JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Phormidium lacuna представляет собой нитевидную цианобактерию, которая была выделена из морских скальных бассейнов. В данной статье описывается выделение нитей из природных источников, экстракция ДНК, секвенирование генома, естественная трансформация, экспрессия sfGFP, криоконсервация и методы подвижности.

Аннотация

Цианобактерии находятся в центре внимания фундаментальных исследований и биотехнологических проектов, в которых солнечная энергия используется для производства биомассы. Phormidium lacuna представляет собой недавно выделенную нитевидную цианобактерию. В этой статье описывается, как новые нитевидные цианобактерии могут быть выделены из морских скальных бассейнов. В нем также описывается, как ДНК может быть извлечена из нитей и как геномы могут быть секвенированы. Хотя трансформация устанавливается для многих одноклеточных видов, она реже регистрируется для нитевидных цианобактерий. Здесь описан упрощенный метод естественного превращения P. lacuna. P. lacuna является единственным членом отряда Oscillatoriales, для которого установлена естественная трансформация. В этой статье также показано, как естественная трансформация используется для экспрессии суперпапки зеленого флуоресцентного белка (sfGFP). Эндогенный промотор cpcB индуцировал примерно в 5 раз более сильную экспрессию, чем промоторы cpc560, A2813 или psbA2 от Synechocystis sp. PCC6803. Далее установлен способ криоконсервации P. lacuna и Synechocystis sp.CPP 6803, описаны методы оценки подвижности в жидкой среде и на агаровой и пластической поверхностях.

Введение

Цианобактерии являются прокариотическими организмами, которые используют фотосинтез в качестве источника энергии 1,2. Исследования все больше фокусируются на видах цианобактерий. Несколько цианобактерий могут быть преобразованы с помощью ДНК3. Гены могут быть выбиты или переэкспрессированы у этих видов. Тем не менее, трансформация ограничена несколькими видами 4,5,6,7,8,9,10,11, и может быть трудно установить трансформацию в штаммах из коллекций культур или диких8. Штаммы нитевидных видов Phormidium lacuna (рисунок 1) были выделены из морских скальных бассейнов, в которых условия окружающей среды, такие как концентрации соли или температура, колеблются с течением времени. Эти нитчатые цианобактерии могут быть использованы в качестве модельных организмов для отряда Oscillatoriales12, к которому они принадлежат.

В ходе испытаний, тестирующих перенос генов электропорацией13,14, было установлено, что P. lacuna может быть преобразована естественной трансформацией15. В этом процессе ДНК естественным образом поглощается некоторыми клетками. По сравнению с другими методами преобразования 16,17, естественное преобразование имеет то преимущество, что не требует дополнительных инструментов, которые могли бы усложнить процедуру. Например, электропорация требует правильных кювет, неповрежденных проводов и выбора правильного напряжения. P. lacuna в настоящее время является единственным членом Oscillatoriales, восприимчивым к естественной трансформации. Поскольку оригинальный протокол основан на протоколах электропорации, он по-прежнему включал в себя несколько этапов промывки, которые могут быть ненужными. Различные подходы были протестированы для упрощения протокола, что привело к протоколу преобразования, представленному здесь.

Последовательность генома необходима для дальнейших молекулярных исследований, основанных на нокауте гена или сверхэкспрессии. Хотя последовательности генома могут быть получены с помощью машин секвенирования следующего поколения в течение коротких периодов времени, извлечение ДНК может быть затруднено и зависит от вида. С P. lacuna было протестировано несколько протоколов. Затем был установлен модифицированный метод на основе цетилтриметиламммония бромида (CTAB), что привело к приемлемой чистоте ДНК и выходам ДНК каждого цикла очистки для продолжения работы в лаборатории. Геном пяти штаммов может быть секвенирован с помощью этого протокола. Следующим логическим этапом трансформации было установление экспрессии белка в P. lacuna.

