут быть полезны для нескольких типов опухолей, таких как дифференциальная трипсинизация и влияние методов диссоциации на обнаружение маркеров клеточной поверхности для фенотипической характеристики. Основным ограничением этого исследования является отбор опухолевых клеток, которые будут расширяться в двумерной (2D) системе культур. Вариации этого протокола, включая трехмерные (3D) системы культивирования, добавки для среды, покрытие пластин для улучшения адгезии и альтернативные методы дезагрегирования, могут улучшить этот метод и общий показатель успеха создания опухолевой линии. В целом, этот протокол обеспечивает базовый метод для установления и характеристики опухолевых клеток из этой редкой опухоли.

Введение

Злокачественная мезотелиома плевры (МПМ) является редкой опухолью, тесно связанной с воздействием асбеста. Хотя подходы, основанные на иммунотерапии, показали обнадеживающие результаты, существует нехватка вариантов лечения, доступных для пациентов, у которых развивается это заболевание, а общая 5-летняя выживаемость составляет ^1,2. В настоящее время в нескольких учреждениях предпринимаются усилия по лучшему пониманию этого заболевания и выявлению новых терапевтических целей, которые могут улучшить результаты лечения пациентов. Хотя существует несколько моделей мезотелиомы мыши, доступ к первичным опухолевым клеткам мезотелиомы более ограничен³. Расширение in vitro опухолевых клеток первичной мезотелиомы обеспечит ценную модельную систему, которая может быть использована для непосредственного изучения опухолевых клеток и их взаимодействия с аутологичными иммунными клетками, такими как инфильтрирующие опухоль лимфоциты. Хотя были сообщения о расширении линий первичных опухолевых клеток мезотелиомы, они немногочисленны и не предоставляют подробной стандартной процедуры операции (SOP). Кроме того, несколько клеточных линий доступны из коммерческих источников, таких как American Type Culture Collection (ATCC). Хотя доступность первичных опухолевых линий ограничена, было продемонстрировано, что опухолевые клетки могут быть расширены из плевральных выпотов и непосредственно из опухолевой ткани ^4,5. Кроме того, было показано, что расширенные линии опухолевых клеток сохраняют молекулярный профиль исходной опухоли ^4,5,6.

Наша лаборатория изучает опухоле-иммунную микросреду MPM и разработала метод расширения линий первичных опухолевых клеток MPM из хирургически резецированных случаев. Этот метод адаптирован из нашего опыта в установлении первичных метастатических меланомных опухолевых клеточных линий. Целью данной работы является предоставление подробного, практического подхода к расширению линии первичной опухоли мезотелиомы с использованием системы 2D-моделей и последующего фенотипического профилирования. Учитывая недавний успех стратегий блокады контрольных точек, нацеленных на CTLA4 и PD-1 в условиях первой линии², способность генерировать множество первичных опухолевых линий может способствовать пониманию обоих внутренних механизмов резистентности опухоли, а также обеспечить важную модельную систему для оценки распознавания Т-клеток, тем самым углубляя наше понимание иммунного ответа в MPM.

Основным ограничением этого протокола является то, что каждая опухоль содержит различную микросреду, и существует высокая степень вариабельности успеха расширения. Кроме того, этот метод подбирает для опухолевых клеток, которые могут расширяться в системе 2D-культуры. Другие методы, которые включают производство 3D-сфероида или органоидной культуры, могут обеспечить альтернативный подход, который может обеспечить более высокую скорость успеха расширения или привести к способности выводить клеточные линии, которые не могут расширяться в традиционной 2D-системе. Было продемонстрировано, что такие 3D-культуры полезны для генерации типов опухолей, которые трудно расширить, например, рака поджелудочной железы⁷.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Советом по обзору учреждений (IRB) Онкологического центра Андерсона при Техасском университете. Это относится к стандартным, хирургически резецированным опухолям MPM, удаленным после информированного согласия.

