Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

Резюме

Здесь мы описываем крупномасштабное производство сфероидов стромальных/стволовых клеток (ASC) жирового происхождения с использованием автоматизированной системы пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. Эти сфероиды ASC могут быть использованы в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Аннотация

Стромальные/стволовые клетки , полученные из жировой ткани (ИСС), представляют собой субпопуляцию клеток, обнаруженных в стромальной сосудистой фракции подкожной жировой клетчатки человека, признанной классическим источником мезенхимальных стромальных / стволовых клеток. Многие исследования были опубликованы с ASC для подходов тканевой инженерии на основе каркасов, которые в основном изучали поведение этих клеток после их посева на биоактивные каркасы. Тем не менее, появляются подходы без каркаса для инженерии тканей in vitro и in vivo, в основном с использованием сфероидов, чтобы преодолеть ограничения подходов на основе каркасов.

Сфероиды представляют собой 3D-микроткани, образованные процессом самосборки. Они могут лучше имитировать архитектуру и микроокружение нативных тканей, в основном из-за увеличения межклеточных и межклеточных матриксных взаимодействий. В последнее время сфероиды в основном исследуются в качестве моделей заболеваний, исследований скрининга лекарств и строительных блоков для 3D-биопечати. Однако для подходов к 3D-биопечати для биофабрикатирования сложных моделей тканей и органов необходимы многочисленные сфероиды, однородные по размеру и форме. Кроме того, когда сфероиды производятся автоматически, существует мало шансов на микробиологическое загрязнение, повышающее воспроизводимость метода.

Крупномасштабное производство сфероидов считается первым обязательным этапом для разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием тканевой конструкции в биореакторах. Тем не менее, количество исследований, в которых изучалось крупномасштабное производство сфероидов ASC, по-прежнему ограничено, вместе с количеством исследований, в которых использовались сфероиды ASC в качестве строительных блоков для 3D-биопечати. Таким образом, эта статья направлена на то, чтобы показать крупномасштабное производство сфероидов ASC с использованием неадгезивного микроформованного гидрогеля, распространяющего СФЕРОИДЫ ASC в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Введение

Сфероиды считаются бесконтактным подходом в тканевой инженерии. ИСС способны образовывать сфероиды в процессе самосборки. 3D-микроархитектура сфероида увеличивает регенеративный потенциал ИСС, включая дифференциацию в несколько линий ^1,2,3. Эта исследовательская группа работает со сфероидами ASC для инженерии хряща и костной ткани ^4,5,6. Что еще более важно, сфероиды считаются строительными блоками в биофабрикации тканей и органов, в основном из-за их способности к слиянию.

Использование сфероидов для формирования тканей зависит от трех основных моментов: (1) разработка стандартизированных и масштабируемых роботизированных методов их биофабрикации⁷, (2) систематическое фенотипирование тканевых сфероидов⁸, (3) разработка методов сборки 3D-тканей⁹. Эти сфероиды могут быть сформированы с различными типами клеток и получены с помощью различных методов, включая висячую каплю, реагрегацию, микрофлюидику и микромолоды ^8,9,10. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки, связанные с однородностью размеров и формы сфероидов, восстановлением сфероидов после образования, количеством производимых сфероидов, автоматизацией процессов, трудоемкостью и затратами¹¹.

В методе микроформования клетки дозируются и осаждаются в нижней части микромоли из-за силы тяжести. Неадгезивный гидрогель не позволяет клеткам прилипать к дну, а межклеточные взаимодействия приводят к образованию одного сфероида за спад ^8,12. Этот метод биофабрикации генерирует сфероиды однородного и контролируемого размера, может быть роботизирован для крупномасштабного производства эффективным по времени способом с минимальными усилиями и имеет хорошие затратоэффективно-критические факторы при проектировании биофабрикации тканевого сфероида ^7,8. Этот метод может быть применен для формирования сфероидов любой клеточной линии для получения нового типа ткани с предсказуемыми, оптимальными и контролируемыми характеристиками⁸.

