Обнаружение и захват инвазивных клеточных субпопуляций из кокультур в режиме реального времени

Резюме

Описан подход к обнаружению и захвату инвазивных клеточных субпопуляций в режиме реального времени. Экспериментальный проект использует клеточный анализ в реальном времени путем мониторинга изменений электрического импеданса клеток. Инвазивные раковые, иммунные, эндотелиальные или стромальные клетки в сложных тканях могут быть захвачены, и влияние кокультур может быть оценено.

Аннотация

Инвазия и метастатическое распространение раковых клеток являются основной причиной смерти от рака. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала популяций раковых клеток, обычно генерируют одно измерение конечной точки, которое не различает субпопуляции раковых клеток с различным инвазивным потенциалом. Кроме того, микроокружение опухоли состоит из различных резидентных стромальных и иммунных клеток, которые изменяют и участвуют в инвазивном поведении раковых клеток. Инвазия в ткани также играет роль в субпопуляциях иммунных клеток, отбивающихся от микроорганизмов или устраняющих больные клетки из паренхимы и эндотелиальных клеток во время ремоделирования тканей и ангиогенеза. Клеточный анализ в реальном времени (RTCA), который использует импедансные биосенсоры для мониторинга клеточной инвазии, был важным шагом вперед после измерения инвазии в конечной точке: это обеспечивает непрерывные измерения с течением времени и, таким образом, может выявить различия в скорости инвазии, которые теряются в анализе конечной точки. Используя современную технологию RTCA, мы расширили двухкамерные массивы, добавив дополнительную камеру, которая может содержать стромальные и / или иммунные клетки и позволяет измерять скорость инвазии под воздействием секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток с течением времени. Помимо этого, уникальная конструкция позволяет в любое время отсоединять камеры и выделять наиболее инвазивные раковые клетки или другие клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных смесях тестируемых изолятов опухолей. Эти наиболее инвазивные раковые клетки и другие клеточные субпопуляции приводят к злокачественному прогрессированию до метастатического заболевания, и их молекулярные характеристики важны для углубленных механистических исследований, разработки диагностических зондов для их обнаружения и оценки уязвимостей. Таким образом, включение низкомолекулярных или крупномолекулярных препаратов может быть использовано для проверки потенциала методов лечения, нацеленных на рак и/или субпопуляции стромальных клеток, с целью ингибирования (например, раковых клеток) или усиления (например, иммунных клеток) инвазивного поведения.

Введение

Клеточная инвазия является важным процессом, который позволяет клеткам пересекать барьеры базальной мембраны в ответ на сигналы окружающей среды, предоставляемые стромальными клетками. Это важный шаг на нескольких этапах развития иммунных реакций, заживления ран, восстановления тканей и злокачественных новообразований, которые могут прогрессировать от локальных поражений до инвазивного и метастатического рака¹. Анализы, разработанные на ранней стадии для измерения инвазивного потенциала клеточных популяций, обычно генерируют измерение одной конечной точки или требуют предварительной маркировки инвазивных клеток². Интеграция методов микроэлектроники и микрофлюидики в настоящее время разрабатывается для обнаружения различных аспектов клеточной биологии, таких как жизнеспособность, движение и прикрепление, с использованием электрического импеданса живых клеток на микроэлектродах ^3,4. Измерение импеданса позволяет проводить безметочную, неинвазивную и количественную оценку состояния клеток³. Здесь мы описываем трехкамерный массив, основанный на конструкции системы анализа клеток реального времени (RTCA), которая была разработана Abassi et ^al.5. Трехкамерный массив позволяет оценивать совместно культивируемые клетки при клеточной инвазии и восстановлении инвазивных клеток для дополнительного анализа или расширения.