1. Подготовка опухолевых сред пищеварения и других связанных с ними сред

1. Чтобы подготовить опухолевую среду для пищеварения, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep (Пенициллин/Стрептомицин) к 500 мл стерильной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 в ламинарной вытяжке.
   1. Перенесите среду в стерильный фильтр 500 мл, 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) для вакуумной фильтрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы фильтрации и аспирации должны выполняться при стандартном вакуумном давлении 75-150 торр.
   2. Маркируйте и датируйте среду пищеварения опухоли и храните ее при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
2. Для приготовления ферментативного коктейля, переваривающего опухоль, добавляют 2,5 мл 3% коллагеназы типа 1, 1 мл 1,5 мг/мл гиалуронидазы, 20 мкл 250 000 единиц/мл ДНК от 1 до 16,5 мл среды пищеварения в конической трубке объемом 50 мл в ламинарной вытяжке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем переваривающего опухоль ферментативного коктейля составляет 20 мл; однако на образец опухоли требуется только 10 мл. Таким образом, оставшийся коктейль можно хранить при -20 °C до тех пор, пока это не понадобится. Не замораживайте аликвоты повторно.
3. Чтобы подготовить полную опухолевую среду, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep и 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарной вытяжке.
   1. Переведите среду в стерильный фильтр PES объемом 500 мл, 0,22 мкм для вакуумной фильтрации.
   2. Маркируйте и датируйте полную опухолевую среду и храните ее при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
4. Чтобы подготовить восстановленную сывороточную среду для голодания, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep и 5 мл FBS до 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарную проточную вытяжку.
   1. Переведите среду в стерильный фильтр PES объемом 500 мл, 0,22 мкм для вакуумной фильтрации.
   2. Нанесите этикетку и датируйте среду с восстановленной сывороткой и храните при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
5. Чтобы приготовить морозильную среду, добавьте 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) к 45 мл FBS в ламинарной проточной вытяжке.
   1. Переведите среду в 50 мл, 0,22 мкм PES стерильный фильтр для вакуумной фильтрации.
   2. Этикетка и дата пяти конических трубок по 15 мл.
   3. Переложите 10 мл морозильной среды в каждую трубку и храните трубки при -20 °C.
6. Чтобы подготовить среду без антибиотиков для тестирования микоплазмы, добавьте 50 мл FBS к 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарную вытяжку.
   1. Переведите среду в 50 мл, 0,22 мкм PES стерильный фильтр для вакуумной фильтрации.
   2. Маркируйте и датируйте среду, свободную от антибиотиков, и храните ее при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
7. Чтобы подготовить флуоресцентно-активированный буфер сортировки клеток (FACS) для фенотипического анализа, добавьте 16,6 мл стерильного бычьего сывороточного альбумина к 500 мл стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в ламинарный проточный капюшон.
   1. Маркируйте и датируйте буфер FACS и храните его при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS не требует стерилизации фильтра, если оба компонента хранятся стерильными. Буфер FACS может храниться до вскрытия в течение 6 месяцев при 4 °C.