SfGFP, используемый в качестве маркерного белка в этом протоколе, может быть обнаружен с помощью любого флуоресцентного микроскопа. Все промоторы, которые были протестированы, могут быть использованы для экспрессии P. lacuna sfGFP. Увеличение числа штаммов, возникающих в результате трансформации, привело к необходимости метода хранения культур. Такие методы установлены для кишечной палочки и многих других бактерий18. В стандартных протоколах глицериновые культуры готовят, переносят в жидкий азот и хранят при -80 °C. Этот метод требует всего нескольких шагов и является высоконадежным для тех видов, для которых он установлен. Стандартный протокол был неосуществим для P. lacuna, поскольку живые клетки не могли быть восстановлены во всех случаях. Однако, когда глицерин был удален после оттаивания, клетки всех испытаний выжили. Представлены простые методы анализа подвижности P. lacuna, которые можно комбинировать с нокаутным мутагенезом для исследования пили IV типа или роли фоторецепторов. Эти анализы отличаются от анализов одноклеточных цианобактерий 19,20,21 и также могут быть полезны для других Осцилляторий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Изоляция от природной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленые водоросли, диатомовые водоросли, нитчатые цианобактерии и другие микроводоросли могут быть выделены. Протокол может быть использован для любых видов микроводорослей из скальных бассейнов, растущих в лабораторных условиях. Нитевидные цианобактерии, принадлежащие к Oscillatoriales, можно легко узнать по их движению и нитевидной форме. Вид может быть идентифицирован в получистом состоянии путем секвенирования генома или секвенирования 16S рРНК.

  1. Передавайте образцы жидкой морской воды из морских скальных бассейнов (т.е. полостей на скалистом побережье) в колбы по 50 мл. Для каждой колбы обратите внимание на точное место или координаты природного источника. Если возможно, отфильтруйте содержимое через сети 50 мкм, чтобы уменьшить количество зоопланктона. Храните образцы при температуре 4 °C до тех пор, пока они не станут субкультурными.
  2. Переложить 1 мл культур на 10 см чашки Петри, содержащие 3% бакто-агара в f/2 среде22,23 (см. Таблицу материалов). Подготовьте до 20 тарелок. Культивируют при белом свете 50 мкмоль м-2 с-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выращивания может использоваться более высокая интенсивность света. Интенсивность до 400 мкмоль m-2 s-1 может быть использована для P. lacuna, хотя другие виды могут быть более светочувствительными.
  3. Через неделю перенесите нужные клетки на свежие агаровые пластины с помощью стерильных щипцов. Изолируйте клетки под бинокулярным микроскопом в стерильных условиях. Храните старую агаровую пластину при 4 °C до тех пор, пока клетки не появятся и не вырастут на новой агаровой пластине.
  4. Повторяйте этот шаг переноса каждую неделю, чтобы устранить загрязнение. Используйте невооруженный глаз для обнаружения сильного загрязнения и микроскоп с 400-кратным увеличением для дополнительных проверок на загрязнение.
  5. Если образец кажется свободным от загрязнения, проверьте бактериальное или грибковое загрязнение на агаровых пластинах. Переложите часть культуры с помощью прививочной петли на агаровую пластину LB24 (диаметром 10 см), держите пластину при комнатной температуре и проверяйте рост загрязнений в течение 1-3 дней.
  6. Если получен стерильный нитевидный вид цианобактерий, используют его для дальнейшей культуральной работы. Культивировать P. lacuna в жидкости или на бакто-агаровых пластинах. Используйте колбы объемом 250 мл с 50 мл среды f/2 или среды f/2+ для жидкой культуры.