В системе клеточного анализатора клетки проникают через внеклеточный матрикс, покрытый пористой мембраной, и достигают междигитированного электродного массива, расположенного на противоположной стороне барьера. Поскольку инвазивные клетки продолжают присоединяться и занимать этот электродный массив с течением времени, электрическое сопротивление изменяется параллельно. Нынешняя система содержит инвазию и миграцию ячеек (CIM) из 16-луночной пластины с двумя камерами. Прибор RTCA-DP (двойного назначения) (далее называемый анализатором ячеек двойного назначения) содержит датчики для измерения импеданса и интегрированное программное обеспечение для анализа и обработки данных об импедансе. Значения импеданса на исходном уровне зависят от ионной прочности среды в скважинах и изменяются по мере присоединения ячеек к электродам. Изменения импеданса зависят от количества ячеек, их морфологии и степени, в которой ячейки прикрепляются к электродам. Измерение скважин средой до добавления ячеек рассматривается как фоновый сигнал. Фон вычитается из измерений импеданса после достижения равновесия с прикреплением и распространением ячеек на электроды. Безудельный параметр состояния ячеек на электроде, называемый Cell Index (CI), рассчитывается следующим образом: CI = (импеданс после равновесия - импеданс при отсутствии ячеек) / номинальное значение импеданса⁶. При сравнении скоростей миграции различных клеточных линий Delta CI можно использовать для сравнения состояния клеток независимо от разницы в прикреплении, представленной в первых нескольких измерениях.

Недавно разработанный трехкамерный массив основан на существующей конструкции и использует верхнюю камеру от системы анализатора ячеек двойного назначения, которая содержит электроды. Модифицированные средняя и нижняя камеры адаптированы для установки сборки в анализатор ячеек двойного назначения для измерения и анализа импеданса с использованием интегрированного программного обеспечения. Двумя основными достижениями, которые новая конструкция обеспечивает по сравнению с существующей двухкамерной CIM-пластиной (впредь называемой пластиной клеточного анализатора), являются: i) способность восстанавливаться, а затем анализировать инвазивные клеточные субпопуляции, которые присутствуют в гетерогенных клеточных смесях, и ii) возможность оценки влияния секретируемых факторов из совместно культивируемых стромальных или иммунных клеток на инвазию клеток (рисунок 1).

Эта технология может быть полезна при изучении субпопуляций клеток с различной инвазивной способностью. Это включает в себя (a) инвазивные раковые клетки, которые вторгаются в окружающие ткани или кровеносные и лимфатические сосуды или экстравазируются в местах метастатического посева в отдаленных органах, (b) клетки иммунной системы, которые вторгаются в ткани для борьбы с патогенами или больными клетками, (c) эндотелиальные клетки, которые вторгаются в ткани с образованием новых кровеносных сосудов во время реорганизации тканей или заживления ран, а также (d) стромальные клетки из микроокружения опухоли, которые поддерживают и вторгаются вместе с раковыми клетками. Этот подход позволяет включить стромальные перекрестные помехи, которые могут модулировать подвижность и инвазию клеток. Технико-экономические обоснования, показанные здесь, используют этот модифицированный массив, ориентированный на инвазию раковых клеток и взаимодействие со стромой в качестве модельной системы, включая эндотелиальную инвазию в ответ на дифференциальные сигналы от раковых клеток. Этот подход может быть экстраполирован для выделения раковых клеток и других типов клеток, таких как субпопуляции иммунных клеток, фибробластов или эндотелиальных клеток. Мы протестировали инвазивные и неинвазивные установленные клеточные линии рака молочной железы в качестве доказательства принципа. Мы также использовали клетки из инвазии ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, в ответ на иммунные клетки из костного мозга человека, чтобы показать возможность будущего использования также в клинических диагностических условиях. PDX - это опухолевые ткани пациента, которые имплантируются в модель мышей с ослабленным иммунитетом или гуманизированным иммунитетом, чтобы обеспечить изучение роста, прогрессирования и вариантов лечения для исходного пациента ^7,8.

протокол

Исследование было рассмотрено и рассмотрено как «освобожденное» Советом по институциональному обзору Джорджтаунского университета (IRB # 2002-022). Свежесобранные ткани костного мозга были собраны из выброшенных здоровых фильтров сбора костного мозга человека, которые были деидентифицированы.