Биофабрикация определяется как «автоматизированная генерация биологически функциональных продуктов со структурной организацией...»¹³. Поэтому автоматизированное производство сфероидов считается первым обязательным этапом разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием биопечатной ткани путем слияния сфероидов. В этом исследовании, чтобы улучшить масштабируемость биофабрикации сфероидов ASC, мы используем автоматизированную систему пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. В данной работе показано, что удалось получить большое количество (тысячи) сфероидов, необходимых для 3D-биопечати подходов к биофабрикату более сложных тканевых моделей.

протокол

ИСС, используемые в этом исследовании, были ранее выделены от здоровых человеческих доноров и криоконсервированы, как описано¹⁴ в соответствии с Комитетом по этике исследований Университетской больницы Клементино Фрага Филью, Федеральный университет Рио-де-Жанейро, Бразилия (25818719.4.0000.5257). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом исследовании.

1. Трипсинизация монослоя ASC при прохождении три

1. Откройте тканевую культуру 175^см2 колбы, содержащей монослой ИСС при 80% слиянии и выбросьте супернатант.
2. Добавьте 7 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, 0,01 М) и дважды промыть монослой. Далее выбросьте жидкость.
3. Добавьте 5 мл 0,125% трипсина с 0,78 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Далее инкубируют в течение 5 мин при 37 °C.
4. Добавьте 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco с низким содержанием глюкозы (DMEM LOW) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в колбу тканевой культуры 175^см2 и хорошо смешайте клеточную суспензию с 10 мл сорбологической пипеткой.
5. Соберите клеточную суспензию с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и переложите ее в центрифужную трубку объемом 50 мл. Далее центрифугу на 400 × г в течение 5 мин для получения гранулы ИСС. Повторное суспендирование клеточной гранулы с использованием DMEM LOW , содержащей 10% FBS.
6. Выполните подсчет ячеек путем исключения trypan.
7. После подсчета возьмите в общей сложности 1 × 10⁶ ASC в отдельной центрифужной трубке объемом 15 мл, чтобы засеять 81 рецессию, микроформованную неадгезионным гидрогелем (в общей сложности 10 000 клеток / мл, посеянных здесь). Чтобы засеять 256 рецессий микроформованного неадгезивного гидрогеля, возьмите в общей сложности 5 × 10⁵ ИСС в центрифужную трубку (в общей сложности 2 500 клеток / мл, посеянных здесь).

2. Изготовление микроформованного неадгезивного гидрогеля агарозы

1. Готовят 50 мл стерильного раствора 2% сверхчистой агарозы в 0,9% NaCl в сверхчистой воде. Автоклав раствора в течение 30 мин при 121 °C.
2. Добавьте 500 мкл стерильного 2% сверхчистого раствора агарозы в центр силиконовой формы, содержащей 81 или 256 круглых углублений.
3. Через 40 мин отформуйте сверхчистую агарозу из силиконовой формы и поместите ее в колодец из 12-луночной пластиковой пластины.
4. Добавьте 2 мл DMEM LOW в лунку с микроформованной агарозой и инкубируйте в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение не менее 12 ч перед посевом ИСС.