2. Переваривание опухолевой ткани

1. Переведите 10 мл переваривающего опухоль ферментативного коктейля со стадии 1.2 в диссоциационную трубку.
2. Перенесите кусочек опухолевой ткани в стерильную 6-луночную пластинчатую крышку с помощью стерильного скальпеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество среды, которое переносится с опухолевой тканью, достаточно для обработки.
   1. Удалите всю жировую ткань, некротическую ткань и / или сгустки крови с помощью нового стерильного скальпеля и щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая ткань обычно желтоватая по внешнему виду и полутвердая. Некротическая ткань темнее окружающих тканей по внешнему виду и очень мягкая; как жировая, так и некротическая ткань будет легко распадаться. Кровавая ткань кажется ярко-красной и может выпускать кровь в среду при манипулировании. После удаления полученная опухолевая ткань должна сохранять форму и быть бледной или розовой, в зависимости от типа ткани.
   2. Разрезают всю опухолевую ткань на 1 мм³ небольших фрагмента. Чтобы ткань не пересыхала, добавьте 500 мкл стерильного 1x сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в опухолевую ткань.
3. Перенос опухолевых фрагментов в диссоциационную трубку, содержащую 10 мл переваривающего опухоль ферментативного коктейля (этап 2.1). Плотно закройте трубку, поместите ее колпачком вниз на тканевый диссоциатор и добавьте нагревательный аппарат, наложив его как рукав на диссоциационную трубку и надавив, чтобы щелкнуть его на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная емкость для каждой пробирки составляет 4 г опухоли и объем 10 мл.
4. Выберите предварительно запрограммированную настройку на 37C_h_TDK_1 диссоциатора. Проверьте состояние через 10 минут, чтобы убедиться, что нет ошибки засорения, как указано мигающим красным светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа обрабатывается при 1,865 об/мин в течение 1 ч с температурой при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит засорение, удалите диссоциационную трубку и вручную закрутите ее, чтобы выбить любую ткань, попавшую в крышку; затем замените трубку на диссоциатор и возобновите программу.
5. После 1-часового пищеварения снимите диссоциационную трубку и поместите ее в ламинарную вытяжку. Отфильтруйте переваренную опухоль, поместив 70-мкм клеточный ситечко поверх конической трубки объемом 50 мл и пипеткой переваренной опухоли с помощью пипетки объемом 10 мл на фильтр. Если фильтр засоряется, переключитесь на новый фильтр.
   1. Промыть диссоциационную трубку 10 мл свежей опухолевой среды пищеварения и пропустить промывку через фильтр.
   2. Снимите фильтр 70 мкм и выбросьте его.
   3. Доведите общий объем до 40 мл с опухолевой средой пищеварения.
6. Центрифуга при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Используя аспирационную пипетку объемом 2 мл, прикрепленную к вакуумному источнику, аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте клетки, используя 10 мл стерильной полной опухолевой среды.
8. Повторите шаг 2.6.
9. Аспирировать супернатант, как описано в шаге 2.7. Повторно суспендировать клетки в 3 мл стерильной полной опухолевой среды и перенести клеточную суспензию в одну лунку стерильной 6-луночной пластины.
10. Держите пластину в инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂.
11. Через 24 ч перенести использованную среду из переваренной опухоли в 1 лунку в новую лунку (скважину 2) в ту же 6-луночную пластину. Добавьте 3 мл стерильной полной опухолевой среды в хорошо 1.
12. Перенесите использованную среду из скважин 1 и 2 и соедините в скважину 3 в той же 6-луночной плите через 24 ч после шага 2.11. Добавьте 3 мл стерильной полной опухолевой среды в лунки 1 и 2.
13. Аспирировать среду из всех 3 лунок и пипетки по 3 мл полной опухолевой среды в каждую лунку через 48 ч после шага 2.12.

3. Генерация первичной линии опухолевых клеток

1. С помощью инвертированного фазового микроскопа определяют процент загрязнения фибробластами в культуре раннего прохождения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты, как правило, длинные и нерегулярные и имеют плохо определенную клеточную мембрану. Они кажутся тонкими или плоскими на шкале Z.
   1. Если загрязнение фибробластами превышает 20% клеток в культуре раннего прохождения, продолжайте культивирование после замены полной среды восстановленной сывороточной средой.
   2. Повторяют замену уменьшенной сывороточной средой на стадии 3,1,1 два раза в неделю в течение 3-4 недель.
   3. Когда культура достигает 80% сливания, пропускают клетки, расщепляя 50:50 на 2 новые лунки из 6-луночной пластины. Продолжайте прохождение 50:50 в восстановленных сывороточных средах, как только клетки достигнут 80% конфлюентности.
   4. Повторяйте шаг 3.1.3 в течение 4 недель, проходя в более крупные колбы для культивирования по мере необходимости, раскалывая 50:50, как только культура достигает 80% слива. Если популяция фибробластов не уменьшается до 10% или менее, перейдите к шагу 3.2, чтобы попытаться использовать метод дифференциальной трипсинизации для удаления загрязнения фибробластами. В противном случае перейдите к шагу 3.3.
2. Чтобы обогатить опухолевые клетки, аккуратно промойте лунку 1x PBS, чтобы удалить среду, содержащую сыворотку.
   1. Добавьте трипсин следующим образом: 1 мл на лунку, если в 6-луночной пластине, 2 мл для колбы T25, 3 мл для колбы T75.
   2. Поместите 6-луночную пластину или колбу в инкубатор при 37 °C в течение 1 мин. Извлеките пластину или колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если клетки частично поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и только трипсин. Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта частичная коллекция ячеек, основанная на адгезионных свойствах, является первой из нескольких фракций.
   3. Повторяйте шаги 3.2.1 и 3.2.2 до тех пор, пока не будут подняты все ячейки или не будут удалены 4 фракции.
   4. Центрифугировать все независимые фракции при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Аспирировать супернатант, как описано на этапе 2.7, и повторно суспендировать клетки, используя 5 мл стерильной, восстановленной сывороточной среды.
   6. Поместите ячейки в колбу T25 для каждой фракции и поместите колбы в инкубатор при 37 °C.
   7. Оцените культуру через 48 ч, чтобы определить, какая фракция обогащена опухолевыми клетками по сравнению с фибробластами. Откажитесь от колб, богатых фибробластами. Если контаминация фибробластов составляет <10%, продолжайте расширение в полной опухолевой среде и переходите к шагу 4. Если загрязнение фибробластами составляет 10-30%, повторите шаги 3.1.2-3.1.4. Если загрязнение фибробластами превышает 30%, повторите шаги 3.2-3.2.7.
3. Если в культуре раннего прохождения обнаружено мало или вообще нет фибробластов, продолжайте прохождение клеток в полной опухолевой среде, расщепляя 50:50, как только клетки на 80% сливаются в их 6-луночную пластину или колбу.