2. Извлечение ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод принят из 25 26

  1. Приготовьте две колбы с 50 мл среды f/2. Инокулируют каждый ~ 1 мл нитей P. lacuna из других растущих культур. Хранить культуры в течение 7 дней или дольше при перемешивании (горизонтальном вращении) при 50 об/мин при белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при 25 °C.
  2. Обработайте культуру ультразвуком (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин с полной энергией. Измерение OD при 750 нм; Проверьте, чтобы он был ~0,5. Продолжайте выращивать культуры, если ОД слишком низкая.
  3. Соберите нити накаливания по 5000 × г, центрифугирование 20 мин. Удалите супернатант. Перенесите нити с остаточной жидкостью в камеру френч-пресса27. Установите давление френч-пресса на 20 000 фунтов на квадратный дюйм и извлеките ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Французская пресса будет лизировать все клетки и высвобождать ДНК; сильные силы сдвига будут производить 1 500 фрагментов ДНК bp.
  4. Центрифугируйте образец в течение 10 мин при 10 000 × г и удалите супернатант.
  5. Добавьте к грануле 400 мкл лизизного буфера (4 М мочевины, 0,1 М Трис/Cl, рН 7,4) и 50 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Нагревайте образец до 55 °C в течение 60 мин с встряхиванием при 550 об/мин.
  6. Добавьте 1 мл буфера экстракции ДНК (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,1 М Трис/Cl, 1% Саркозил, 0,1 М DTT, рН 8) и инкубируйте в течение 60 мин при 55 °C и 550 об/мин. Переложите растворы в центрифугирующие трубки и добавьте два объема хлороформа/изоамилового спирта (24/1).
  7. После встряхивания центрифугируют образец в течение 5 мин при 9000 × г. Переведите верхнюю, водную фазу во флаконы реакции и добавьте 1 мл ледяного этанола и 50 мкл 3 М ацетата натрия.
  8. Вихрьте образец и поместите его при -20 °C в течение 1 ч или дольше.
  9. Центрифугу в течение 5 мин при 10 000 × г (4 °C) и выбросьте супернатант. Промыть гранулу 70% этанолом.
  10. Снова центрифугируйте образец. Удалите супернатант и высушите гранулы в течение ночи. Растворите ДНК в воде, свободной от нуклеаз. Измерьте спектр ДНК, чтобы проверить, находится ли OD 260 нм / OD 280 нм между 1,6 и 1,9.
  11. Проанализируйте размер ДНК на агарозном электрофорезном геле28.
  12. Секвенировать геномную ДНК путем секвенирования следующего поколения в течение 300 циклов с парной настройкой и длиной считывания 150 оснований (см. Таблицы материалов).
  13. Выполнить сборку с помощью соответствующей компьютерной программы; см. пример, приведенный в Таблице материалов.
  14. Отправьте проект генома на сервер RAST для аннотации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите последовательности ДНК, чтобы получить полную аннотацию в течение нескольких минут.

3. Естественная трансформация и выражение GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформация основана на плазмидном векторе, распространяемом в E. coli; pGEM-T или pUC19 могут использоваться в качестве магистральных векторов. Методы клонирования внедрены во многих лабораториях; см. также стандартные протоколы28 и статьи о векторах трансформации для P. lacuna15,29. Примеры векторов для выражения sfGFP описаны в разделе репрезентативных результатов. Подробная информация о четырех еще не опубликованных векторах приведена в дополнительном файле 1.