3. Биофабрикация сфероидов ASC с помощью автоматизированной системы дозирования

1. Проверьте следующее:
   1. Проверьте, включен ли ламинарный поток, и воздушный поток шкафа работает правильно.
   2. Проверьте, подключено ли оборудование к правильному напряжению.
   3. Проверьте, подключен ли планшет к оборудованию.
   4. Проверьте, совпадает ли высота защитного стекла шкафа с маркировкой датчика оборудования.
2. Нажмите кнопку On/Off на левой стороне оборудования и дождитесь запуска планшета и оборудования.
3. Расположите наконечники коробок, стойку для трубок центрифуги и пластину, содержащую микроформованный гидрогель агарозы, в рабочем пространстве оборудования.
4. На планшете с открытым программным обеспечением сначала нажмите на Labware Editor.
5. Настройте виртуальный рабочий стол и выберите положения пипеток, наконечников, стойки для пластиковых трубок и пластин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Виртуальный рабочий стол должен представлять физические положения аксессуаров в оборудовании.
6. Нажмите кнопку Переключиться на создание , чтобы включить параметры (см. шаг 3.10) и команды, которые оборудование будет выполнять на протяжении всего эксперимента. Дождитесь открытия панели инструментов и списка Produce в программном обеспечении.
7. Изначально, чтобы указать команды, укажите количество образцов, подлежащих пипетированию, и перетащите их в список Produce.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов представляет собой количество пластиковых центрифужных трубок, содержащих суспензию ASC, которая должна быть засеяна в центр микромолодов.
8. После ввода количества образцов нажмите на кнопку «Передача образца» на программном обеспечении, чтобы перенести суспензию ASC в скважины 12-луночной пластины, содержащей микромолди, и перетащите ее в Список продуктов.
9. Нажмите « Свойства», чтобы настроить начальную и конечную позиции для оборудования для передачи образца.
10. Подождите, пока программное обеспечение вернется на страницу Рабочая таблица. Нажмите на кнопку «Параметры», чтобы настроить параметры автоматического заполнения ИСС: i) Скорость аспирации 15,4 ^с-1; ii) Скорость дозирования 1 ^с-1; iii) Задержка удара 0 мс; iv) Скорость выдува 15,4 ^с-1; v) Начальный ход 100%.. Выберите Вода в качестве стандартного типа жидкости.
11. Настройка параметров для смешивания ИСС для получения однородной суспензии: i) Количество циклов 5; ii) Скорость 6,5 ^с-1; iii) Объем 300 мкл.
12. После настройки параметров добавьте время 40 мин в список производить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время необходимо, чтобы подождать, пока суспензия ASC затвердеет в нижней части микроформовки.
13. В Список продуктов включите опцию Переноса реагента для переноса сфероидной питательной среды в соответствующие колодцы пластины.
14. Повторите шаги 3.9-3.11, чтобы настроить положение и конфигурацию параметров для передачи сфероидной питательной среды.
15. Нажмите на кнопку с символом проверки на верхней панели программного обеспечения, чтобы убедиться, что нет ошибки программирования.
16. Нажмите кнопку Play (с символом треугольника) на верхней панели программного обеспечения, чтобы запустить программу.
17. Дайте оборудованию запуститься, как запрограммировано, и подождите, пока оно издаст звук, указывающий на то, что оно закончилось.
18. Соберите 12-луночную пластину и инкубируйте ее в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂ в течение не менее 18 ч, чтобы сфероиды были полностью сформированы и компактны.
19. Вручную собирают сфероиды после 1, 3 и 7 дней посева для анализа. Вручную промывайте среду микропипеткой, чтобы освободить сфероиды от микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
20. Через 5 мин проверьте под микроскопом, чтобы определить, полностью ли сфероиды высвобождаются из микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
21. Соберите сфероиды вручную с помощью микропипетки и перенесите их в центрифужную трубку объемом 15 мл.
22. Промыть сфероиды не менее двух раз с 0,01 М PBS. Оцените жизнеспособность и выполните биомеханические анализы на свежих образцах сфероидов. Для морфологического анализа (гистологии) инкубируют образцы сфероидов в 4% параформальдегиде в PBS в течение не менее 18 ч при 2-8 °C.

Результаты

Автоматическая система пипеток может засеять суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной 12-луночной пластины за 15 минут. Использование 81 микроформованного неадгезивного гидрогеля позволит получить 972 сфероида в конце протокола. Использование 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей даст 3...

Обсуждение

В данной работе представлена крупномасштабная генерация сфероидов ASC с использованием автоматизированной системы пипеток. Критическим этапом протокола является точная настройка программного обеспечения для обеспечения правильного объема суспензии ячейки, скорости и расстояния дл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100