4. Расширение линии первичных опухолевых клеток раннего прохождения

1. Как только первичная опухолевая культура содержит 10% или менее загрязнения фибробластами, аспирируйте среду и заменяйте ее стерильной полной опухолевой средой два раза в неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный объем среды для T25 составляет 5 мл; T75 составляет 12 мл; T150 составляет 25 мл.
   1. Переместите культуру 50:50 в более крупные колбы по мере необходимости, как только она достигнет 80% слияния в пластине или колбе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру, возможно, потребуется пройти с более высоким соотношением в зависимости от ее роста. Отрегулируйте так, чтобы культура достигала 80% сливания каждые 3-5 дней.
2. Проход до тех пор, пока культура не окажется в отрывке 4 или выше. Как только культура на 80% сольется как минимум в две колбы T75, перейдите к шагу 5.

5. Характеристика и хранение установленной первичной линии опухолевых клеток

1. Криоконсервируйте одну колбу T75 в качестве ранней заморозки. Для тестирования микоплазмы оставшихся колб T75 перейдите к шагу 5.2.
   1. Для криоконсервации клеток раннего прохода размораживают 1 пробирку аликвотированной морозильной среды, приготовленной на стадии 1.5.
   2. Соберите клетки путем трипсинизации, сначала промыв пластину 1x PBS, как описано на этапе 3.2, и добавив трипсин, как описано в шаге 3.2.1.
   3. Поместите колбу в инкубатор при 37 °C на 3 мин. Извлеките колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если клетки поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и трипсин. Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки остаются адгезионными через 3 мин, поместите колбу обратно в инкубатор еще на 2 мин.
   4. Хорошо перемешайте трубку путем пипетки аккуратно и удалите 20 мкл для подсчета.
   5. Центрифугируют пробирку при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Пока клетки вращаются, подсчитывайте, используя лабораторный протокол подсчета, такой как трипан синий или акридин оранжевый / йодид пропидия (AO / PI).
   7. Повторное суспендирование клеток после центрифугирования в морозильной среде с минимум 2 × 10⁶ клеток /1 мл замороженной среды.
   8. Переведите 1 мл клеточной суспензии со стадии 5.1.7 на предварительно маркированные криовиалы объемом 1,5 мл.
   9. Поместите криовиалы в камеру замораживания с контролируемой скоростью и немедленно перенесите их при -80 °C.
   10. Храните клетки при -80 °C в течение 1 недели, прежде чем перенести их в жидкий азот для длительного хранения.
2. Разделите колбу T75 50:50 для тестирования микоплазмы. Замените среду на среду без антибиотиков, приготовленную на этапе 1.6.
   1. Через 72 ч разморозьте реагент обнаружения микоплазмы, субстрат и контроль при комнатной температуре в течение 15 мин перед тестированием.
   2. Соберите 1 мл супернатанта из каждой культуры, подлежащей тестированию, и поместите его в коническую трубку объемом 15 мл.
   3. Гранулируют любые взвешенные ячейки путем центрифугирования супернатанта при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Загрузите 100 мкл проб супернатантов и элементов управления в белую 96-луночную пластину. Добавьте 100 мкл реагента для обнаружения микоплазмы к каждому образцу и контролю.