1. Новая конструкция камеры (рисунок 2)

1. Откройте новую двухкамерную пластину клеточного анализатора. Отложите верхнюю камеру с электродами.
2. С помощью фрезерного станка сбривайте 2 мм U-образных донных скважин пластины клеточного анализатора.
3. Прикрепите мембрану из полиэфирсульфона (PES) размером 2 см х 7 см с размером пор 0,2 мкм к нижней части бритых колодцев с помощью УФ-кураторского клея. Подождите 30 минут времени курирования, чтобы убедиться, что клей полностью отверждается и инертен.
4. С помощью фрезерного станка вырежьте две продольные щели (1,5 мм х 5,6 мм) по бокам, чтобы защелкнуться в гребнях вновь изготовленной третьей камеры.
5. Используя фрезерный станок, создайте третью поликарбонатную камеру, которая воспроизводит габаритные размеры пластины анализатора ячеек; 72 мм x 18 мм (Таблица материалов).
6. Создание скважин глубиной 4,8 мм и диаметром 4,75 мм для воспроизведения 16-луночной конструкции пластины клеточного анализатора. Это позволяет получить 90 мкл объема на скважину.
7. По бокам создайте два треугольных гребня, чтобы камера запиралась в исходные щели, созданные на шаге 1.4. Горизонтальная часть треугольника – 1,5 мм, вертикальная – 1,4 мм, гипотенуза – 2,052 мм.
8. Создайте ручку на короткой стороне диаметром 50,8 мм и высотой 1,397 мм, чтобы вписаться в выемку оригинальной пластины (рисунок 2, середина).
9. Используйте резиновую шайбу толщиной 0,9 мм для каждой скважины, чтобы обеспечить герметичную посадку.

2. Клеточная культура (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-фибробласты)

1. Промывайте адгезивные клеточные культуры (~70% слияния) 1x фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS).
2. Добавьте 0,05% раствор трипсина-ЭДТА для снятия клеток.
3. Нейтрализуют раствор трипсина клеточными культуральными средами, содержащими сыворотку, и подсчитывают клетки с помощью аликвоты клеточной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные среды клеточных культур можно найти в таблице 1.

3. Диссоциация ксенотрансплантата, полученная от пациента

1. Свежий кусочек опухоли (1^см2) нарезать мелкой кашицей стерильным скальпелем.
2. Поместите в коническую трубку объемом 50 мл с 20 мл среды DMEM F12 с добавлением 3 мг/мл трипсина и 2 мг/мл коллагеназы.
3. Инкубировать в термошейкере (150 об/мин) при 37 °C в течение 20 мин.
4. Раскрутите тюбик при 500 х г в течение 5 мин; удалить супернатант.
5. Добавьте 20 мкл DMEM F12 + 2% FBS для промывки клеток; открутить при 300 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Повторите стирку еще два раза.
6. Повторное суспендирование в 1 мл среды PDX (таблица 1) для подсчета клеток.

4. Извлечение клеток костного мозга

1. Промывайте фильтр для сбора костного мозга (BM) 25 мл 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании PBS был добавлен к использованному фильтру сбора БМ из больницы для сбора оставшегося БМ в фильтре.
2. Медленно добавьте промытый BM в коническую трубку объемом 50 мл с 25 мл градиентной среды плотности, заботясь о том, чтобы слои были как можно более отдельными.
3. Отжим при 800 х г в течение 20 мин при 18 °C
4. Скачайте верхние слои после центрифугирования (жир/плазма) и перенесите 5 мл белого слоя над средой градиента плотности, которая имеет BM-клетки, в коническую трубку объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, окуните пипетку объемом 5 мл в верхний слой до тех пор, пока она не коснется среднего слоя (BM), и выйдите из среднего слоя очень медленно, не перемещая пипетку.
5. Заполните коническую трубку объемом 15 мл 1x PBS (~10 мл) и вращайте при 300 x g в течение 15 мин.
6. Удалить супернатант; оставшаяся белая гранула - это BM.
7. Если в грануле наблюдаются эритроциты, добавляют 5 мл раствора для лизиса эритроцитов (Таблица материалов) и дают ему постоять в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Открутите при 300 х г в течение 5 мин и удалите супернатант.
8. Добавьте 10 мл 1x PBS для промывки клеток, вращайте при 300 x g в течение 5 минут и удалите супернатант. Повторяют лизис эритроцитов (этап 4.7) до тех пор, пока гранула не станет белой.

5. Посев и сборка клеток

1. Поместите все три стерильные камеры в вытяжку для культивирования тканей.
2. Найдите ручку на короткой стороне нижней камеры. Ориентируйте нижнюю камеру так, чтобы ручка была обращена к экспериментатору.
3. Добавьте 30 000-50 000 клеток в 90 мкл среды в каждую лунку нижней камеры. Избегайте образования пузырьков. Это стромальные клетки, которые будут обеспечивать секретируемые факторы, но не будут обнаружены электродами верхней камеры.
4. Используйте 5% фетальных бычьих сывороточных сред в двух лунках нижней камеры в качестве положительного контроля подвижности клеток. Используйте 0% сывороточных сред в качестве отрицательного контроля.
5. Дайте нижней камере с ячейками посидеть 10-15 мин в капюшоне, чтобы осесть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг рекомендуется, если клетки адгезивные или растут в суспензии.
6. Поверните нижнюю камеру на 90° и поместите среднюю камеру сверху так, чтобы ручка на нижней камере скользила в выемку на средней камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ручка на нижней камере и синяя точка на средней камере находятся на противоположных концах сборки.
7. Нажимайте вертикально вниз до тех пор, пока с каждой из длинных сторон сборки не раздастся звук щелчка.
8. Добавьте 160 мкл свободной от сыворотки среды во все лунки средней камеры.
9. Убедитесь, что куполообразный мениск виден после заполнения колодцев; в противном случае отрегулируйте конечный объем на основе калибровки пипетки. Избегайте образования пузырьков.
10. Поместите верхнюю камеру с электродами вниз на среднюю камеру, убедившись, что синие точки выровнены на средней и верхней камерах.
11. Нажимайте вертикально вниз до тех пор, пока с каждой из длинных сторон сборки не раздастся звук щелчка.
12. Добавьте 25-50 мкл свободных от сыворотки сред в верхнюю камеру.
13. Установите сборку на анализатор клеток двойного назначения в инкубаторе культуры тканей и подождите 30 минут, прежде чем измерять фон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время необходимо для выравнивания массива и может быть использовано для подготовки клеточных линий, которые будут добавлены в верхнюю камеру.
14. Измерьте фон (см. раздел 6) и поместите сборку обратно в вытяжку культуры тканей.
15. Добавьте 30 000-50 000 клеток в 100 мкл свободной от сыворотки среды в каждую лунку верхней камеры. Это клетки, которые электрод обнаружит, как только они успешно мигрируют через мембрану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения максимального ответа рекомендуется выращивать клетки в бессывороточных или низких сывороточных средах в течение 6-18 ч перед выполнением анализа.
16. Дайте сборке постоять в капоте в течение 30 минут перед установкой на анализатор ячеек двойного назначения для измерения импеданса.

6. Измерение фона и импеданса

1. Поместите массив в подставку в приборе анализатора ячеек двойного назначения.
2. Откройте программное обеспечение анализатора ячеек и выберите подставку для использования.
3. Нажмите на вкладку «Сообщение» и убедитесь, что на ней написано «Соединения ОК», чтобы убедиться, что массив хорошо расположен в подставке, а электроды хорошо выровнены с датчиками.
4. Перейдите на вкладку Заметки об эксперименте и заполните как можно больше информации об эксперименте.
5. Перейдите на вкладку Макет и заполните описание макета массива.
6. Перейдите на вкладку Расписание и добавьте два шага из меню Шаги ; фоновая ступень (одна развертка) и тестовая ступень со 100 развертками - развертка каждые 15 мин, в общей сложности 25 ч.
7. После того, как массив находился в инкубаторе клеточного анализатора двойного назначения в течение 30 минут, нажмите кнопку Play , чтобы начать фоновое измерение. Появится окно с просьбой выбрать папку для сохранения данных.
8. После того, как фоновое измерение будет сделано, извлеките массив из колыбели и поместите его обратно в вытяжку для культивирования клеток.
9. Добавьте клетки в верхнюю камеру, как описано на этапе 5.13, и держите сборку в вытяжке культуры тканей в течение 30 минут, чтобы клетки осели.
10. Поместите массив обратно в анализатор ячеек двойного назначения и проверьте вкладку Сообщение для сообщения Connections OK .
11. Нажмите кнопку Play , чтобы начать измерение импеданса.
12. Нажмите на вкладку График , чтобы отслеживать ход действия сигнала.
13. Если конечная точка достигнута до 25 часов, щелкните шаг Прерывание в раскрывающемся меню Выполнить .
14. Чтобы экспортировать данные, щелкните диаграмму правой кнопкой мыши, выберите команду Копировать в формате списка, а затем вставьте данные в электронную таблицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть экспортированы как индекс ячейки или индекс дельта-ячейки. Информация о графике и/или макете также может быть выбрана для экспорта.

7. Отряд и клеточный сбор

1. Мониторинг скорости миграции в режиме реального времени на анализаторе ячеек двойного назначения для определения интересующей точки остановки (6-18 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точка остановки зависит от скорости инвазии клетки и от того, когда достигается отчетливый сигнал инвазии от отрицательного контроля.
2. После этого отсоедините сборку от анализатора клеток двойного назначения и поместите ее в вытяжку для культивирования тканей.
3. Подготовьте соответствующее количество микроцентрифужных трубок объемом 1,5 мл для сбора клеток из интересующих лунок.
4. Поместите узел в тарелку размером 10 см, чтобы в ней содержались жидкости, когда камеры отсоединятся.
5. Нажмите гибкие защелкивающиеся концы на длинную сторону средней камеры внутрь, пока не раздастся звук щелчка.
6. Демонтируйте верхнюю камеру и переверните ее в новую 10-сантиметровую посуду.
7. Используйте клеточный лифтер с 13-миллиметровым лезвием для сбора клеток из всех скважин, имеющих одинаковое экспериментальное состояние (например, тип клеток, медикаментозное лечение и т. Д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спроектируйте установку таким образом, чтобы она имела по крайней мере две скважины для каждого экспериментального условия для достижения статистически значимых изменений по сравнению с отрицательными контрольными значениями.
8. Промыть или окунуть лезвие в 1x фосфатный буферизованный физиологический раствор, чтобы собрать клетки в микроцентрифужных трубках объемом 1,5 мл.
9. Раскрутите ячейки при 500 х г в течение 5 мин.
10. Распространяйте собранные клетки (см. раздел 8) или выполняйте анализ конечных точек, такой как одноклеточный РНК-seq.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемной РНК-seq используйте набор для экстракции РНК с низким числом клеток.

8.3D размножение и извлечение клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого количества собранных клеток, засейте клетки в 3D с использованием внеклеточного матрикса (ECM) для повышения жизнеспособности. Тем не менее, 2D-культура также является вариантом на этом этапе, особенно если используемые клетки из установленных клеточных линий.

1. Разморозить аликвоту матрицы базальной мембраны при 4 °C в течение ночи. Держите матрицу базальной мембраны на льду до готовности к использованию.
2. Добавьте 25 мкл холодной базальной мембранной матрицы к грануле собранных живых клеток и осторожно пипетку вверх и вниз для смешивания. Избегайте образования пузырьков.
3. Добавьте матричную смесь клеточно-базальной мембраны на дно небольшого колодца тканевой культуры (т.е. в 96-луночную пластину), образуя купол. Старайтесь не трогать стенки колодца. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин перед аккуратным добавлением 100 мкл среды по каплям.
4. Чтобы извлечь клетки, аспирируйте среду и добавьте 100 мкл диспазы в каждую лунку.
5. Инкубируйте в RT в течение 10 минут, периодически пипетируя вверх и вниз.
6. Перенесите клетки и растворенную матрицу базальной мембраны в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл 1x PBS, вращайте при 300 x g в течение 5 минут и удалите супернатант. Повторите стирку один раз.
7. Аспирировать супернатанта. Разделите ячейки в грануле или выполните анализ конечных точек.

Результаты

Используя недавно разработанный трехкамерный массив, инвазия клеток была проверена в присутствии или отсутствии стромальных клеток, таких как фибробласты. Клеточная инвазия MDA-MB-231 усиливалась, когда облученные швейцарские фибробласты 3T3 (штамм J2) были посеяны в нижнюю камеру, что позв?...

Обсуждение

Мы модифицировали конструкцию двухкамерного массива, включив в него третью камеру для мониторинга инвазии клеток в режиме реального времени в присутствии стромальных клеток. Мы наблюдали различные эффекты совместно культивируемых фибробластов на инвазивные и неинвазивные раковые к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799