  1. Выполняйте все этапы с использованием стерильного материала в стерильных лабораторных условиях (чистый стенд, стерильная стеклянная посуда).
  2. Инокулировать 2 х 50 мл жидкой среды f/2 в две колбы по 250 мл 2 х 1 мл нитей P. lacuna из бегущей культуры. Культивируют в белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при перемешивании (горизонтальное вращение, 50 об/мин) в течение ~5 суток при 25 °C.
  3. Подготовьте ~200 мкг ДНК вектора трансформации с помощью набора midi prep (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Гомогенизировать 100 мл суспензии клеток P. lacuna (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин. Измерьте OD при 750 нм (желаемое значение = 0,35).
  5. Центрифугируют клеточную суспензию в течение 15 мин при 6000 × г. Удалите супернатант и суспендируйте гранулу в 800 мкл (общий объем, включая остаточную жидкость и нити) оставшейся жидкости и дополнительной среды f/2+ .
  6. Возьмите восемь f/2+ бакто-агаровых пластин (диаметр 10 см), содержащих 120 мкг/мл канамицина. Пипетка 10 мкг ДНК в середину каждой агаровой пластины. Сразу же пипетка 100 мкл клеточной суспензии попадает в середину каждой агаровой пластины (поверх ДНК).
  7. Держите агаровую пластину без крышки на чистой скамье, чтобы дать лишней жидкости испариться. Закройте тарелку и культивируйте ее при белом свете при 25 °C в течение 2 дней.
  8. Распределите нити каждой агаровой пластины с помощью петли инокуляции на несколько свежих f/2+ бакто-агаровых пластин, содержащих 120 мкг/мл канамицина. Культивируйте пластины в белом свете при 25 °C и регулярно проверяйте культуры под микроскопом.
  9. Выявляют живые, трансформированные нити через 7-28 дней под микроскопом. Ищите здоровые зеленые нити (рисунок 2), которые отличаются от других нитей. Если эти зеленые нити могут быть идентифицированы, перейдите к следующему шагу; в противном случае держите тарелку еще 7 дней.
  10. Используйте щипцы для переноса этих идентифицированных живых нитей в 50 мл жидкой среды f/2+ с 250 мкг/мл канамицина. Культивируйте в белом свете при 25 °C на шейкере (горизонтальное вращение, 50 об/мин). Наблюдайте за ростом до четырех недель.
  11. Перенесите нити обратно в агаровую среду, содержащую 250 мкг/мл канамицина, и дождитесь роста нитей. Через несколько дней переносят одиночные нити на свежую агаровую пластину с более высокой концентрацией канамицина, например, 500 мкг/мл. Сохраните оригинальную пластину.
  12. Убедитесь, что нити размножаются в высокой концентрации канамицина в жидкой культуре или на агаре. Снова увеличьте концентрацию канамицина, чтобы ускорить сегрегацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформированная P. lacuna вырастает до 10 000 мкг/мл канамицина. Другие виды могут не переносить такие высокие концентрации.
  13. Если резистентные клетки выращиваются и широко распределяются по пластине, протестируйте интеграцию вставки в геном P. lacuna , выполнив ПЦР с внешними и внутренними праймерами.
    1. Используйте грунтовки, которые были предназначены для клонирования вставки в качестве внутренних грунтовок.
    2. Для проектирования внешних праймеров выбирают последовательности, которые составляют 5' и 3' предполагаемого места вставки в геноме P. lacuna , но вне вставки.
    3. Для реакций ПЦР используйте внутренние праймеры и наружные праймеры. Используйте устойчивые штаммы и дикий тип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренние грунтовки указывают на то, что вставка присутствует; внешние грунтовки показывают, что вставка вставлена в правильный локус.
  14. Для каждой реакции ПЦР поместите ~ 10 мг нитей непосредственно в пробирки ПЦР и выполните ПЦР в соответствии со стандартными протоколами24. Если продукт не получен, измените температуру отжига и промойте нити водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ПЦР может быть использовано много различных полимераз. Стандартные полимеразы, такие как Taq-полимераза, имеют более высокую частоту ошибок, чем полимеразы, проверяющие ошибки, которые стоят дороже. Эта аналитическая ПЦР не требует какой-либо полимеразы с проверкой ошибок. Тем не менее, полимераза, проверяющая ошибки, должна быть проверена, если продукт ПЦР не получен со стандартной полимеразой.
  15. Анализ продуктов ПЦР резистентной линии на агарозномэлектрофорезе 24.
    1. Сравните положения полосы с маркером и сравните дикий тип и трансформант. С внутренней и внешней грунтовками ищите большую полосу для трансформанта, чем дикий тип (из-за вставки кассеты сопротивления) или две полосы для трансформанта: одну с размером полосы дикого типа и большую. Поскольку последний случай указывает на неполную сегрегацию, продолжают культивирование с высокими концентрациями канамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о ПЦР и электрофорезе см.15,24 или другую стандартную литературу.
  16. Для экспрессии GFP: наблюдать одиночные нити с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов) при увеличении поставленной цели в 40x или 63x. Захват изображения яркого поля и флуоресцентного изображения. Используйте следующие настройки для GFP: полоса пропускания 470 нм для возбуждения, полоса пропускания 525 нм для излучения и разветвитель пучка 495 нм, начальное время экспозиции 500 мс.
  17. Отрегулируйте время экспозиции для четких флуоресцентных сигналов, избегая интенсивности насыщения. Попробуйте использовать один и тот же параметр для всех примеров.
  18. Поскольку нити дикого типа также будут отображать флуоресценцию, захватывайте изображения с теми же настройками, что и выше для этой фоновой флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм, экспрессирующий GFP, должен иметь более высокий сигнал; в противном случае он не выражает GFP.
  19. Основываясь на времени экспозиции и интенсивности пикселей флуоресцентных изображений, рассчитайте и сравните содержание GFP в различных нитях.

4. Криоконсервация

ПРИМЕЧАНИЕ: P. lacuna и одноклеточные цианобактерии Synechocystis sp. Используются PCC 6803. Настоящий метод лучше работает для P. lacuna.

  1. Культивируют P. lacuna или Synechocystissp PCC 6803 в течение не менее 10 дней в 10 мл среды f/2+ или BG-11, соответственно, при белом свете (50 мкмоль m-2 s-1) при 25 °C при перемешивании (горизонтальные вращения, 50 об/мин).
  2. Гомогенизировать культуру P. lacuna (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин или ультразвуковым аппаратом (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин при полной энергии. Определите OD 750 нм любого языка и региональных параметров, чтобы проверить, находится ли значение в диапазоне от 1 до 7.
  3. Собирают клетки центрифугированием при 6000 × г в течение 15 мин. Удалите супернатант.
  4. Суспендировать ячейку гранулы в 800 мкл среды f/2+ или BG-11 (конечный объем) и перевести в криовиал 2 мл. Добавьте 800 мкл 50% раствора глицерина в клеточную суспензию. Закройте флакон и перемешайте путем повторного инвертирования.
  5. Переведите криовиал в жидкий азот и храните его в криобоксе в морозильной камере при температуре -80 °C. Обратите внимание на положение коробки внутри морозильной камеры и координаты образца внутри коробки.
  6. Для восстановления клеток выньте криовиальную и разморозьте содержимое при комнатной температуре. Перенесите содержимое в реакционную трубку объемом 2 мл.
  7. Дважды вымойте образец. Для1-й промывки центрифугу на 6000 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл среды f/2+ или BG-11. Для2-й промывки рестрифугируют при 6000 × г в течение 5 мин, удаляют надосадочное вещество и суспендируют гранулу в 2 мл среды f/2+ или BG-11.
  8. Чтобы проверить целостность этих клеток, готовых к культивированию, перекладывают гранулы в 9 мл среды и культивируют их в белом свете (50 мкмоль м-2 с-1) при перемешивании (55 об/мин). Сравните OD 750 нм культуры в первый день и через 1 неделю.

5. Подвижность лакуны Phormidium

ПРИМЕЧАНИЕ: Будут описаны три различных анализа. Во всех случаях используется один и тот же язык и региональные параметры.

  1. Культивируют P. lacuna в среде f/2 при горизонтальном перемешивании (50 об/мин) в белом свете (50 мкмоль m-2 s-1) в течение ~5 дней, пока расчетный OD 750 нм не составит 0,35. Храните образец при температуре 4 °C до использования.
  2. Гомогенизировать нити накаливания (см. Таблицу материалов) при 10 000 об/мин в течение 3 мин или ультразвуком (см. Таблицу материалов) в течение 1 мин при максимальной мощности и цикле 1. Измерение OD 750 нм. Если выше 0,35, разбавьте фракцию средой f/2. Используйте это решение в анализах подвижности на шагах 5.3, 5.4 и 5.5.
  3. Анализ на движение в жидкой среде
    1. Для непосредственного наблюдения за подвижностью переложите 8 мл среды, содержащей P. lacuna (со стадии 5.2), в чашку Петри 6 см. Подождите несколько минут, пока образец не достигнет комнатной температуры. Накройте чашку Петри целлофановой фольгой.
    2. Поместите слайд микроскопа на стол x-y стандартного микроскопа с камерой. Включите свет микроскопа. В идеале всегда используйте одни и те же электрические и оптические настройки для освещения. Переместите 4-кратный или 10-кратный объектив на траекторию света.
    3. Поместите чашку Петри на горку. Отрегулируйте одиночные нити или пучки нитей по движениям x, y и z стола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за трехмерного расположения только часть соответствующего раздела может быть в фокусе. Целлофановая фольга позволяет регулировать фокус без ограничений.
    4. Наблюдайте за движениями одиночных нитей или пучков. Убедитесь, что объектив не касается жидкости. Записывайте движения нитей с помощью стандартной камеры микроскопа (см. Дополнительное видео S1).
  4. Анализ на движение по поверхности
    1. Для наблюдения подвижности нитей на поверхностях агара готовят чашки Петри 6 см с f/2 бакто-агаром. Убедитесь, что агар достаточно высок, чтобы объектив приблизился к поверхности агара. В качестве альтернативы, подготовьте слой агара толщиной ~ 3 мм и запишите нити через агар (держите пластину вверх ногами или используйте перевернутый микроскоп).
    2. Пипетка 0,5 мл раствора, содержащего P. lacuna (из стадии 5.2) на бактоагаровую поверхность чашки Петри размером 6 см. Позвольте жидкости проникнуть на поверхность. Закройте чашку Петри и наблюдайте за движением нитей на поверхности с помощью объектива 4x или 10x.
    3. Убедитесь, что одни и те же электрические и оптические настройки микроскопа используются на протяжении всей записи и в последующих записях.
    4. Снимайте покадровые записи с помощью глазной камеры и миникомпьютерной системы. Убедитесь, что временной интервал между последующими изображениями составляет 5 с-1 мин. Запрограммируйте Linux-скрипт миникомпьютера для управления покадровой записью. См. Дополнительный файл 2 для примера сценария и Дополнительное видео S2 в качестве примера.
  5. Анализ на фототаксис
    1. Для экспериментов с фототаксисом подготовьте светодиодные (LED) держатели (здесь, с помощью 3D-принтера), в которые смонтированы выбранные 5 мм светодиоды для облучения площади 20мм2 снизу вверх (рисунок 3). При необходимости используйте несколько светодиодных держателей параллельно, подключая каждый светодиод электрически через резистор и потенциометр к регулируемому источнику питания. Измерьте и отрегулируйте интенсивность светодиодов в зависимости от эксперимента. Убедитесь, что вся обстановка находится в темной комнате или закрытом темном контейнере.
    2. Поместите 8 мл среды, содержащей P. lacuna (из стадии 5.2), в чашку Петри 6 см. Отрегулируйте интенсивность света светодиода. Закройте чашку Петри крышкой и поместите ее на светодиодный держатель так, чтобы светодиод находился в центре чашки Петри.
    3. По истечении желаемой продолжительности (обычно 2 дня) сделайте снимок чашки Петри с помощью камеры смартфона, направленной непосредственно на положение световой обработки. Используйте белую светодиодную панель для облучения образца. Используйте ручные настройки камеры; избегать отражений света; всегда корректируйте, чтобы получить одинаковое расстояние между объективом камеры и образцом. Убедитесь, что настройки экспозиции дают изображение, пригодное для последующего анализа с помощью ImageJ.
    4. Количественно оцените диаметр центрального круга нитей с помощью программного обеспечения ImageJ.
      1. Откройте ImageJ, нажмите на файл | Откройте, выберите нужный файл и нажмите кнопку Ввод.
      2. Нажмите кнопку Прямая (с прямой линией). Нажмите левую кнопку мыши, чтобы провести линию от одного конца чашки Петри до противоположного конца. Убедитесь, что линия проходит через центр круга нитей.
      3. Нажмите Ctrl+K на клавиатуре или нажмите кнопку Анализировать | Профиль печати в меню ImageJ. Найдите окно x-y с интенсивностью пикселей по сравнению с расстоянием - 1D-профиль чашки Петри. Убедитесь, что самая низкая интенсивность пикселей немного выше 0, а самое высокое значение ниже 255.