   5. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Поместите пластину в считыватель пластин и прочитайте люминесценцию (чтение A, т.е. первое чтение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол производителя набора микоплазмы указывает на сохранение настроек по умолчанию на многофункциональных считывателях пластин. Считывание устанавливается в конечной точке люминесценции со временем интеграции 1 с и усилением 135. Считыватель пластин использует процедуру автоматического масштабирования для оптимизации сигнала усиления для каждого эксперимента. Время интеграции 1 с является стандартным по умолчанию. Обе настройки используются для регулировки интенсивности люминесцентного сигнала, интерпретируемого считывателем пластин, и, возможно, их потребуется отрегулировать в зависимости от отдельного считывателя пластин.
   7. Снимите пластину со считывателя пластин и добавьте 100 мкл субстрата для обнаружения микоплазмы к каждому образцу и контрольной группе.
   8. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
   9. Поместите пластину в считыватель пластин и считывайте люминесценцию (чтение B, т.е. второе чтение).
   10. Для определения положительности микоплазмы определяют соотношение чтения В к чтению А.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты позитивности микоплазмы описаны в протоколе производителя набора микоплазмы. Показания A и B приобретаются с одинаковыми настройками и просто отражают порядок чтения.
       1. Рассмотрим соотношение < 1 как микоплазмоотрицательное.
       2. Считайте соотношение 1-1,2 неубедительным и повторите шаг 5,2.
       3. Считать соотношение > 1,2 микоплазмо-положительным и контролировать эту культуру; при необходимости прекратить использование языка и региональных параметров.
3. Характеристика проточной цитометрии микоплазмоотрицательных опухолевых клеток
   1. Вытесняйте опухолевые клетки с помощью буфера диссоциации клеток.
   2. Подсчитайте ячейки и повторно суспендируйте ячейки при 1 × 10⁶/мл в буфере FACS с шага 1.7.
   3. Удалите 100 мкл клеточной суспензии в отдельные пробирки для окрашивания поверхности.
   4. Центрифуга при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Аспирировать супернатант и блокировать Fc-рецепторы путем инкубации клеток в 500 мкл 5% козьей сыворотки в буфере FACS при комнатной температуре в течение 10 мин.
   6. Добавьте 2 мл буфера FACS и центрифугируйте суспензию при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   7. Аспирировать супернатант и добавить поверхностную пятнистую смесь антител (табл. 1) и буфер FACS так, чтобы конечный объем составлял 100 мкл. Накройте образцы и окрашивайте их на льду в течение 30 мин.
   8. Повторите шаг 5.3.6.
   9. Аспирировать супернатант и зафиксировать клетки путем повторного использования в 200 мкл 1% параформальдегида (PFA) плюс 0,25% EtOH. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин с образцами, защищенными от света.
   10. Повторите шаг 5.3.6. Повторное суспендирование клеток в 200 мкл буфера FACS для получения с помощью соответствующего проточного цитометра.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что опухолевые клетки мезотелиомы будут положительными для мезотелина и N-кадгерина. Некоторые могут также экспрессировать CD90.
4. Расширяйтесь в полной опухолевой среде и банке, как описано в шагах 4.1 и 5.1 соответственно.

Результаты

Чтобы определить загрязнение фибробластами культур раннего прохождения, клетки оценивают с использованием инвертированного фазового микроскопа для определения частоты фибробластов относительно других присутствующих адгезивных клеток. На рисунке 1 показаны примеры...

Обсуждение

Хотя этот протокол прост, есть несколько критических шагов, которые необходимо тщательно соблюдать. Замораживание раннего прохождения важно для сохранения способности повторять процесс обогащения опухолевых клеток, если изначально безуспешный. Способность оценивать фибробластное ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML