Механический анализ избегания конфликтов для измерения болевого поведения у мышей

Резюме

Механический анализ избегания конфликтов используется в качестве нерефлексивного считывания болевой чувствительности у мышей, которое может быть использовано для лучшего понимания аффективно-мотивационных реакций в различных моделях боли у мышей.

Аннотация

Боль включает в себя как сенсорные (ноцицептивные), так и аффективные (неприятные) измерения. В доклинических моделях боль традиционно оценивалась с использованием рефлексивных тестов, которые позволяют делать выводы относительно ноцицептивного компонента боли, но предоставляют мало информации об аффективном или мотивационном компоненте боли. Поэтому разработка тестов, которые фиксируют эти компоненты боли, важна с точки зрения трансляции. Следовательно, исследователи должны использовать нерефлексивные поведенческие анализы для изучения восприятия боли на этом уровне. Механическое избегание конфликтов (MCA) - это установленный добровольный нерефлексивный поведенческий анализ для изучения мотивационных реакций на вредный механический стимул в парадигме 3 камер. Изменение предпочтения мыши в отношении местоположения, когда она сталкивается с конкурирующими вредными стимулами, используется для вывода о воспринимаемой неприятности яркого света по сравнению с тактильной стимуляцией лап. Этот протокол описывает модифицированную версию анализа MCA, который исследователи боли могут использовать для понимания аффективно-мотивационных реакций в различных моделях боли у мышей. Хотя это конкретно не описано здесь, наши примеры данных MCA используют внутриплантарный полный адъювант Фройнда (CFA), травму сохраненного нерва (SNI) и модель перелома / литья в качестве моделей боли для иллюстрации процедуры MCA.

Введение

Боль — это сложный опыт с сенсорными и аффективными компонентами. Снижение порога восприятия боли и гиперчувствительность к тепловым и/или механическим раздражителям являются ключевыми особенностями этого опыта, которые могут охватить тесты болевого поведения, вызванные стимулом (например, тест Харгривза на тепловую чувствительность и тест фон Фрея на механическую чувствительность)^1,2. Хотя такие тесты дают надежные и воспроизводимые результаты, они ограничены их зависимостью от рефлексивного ухода от воспринимаемого вредного стимула. Это поставило под сомнение постоянную зависимость исследований боли только от этих тестов. С этой целью исследователи боли в течение нескольких лет изучали альтернативные / дополнительные поведенческие тесты для использования в моделях боли грызунов в попытке охватить больше аффективных и / или мотивационных компонентов боли. Эти невызываемые, добровольные или нерефлексивные меры (например, бег колес, роение, обусловленное предпочтение места ^3,4,5) реализуются в попытке улучшить переводимость доклинических исследований боли.

Анализ механического предотвращения конфликтов (MCA) был первоначально описан Harte et al. в 2016^{году 6}, используется преимущественно у крыс ^7,8 и представляет собой модификацию более раннего подхода - парадигмы побега-избегания места. В этом подходе вредный стимул задней лапы выполняется в желательной (темной) камере, чтобы стимулировать целенаправленное поведение животного, чтобы избежать / избежать такой стимуляции ^9,10. Вместо того, чтобы полагаться на ручную вредную стимуляцию задней лапы наблюдателем, анализ MCA заставляет мышей договариваться о потенциально вредном стимуле, чтобы избежать отвратительной среды и достичь темной камеры. Конфликт / избегание, которое дает анализу его название, возникает из этих двух конкурирующих мотиваций: избегать ярко освещенных областей и избегать вредной стимуляции лап. Анализ MCA также разделяет особенности с условным тестированием предпочтений места, где сочетание облегчения боли с сигналами окружающей среды приводит к изменениям в поведении, которые отражают предпочтение обезболивающего / вознаграждающего контекста¹¹.

По сути, все эти анализы разделяют схожий подход: использование сдвига в предпочтении животного одной аверсивной среде перед другой в качестве индикатора их аффективного / мотивационного состояния. Анализ MCA представляет собой 3-камерную парадигму, состоящую из ярко освещенной камеры, за которой следует темная средняя камера с регулируемыми по высоте зондами и темная третья камера без каких-либо аверсивных стимулов. Неповрежденная мышь обычно мотивирована сбежать в затемненную камеру, учитывая врожденное отвращение грызунов к яркому свету¹². В этом примере естественная мотивация к выходу из ярко освещенной среды преодолевает нежелание сталкиваться со стимуляцией задней лапы (регулируемые датчики высоты), которая возникает исключительно в затемненной среде. Напротив, мышь, испытывающая боль (например, из-за воспаления или невропатии), может предпочесть проводить больше времени в ярко освещенной среде, поскольку есть мотивация избегать неприятного тактильного опыта механических зондов в условиях продолжающейся тактильной гиперчувствительности.

В этой статье описывается модифицированная версия анализа MCA. Мы адаптировали оригинальный метод (который был выполнен на крысах⁶) для использования на мышах. Мы также сократили количество тестируемых зондов с шести до трех (0, 2 и 5 мм над высотой пола), чтобы упростить сбор данных. Этот подход был протестирован на нескольких моделях боли и подтвержден известными анальгетиками, что указывает на то, что гиперчувствительность к боли и / или связанные с ней аффективные и мотивационные изменения приводят к этим изменениям в поведении. Этот подход относительно быстр в проведении и адаптируем по сравнению с другими нерефлексивными мерами, которые могут занять много дней привыкания и обучения ^1,2. В сочетании с другими мерами боли MCA может генерировать ценную информацию об аффективных и мотивационных аспектах боли.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты, связанные с использованием мышей и процедурами, применяемыми в них, были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Онкологическим центром MD Anderson и Стэнфордским университетом в строгом соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Конструкция MCA

1. Конструкция камеры 1 со следующими размерами: 125 мм x 125 мм x 125 мм (ширина x глубина x высота) из непрозрачного белого акрила толщиной 3 мм, используемого для боковин, пола, потолка. Используйте прозрачный акрил толщиной 3 мм для передней стены. Склейте все стороны заблаговременно, используя специальный акриловый клей.
   ВНИМАНИЕ: Акриловый клей считается опасным материалом (легковоспламеняющийся, вредный пар, может быть вредным при проглатывании, может раздражать кожу или глаза). Такие клеи следует использовать только в соответствии с инструкциями производителя (т.е. с соответствующими СИЗ в хорошо проветриваемом помещении).
2. Прикрепите крышку камеры 1 шарниром, чтобы мышей можно было легко поместить в камеру и извлечь из нее. Прикрепите самоклеящуюся светодиодную (LED) ленту к внутренней поверхности крышки, чтобы обеспечить освещение ~4800 люкс.
3. Закройте камеру 1 от остальной части MCA, сдвинув непрозрачный акриловый лист в положение и из него.
4. Сконструируйте испытательную камеру MCA, камеру 2, в виде неосвещенной камеры длиной 270 мм, изготовленной из полупрозрачного темно-красного акрила (толщиной 3 мм) со всех сторон, с откидной крышкой сверху. Поместите сетку размером 13 x 31 из отверстий 2 мм на полу камеры 2, через которую может выступать массив тупых зондов с наконечниками диаметром 0,5 мм (например, затупленные булавки карты).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тупые штифты с 120-зернистым блоком наждачной бумаги или аналогичным. Очистите их в теплой воде с моющим средством перед дезинфекцией спорицидным дезинфицирующим средством.
5. Отрегулируйте высоту зондов, поместив дополнительные акриловые листы под опорную плиту зонда (рисунок 1). Используя этот подход, настройте устройство с тремя параметрами: 0 мм, 2 мм и высотой зонда 5 мм.
6. В качестве альтернативы притупленным штифтам карты или аналогичным материалам используйте файлы 3D-принтера для печати пола камеры 2 и пластины зонда (см. Дополнительный файл 1: SpikeBed-MCA.stl, который относится к механическим зондам, и Дополнительный файл 2: MCA_baseplate.stl, который образует пол камеры 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если 3D-печать недоступна, приклейте булавки к акриловому листу с использованием того же акрилового клея, который использовался для строительства стен устройства.
7. Печать моющимся и биосовместимым материалом, таким как пластик нейлон 12 или аналогичный (рекомендуется).
8. Конструкция камеры 3 со следующими размерами: 125 мм x 125 мм x 125 мм в виде неосвещенной полупрозрачной темно-красной акриловой коробки (со всех сторон), размещенной на противоположном конце камеры 1. Поместите на камеру откидную крышку, аналогичную камерам 1 и 2. Эта камера служит затемненной зоной выхода из механических зондов в камере 2.

2. Привыкание и тестирование МЫШИНОЙ MCA

1. Как и во всех экспериментах, связанных с поведенческими результатами на животных, соблюдайте соответствующую рандомизацию и ослепление, чтобы свести к минимуму потенциальную предвзятость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты были получены с использованием 8-12-недельных самцов и самок мышей C57BL/6J (номер штамма Jackson Laboratories 000664). Мыши были социально размещены, до 5 на клетку, с доступом к пище и воде ad libitum и световым циклом с 07:00 ч до 19:00 ч. MCA проходила в световой период, между 09:00 ч и 12:00 ч.
2. За день до запланированного базового тестирования акклиматизируйте мышей к блоку MCA в течение 5 минут (минимум) до 15 минут (максимум) со своими товарищами по клетке, чтобы облегчить социальное исследование всего устройства.
3. На протяжении всего процесса убедитесь, что светодиоды в камере 1 выключены, барьер между камерами 1 и 2 оставлен открытым, а зонды установлены на нулевую высоту (т.е. не выступают через пол камеры 2).
4. Выполните базовый тест на мышах (необязательно), если исследование включает отрицательных контрольных животных (т. Е. Фиктивную хирургию или контроль впрыска транспортного средства). При желании используйте базовый тест, чтобы исключить любые неповрежденные выбросы, которые никогда не пересекают камеру 2, хотя это не оказалось необходимым. Если используется, сообщите обо всех критериях исключения и количестве исключенных мышей.
   1. Перед началом тестирования настройте видеокамеру, способную записывать кадры 1080p на штатив с боковым видом всего устройства MCA. Настройте поле зрения таким образом, чтобы MCA заполнял записанное изображение.
   2. После начала записи удерживайте ручную доску сухого стирания в поле зрения камеры, чтобы пометить начало видео идентифицирующей информацией о тестировании животного (например, идентификатор мыши, высота зонда, дата, точка времени и т. Д.).
   3. Для первого запуска установите высоту зонда равным нулю. Перенесите тестируемую мышь из домашней клетки в камеру 1 с барьерной дверцей на месте. Запустите таймер, который виден в записанных кадрах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таймер гарантирует, что интервалы между различными частями теста согласованы между запусками.
   4. Через 10 с включите в камере 1 светодиод. После того, как мышь находилась в освещенной камере в течение 20 с, снимите барьер между камерами 1 и 2.
   5. Понаблюдайте за животным в течение 2 мин. Измеряйте задержки и/или время ожидания с помощью секундомера во время тестирования. Кроме того, видеозапись может быть проанализирована после завершения тестирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям пропускной способности и избежания длительного воздействия аверсивных раздражителей отсечка была установлена на 2 мин.
   6. Измерить один или несколько из нескольких выявленных полезных результатов (см. ниже; Рисунок 1). Рекомендуется проанализировать все 5 показателей исхода при начале тестирования, чтобы выяснить, какие аспекты поведения отличаются в данной экспериментальной установке.
      1. Вариант I: Запишите задержку до первого входа в камеру 2. Вариант II: Запишите задержку при пересечении более чем на полпути через камеру 2. Вариант III: Регистрация общего времени выдержки в камере 2. Вариант IV: Запишите задержку для достижения камеры 3 (побег). Вариант V: Аналогично варианту II, запишите общее время выдержки в каждой камере в течение 2 минут и преобразуйте их в пропорции.
         Поскольку каждый эксперимент уникален и может зависеть от биологических факторов и поведенческих изменений, уникальных для модели заболевания, исследователи могут экспериментировать с этими и другими мерами в своих руках.
   7. Как только тестирование будет завершено, верните мышь в ее домашнюю клетку, очистите камеры MCA 70% этанолом и дайте ей полностью высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фекальные боли обычно можно относительно легко очистить из камеры бумажными полотенцами перед этанолом / дезинфицирующим средством. Если требуется более тщательная очистка, камеры 2 и 3 можно разобрать и погрузить в теплую мыльную воду.
   8. После запуска всех мышей в когорте с нулевой высотой зонда вставьте лист акрила толщиной 3 мм под механическую опорную пластину зонда и повторите шаги от 2.4.2 до 2.4.7 с высотой зонда 2 мм.
   9. После запуска всех мышей с высотой зонда, установленной на 2 мм, вставьте второй 3-миллиметровый лист акрила под опорную пластину зонда и повторите шаги от 2.4.2 до 2.4.7 с высотой зонда 5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Группа из 8 мышей может быть протестирована примерно за 2 часа с использованием этого подхода. Используйте меньшие размеры группы, если требуется более точное время после приема препарата (например, для эксперимента с курсом лекарственного времени).
   10. Выполните заключительную очистку дезинфицирующим средством в конце сеанса тестирования.
5. Повторное тестирование после индуцирования болевой гиперчувствительности и/или при медикаментозном лечении.
6. Сравните производительность каждой мыши на исходном уровне с их производительностью после того, как боль вызвана. Оценить влияние фармакологического вмешательства путем сравнения животных, обработанных транспортным средством, с животными, обработанными лекарственными препаратами, в тот же момент времени.
7. Выполняйте непараметрический статистический анализ (например, тест Манна Уитни U), если животные достигают 2-минутной отсечки без удовлетворения желаемой меры результата, что приводит к ненепрерывным данным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Анализ MCA был успешно использован с несколькими механистически различными моделями боли у мышей. На рисунке 2 показаны данные, в которых мера выбора результата пересекала среднюю точку камеры 2 (рисунок 2А). Данные, полученные с помощью промежуточной точк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Как и во всех поведенческих тестах, правильное обращение, рандомизация и ослепление обращения с животными имеют важное значение во всем. Учитывая многофакторные входные данные в сложном поведении и принятии решений, крайне важно, чтобы животные обрабатывались, привыкали и тестировали...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.