      4. Оцените среднее значение интенсивности пикселей за пределами круга и другое среднее значение интенсивности пикселей в круге. В положении y между этими значениями оцените значения x обеих сторон круга, наведя указатель мыши на эти позиции. Запишите оба значения и рассчитайте разницу.
      5. Получите наибольшее значение x, наведя указатель мыши на ось Y справа. Обратите внимание, что это значение e представляет диаметр чашки Петри. Если этот диаметр составляет 5 см, рассчитайте диаметр центрального круга нити накала как d/e × 5 см.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя вышеупомянутым методам, 5 различных штаммов P. lacuna были выделены из скальных бассейнов и секвенированы (рисунок 1 и таблица 1). Все культуры были стерильными после ~ 1 года субкультуры, за исключением P. lacuna HE10JO. Этот штамм все еще загрязнен Marivirga atl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя многие штаммы цианобактерий доступны из коллекций культур 32,33,34,35,36, все еще существует спрос на новые цианобактерии из дикой природы, потому что эти виды адаптированы к конкретным свойствам.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Работа была поддержана Технологическим институтом Карлсруэ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Freshwater SolutionSigma AldrichC3061
BG-11 mediumMerck73816-250ML
Boric acidMerck10043-35-3H3BO3
Calcium chloride dihydrateCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mLGreiner658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mLGreiner601975
Centrifuge LYNX 4000Thermo Scientific75006580and rotor
Centrifuge microstar 17VWR InternationalN/Afor up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrateMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrateMerck7758-99-8 CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinCarl Roth58-85-5 C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA ladder 100 bpNew England BiolabsN3231
Electrical pipetting help accujet-pro SBrand GmbH26360for pipetting 1-25 mL
EthanolVWR64-17-5C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrateCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTomeZeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Gel documation System Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, different
GlycerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrateMerck10025-77-1 FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamycin sulphateCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylightOSRAMcultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 WBloom StarN/Acultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrateCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrateServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDfor time-lapse recording
Ocular camera EC3Leicafor continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HDBresserfor time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µLGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µLGilsonSKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterileGreiner607107
Plastic tube, sterile, 15 mLGreiner188271
Plastic tube, sterile, 50 mLGreiner227261
Potassium bromideCarl Roth7758-02-3KBr
Potassium chlorideCarl Roth7447-40-7KCl
Power supply Statron 3252-1Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsfor LED
Proteinase KPromegaMC500Cfrom Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymeraseNew England BiolabsM0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentsfor cultivation
Sodium acetateCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Sodium chlorideCarl Roth7647-14-5NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Sodium fluorideCarl Roth7681-49-4NaF
Sodium hydrogen carbonateCarl Roth144-55-8NaHCO3
Sodium molybdate dihydrateServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrateMerck7631-99-4NaNO3
Sodium sulphateCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontium chloride hexahydrateCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochlorideMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentshomogenizer
UreaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamin B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatmentVEOLIA water technologiesELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrateSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assemblyhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinemakes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJsoftware for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation serverhttps://rast.nmpdr.orginput: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid mediumartificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid mediumf/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

Ссылки

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515(2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440(2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454(2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены